Способ определения и обнаружения в моче антиретровирусных лекарственных средств в комбинированных сочетаниях Российский патент 2018 года по МПК G01N1/28 G01N30/90 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины и может быть использовано в химико-токсикологических и контрольно-аналитических лабораториях для разделения, идентификации и анализа абакавира, ламивудина, зидовудина и ставудина в комбинированных сочетаниях.

Широкое применение в медицинской практике находят антиретровирусные лекарственные средства из класса нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы. Среди них ведущее положение занимают абакавир, ламивудин, зидовудин, ставудин, которые нашли применение при лечении заболеваний, вызываемых вирусами иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2). Длительное применение антиретровирусных лекарственных средств, наличие большого числа нежелательных реакций, а также сочетание их с другими лекарственными средствами может привести к острому отравлению или смерти. Наиболее часто всречаются случаи отравления абакавиром, ламивудином, зидовудином и ставудином в сочетании с психотропными, обезболивающими, седативными лекарственными средствами амитриптилином, респиридоном, азалептином, галоперидолом, неулептилом, милипрамином, хлорпртексеном, флуоксетином, ибупрофеном, фенобарбиталом.

Одной из актуальных проблем химико-токсикологического и фармацевтического анализа является разработка новых и усовершенствование существующих способов идентификации комбинированных сочетаний лекарственных средств. Для химико-токсикологического и аналитического контроля целесообразно использовать простые, но надежные и производительные экспрессные методики анализа.

Среди современных методов химико-токсикологического и фармацевтического анализа важное место занимает хроматография в тонком слое сорбента, которая широко применяется как для целей разделения, так и для идентификации лекарственных средств в комбинированных сочетаниях.

Известен способ идентификации абакавира, который заключается в приготовлении водного раствора испытуемого вещества с последующим хроматографированием на пластинках для ВЭТСХ, покрытых слоем силикагеля 60F₂₅₄ фирмы Merck в системе растворителей ацетон-метанол-аммония гидроксид-хлороформ (55:5:6:34) и идентификацией УФ-светом (НД 42-10406-05 «Таблетки абакавира, покрытые оболчкой, 300 мг»).

Наиболее близким является способ определения циннаризина в комбинированных сочетаниях с психотропными лекарственными средствами путем приготовления растворов испытуемых веществ с последующим хроматографированием на хроматографических пластинках «Армсорб» в системе растворителей н-гептан-этанол 95%-25% раствор аммиакака (6:2:2) и идентификацией в УФ-свете при длине волны 254 нм и реактивом Драгендорфа (Чмелевская Н.В., Илларионова Е.А., Цыренов Б.М. Разработка методик обнаружения циннаризина в комбинированных сочетаниях с психотропными лекарственными средствами // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. трудов. - Пятигорск, 2012. - Вып. 67. - С. 290-291). В этой работе предложен способ хроматографирования в тонком слое сорбента для разделения и идентификации циннаризина в сочетании с амитриптилином, аминазином, азалептином, галоперидолом, трифтазином и неулептином, который оказался неселективным для определения абакавира, ламивудина, зидовудина и ставудина в сочетании с психотропными, обезболивающими, седативными лекарственными средствами амитриптилином, респиридоном, азалептином, галоперидолом, неулептилом, милипрамином, хлорпртексеном, флуоксетином, ибупрофеном, фенобарбиталом. Предложенные автором условия хроматографирования не позволяют разделить исследуемые комбинированные сочетания антиретровирусных лекарственных средств после изолирования их из мочи.

В предлагаемом способе авторы используют в качестве растворителя для изолирования испытуемых растворов из мочи - хлороформ и насыщенный раствор аммония сульфата при рН 8, чувствительность определения в 2,5 раз выше, чем в прототипе, показана возможность хроматографирования на пластинках «Сорбфил» в системе растворителей этилацетат-дихлорметан-25% раствор аммиака в соотношении 17:4:1 и идентификацией в УФ-свете при длине волны 254 нм.

Использование в качестве растворителя хлороформа и насыщенного раствора аммония сульфата при рН 8,0 и системы растворителей этилацетат-дихлорметан-25% раствор аммиака (17:4:1) позволяет четко разделить пятна определяемых веществ, что повышает селективность, объективность и чувствительность анализа, которая составила 0,02 мкг/мл.

Технический результат достигается путем изолирования из мочи определяемых веществ и приготовления растворов стандартных образцов сравнения с последующим их хроматографированием и обнаружением УФ-светом.

Новым в достижении технического результата является то, что изолирование испытуемых веществ из мочи осуществляют хлороформом и насыщенным раствором аммония сульфата при рН 8,0.

Новым является также то, что в качестве подвижной фазы используют систему растворителей этилацетат-дихлорметан-25% раствор аммиака в соотношении 17:4:1.

Исследуемые лекарственные вещества характеризуются наличием в молекулах различных функциональных групп и поэтому отличаются физико-химическими свойствами. Исходя из этого, оптимальным методом их разделения следует считать метод хроматографии в тонком слое сорбента, который характеризуется экспрессностью, селективностью, высокой чувствительностью, несложным аппаратурным оснащением, простотой выполнения.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) является наиболее распространенным методом анализа лекарственных, наркотических веществ и их метаболитов в биологических объектах и на этапе скрининга служит преобладающим источником информации. Данный метод применяется в общем и частном скрининге.

Для выбора условий разделения исследуемых веществ методом ТСХ использовали пластины на основе силикагеля «Сорбфил», которые имеют высокую степень активности, стандартизированную толщину сорбента.

Детекцию пятен проводили путем просмотра пластин в УФ-свете при длине волны 254 нм.

Предварительно нами была определена хроматографическая подвижность исследуемых веществ в общих системах растворителей, наиболее часто применяемых для веществ основного характера в химико-токсикологическом анализе.

В качестве общих систем использовали:

I. Бензол-диоксан-25% раствор аммиака (12:7:1);

II. Этилацетат-хлороформ-25% раствор аммиака (17:2:1,5);

III. Хлороформ-этанол-25% раствор аммиака (30:30:1);

IV. Толуол-ацетон-25% раствор аммиака (50:50:1);

V. Этилацетат-ацетон-этанол-25% раствор аммиака (50:45:4:1);

VI. Этанол-25% раствор аммиака (49,25:0,75);

VII. Этилацетат-метанол-25% раствор аммиака (17:2:1).

Система этилацетат-хлороформ-25% раствор аммиака (17:2:1,5) является наиболее подходящей из выше перечисленных сочетаний для разделения исследуемых лекарственных веществ. Данная система может быть рекомендована в скрининге при проведении ненаправленного анализа. В остальных общих системах, разделение исследуемых веществ идет недостаточно четко, наблюдается размытие зон адсорбции, а также наличие «хвостов».

Для увеличения значения ΔR_f между зонами исследуемых веществ провели варьирование количеством частей подвижной фазы этилацетат-хлороформ-25% раствор аммиака (17:2:1,5) (базовая система).

Увеличение количества этилацетата в системе привело к росту подвижности таких лекарственных веществ как тофизопам, респиридон, мелипрамин, ставудин, подвижность тофизопама и фенобарбитала при этом практически не изменилась, а подвижность других лекарственных веществ уменьшилась. Таким образом, варьирование количеством этилацетата в системе не привело к существенному увеличению ΔR_f между зонами, а в некоторых случаях даже уменьшило разделяющую способность исследуемых соединений.

Изменение в системе количества хлороформа от двух до шести частей приводит к увеличению подвижности таких лекарственных веществ, как ламивудин, флуоксетин, к уменьшению подвижности тофизопама, спитомина, фенобарбитала, неулептила, милипрамина и практически не повлияло на поведение абакавира, зидовудина, ставудина, хлорпротексена, респиридона, азалептина и ибупрофена. В ходе дальнейших экспериментальных исследований провели замену хлороформа на дихлорметан. Определено, что лучшей разделяющей способностью обладает система, в которой дихлорметана 4 части.

Учитывая тот факт, что исследуемые нами лекарственные препараты обладают основными свойствами, в ходе дальнейших исследований провели варьирование количеством аммиака в системе. Изменение количества 25% раствора аммиака в системе по-разному сказывается на хроматографической подвижности исследуемых лекарственных веществ. Хроматографическая подвижность тофизопама, респиридона, ставудина, ибупрофена снижается при увеличении количества аммиака в системе, а азалептина, амитиптиллина, милипрамина, хлорпротексена, флуоксетина, фенобарбитала, азалептина, неулептина, наоборот, увеличивается. Лучшей разделяющей способностью обладает система, в которой количество аммиака составляет 1,0. В результате проведенных экспериментов найдена подвижная фаза этилацетат-дихлорметан-25% раствор аммиака (17:4:1), позволяющая разделить комбинированные сочетания абакавира, ламивудина, зидовудина, ставудина и психотропных, обезболивающих и седативных лекарственных веществ, наиболее часто применяемых при лечении ВИЧ-зависимых, и получить зоны веществ правильной формы.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что заявляемое техническое решение отличается тем, что в качестве растворителя для изолирования определяемых веществ используют хлороформ и насыщенный раствор аммония сульфата при рН 8.0, хроматографирование проводят в системе этилацетат-дихлорметан-25% раствор аммиака в соотношении 17:4:1, что соответствует критерию изобретения «новизна».

Новая совокупность признаков обеспечивает повышение селективности, объективности и чувствительности анализа, что соответствует критерию «промышленная применимость».

При анализе известных решений было выявлено, что в них отсутствуют сведения о влиянии отличительных признаков на достижение поставленного технического результата, следовательно, изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».

Способ осуществляют следующим образом. 10 мл мочи, содержащей смесь исследуемых веществ, переносят в делительную воронку, добавляют 25% раствор аммиака до рН 8,0, 10 мл насыщенного раствора аммония сульфата, 30 мл хлороформа и затем проводят экстракцию однократно в течение 3 минут. Хлороформные извлечения переносят в фарфоровую чашку и оставляют при комнатной температуре до удаления органического растворителя. Полученный сухой остаток растворяют в 2 мл хлороформа и перемешивают.

На линию старта пластинки «Сорбфил» размером 10×10 см микропипеткой наносят по 0,4 мл раствора смеси. Рядом наносят по 0,4 мл растворов стандартных образцов веществ-свидетелей (СОВС) в хлороформе, содержащихся в смеси. Пластинку сушат на воздухе в течение 5 минут, а затем помещают в хроматографическую камеру со смесью растворителей: этилацетат-дихлорметан-25% раствор аммиака (17:4:1) и хроматографируют восходящим методом. Когда фронт растворителя пройдет почти до конца пластинки, ее вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 20 минут и просматривают в УФ-свете при длине волны 254 нм.

Для приготовления растворов стандартных образцов веществ-свидетелей (СОВС) берут 0,2 мкг СОВС и растворяют в 10 мл хлороформа.

Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Готовят растворы извлечения из мочи и растворы веществ свидетелей, описанным выше способом. Хроматографируют испытуемые растворы, используя оптимальную систему растворителей. Далее обнаруживают зоны веществ на хроматограмме УФ-светом.

На хроматограмме обнаружены зоны веществ со следующими значениями R_f: абакавир 0,15±0,01; ламивудин 0,10±0,01; зидовудин 0,35±0,03; ставудин 0,20±0,02; респиридон 0,48±0,01; ибупрофен 0,05±0,02; фенобарбитал 0,31±0,01; амитриптилин 0,74±0,02; милипрамин 0,54±0,02; азалептин 0,44±0,02; хлорпротиксен 0,59±0,02; флуоксетин 0,39±0,02; спитомин 0,64±0,01; тофизопам 0,79±0,02; галоперидол 0,70±0,01; неулептил 0,26±0,01.

Данные примеры подтверждают, что предлагаемый способ может быть использован для химико-токсикологического и фармацевтического анализа абакавира, ламивудина, зидовудина и ставудина в комбинированных сочетаниях с психотропными, обезболивающими, седативными лекарственными средствами амитриптилином, респиридоном, азалептином, галоперидолом, неулептилом, милипрамином, хлорпртексеном, флуоксетином, ибупрофеном, фенобарбиталом.

Таким образом, предлагаемый способ определения и обнаружения абакавира, ламивудина, зидовудина и ставудина в комбинированных сочетаниях после извлечения их из мочи с использованием тонкослойной хроматографии позволяет повысить селективность, объективность и чувствительность анализа.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в химико-токсикологических и контрольно-аналитических лабораториях для разделения, идентификации и анализа лекарственных средств. Способ определения и обнаружения в моче абакавира, ламивудина, зидовудина и ставудина в комбинированных сочетаниях путем хроматографирования в тонком слое сорбента раствора определяемых веществ и стандартных образцов веществ-свидетелей отличается тем, что готовят испытуемый раствор путем изолирования определяемых веществ из мочи хлороформом и насыщенным раствором аммония сульфата при рН 8,0, проводят хроматографирование в тонком слое сорбента на пластинках «Сорбфил» в системе растворителей этилацетат-дихлорметан-25% раствор аммиака в соотношении 17:4:1 и обнаружение зон веществ на хроматограмме в УФ-свете. 1 пр.

Способ определения и обнаружения в моче абакавира, ламивудина, зидовудина и ставудина в комбинированных сочетаниях путем хроматографирования в тонком слое сорбента раствора определяемых веществ и стандартных образцов веществ-свидетелей, отличающийся тем, что готовят испытуемый раствор путем изолирования определяемых веществ из мочи хлороформом и насыщенным раствором аммония сульфата при рН 8,0, проводят хроматографирование в тонком слое сорбента на пластинках «Сорбфил» в системе растворителей этилацетат-дихлорметан-25% раствор аммиака в соотношении 17:4:1 и обнаружение зон веществ на хроматограмме в УФ-свете.