СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА, ОБЛАДАЮЩЕГО КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1997 года по МПК C12N9/48 C12N9/64 

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой, медико-фармакологической промышленности, касается способа получения препарата, обладающего коллагенолитической активностью из гепатопанкреаса камчатского краба Paralihodes camtschatica (комплекса трипсино и химотрипсино-подобных протеаз) и может быть использовано в меховой и кожевенной промышленности, ветеринарии и медицине.

Установлено, что коллагенолитическая протеза A (КП-A) из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtschatisa относится к сериновым протеазам, обладающим ярко выраженной коллагенолитической активностью и отличающихся от истинных коллагеназ в первую очередь строением активного центра.

Известен способ получения коллагеназы из гепатопанкреаса крабов, согласно которому выделение фермента проводят при смешивании гомогената гепатопанкреса крабов, полученного в результате автолитического гидролиза за счет эндопротеаз при температуре 0 30^oC в течение 2 8 ч, с раствором хитозана, pH 2,0 6,5 с его конечной концентрацией 0,01 0,4 мас. Полученный раствор после отделения нерастворимого материала подвергается ультрафильтрации на мембране, отсекающей примесные вещества с молекулярной массой 100 кДа и более, собирая проходящий через мембрану раствор, и на мембране, отсекающей вещества с молекулярной массой 30 кДа и ниже, собирая фермент, непроходящий через мембрану. Раствор, содержащий ферментативную активность, лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы 10800 11200 ед/мг белка. Липиды в препарате отсутствуют [1]
Способ, при его небольших затратах материалов, технологического времени и сырья, практически лишен недостатков, за исключением использования хитозана, который может инактивировать фермент.

Известен способ получения протеолитического комплекса, включающего коллагеназную активность из измельченных панкреассодержащих наземных или водных животных. Экстракцию комплекса осуществляют из гомогепата 1 мМ раствором хлористого кальция, содержащим 0,2% детергента в течение 12 ч. Осадок отделяют сепарированием и центрифугированием надосадочной жидкости для удаления липидной фракции. Очистку от мелкодисперсных частиц ведут микрофильтрацией на мембранах с диаметром пор 200 мкм, концентрирование полученного раствора осуществляют на половолоконных ультрафильтрах с мембранами, имеющими диаметр 15000 Да. Концентрированный раствор стерилизуют фильтрацией и сушат сублимацией.

Коллагенолитическая активность по кислоторастворимому коллагену 672 Е/мг [2]
Недостатком способа является использование высоких концентраций поверхностно-активных веществ, способных влиять на экологию.

Наиболее близким к предложенному по технологической сущности и достигаемому техническому результату является способ получения ферментного препарата, обладающего коллагенолитической активностью, предусматривающий выделение фермента из гепатопанкреаса промысловых крабов гомогенизацией ткани в буферном растворе с pH 6 9,5 содержащем неионный детергент в количестве 0,1 5% и 0,1 2,0 М раствор хлорида щелочного металла. После отделения осадка и слоя липидов раствор обрабатывают на комплексе мембранного оборудования (Миллипор) с использованием мембранных кассет с размером пор 0,45 мкн микрофильтрация и последующая ультрафильтрация через мембраны с лимитом пропускания 5000 Да. Концентрат лиофильно высушивают. Удельная протеолитическая активность препарата не ниже 10000 Е/мг белка. Удельная активность индивидуальных коллагеназ существенно меньше удельной активности суммарного препарата [3]
Недостатком способа также является использование высоких концентраций детергента и буферных растворов, продолжительность ультрафильтрации.

Задачей предлагаемого изобретения является усовершенствование способа получения ферментного препарата, обладающего коллагенолитической активностью, который мог бы быть реализован более простой технологией, а полученный комплексный ферментный препарат обладал высокой коллагенолитической активностью, протеолитической, эстеразной, пептидазной, эластазной, ДНКазной, липазной, амидазной и хитиназной активностью.

Полученный комплексный ферментный препарат назван Коллалитин. Удельная коллагенолитическая активность препарата, составляет не менее 500 3000 ед Мандл/мг (субстрат адоказеин, ¹⁴-C-коллаген 1 типа).

Коллалитин не содержит ионов тяжелых металлов, примесей, вредных и токсичных веществ.

Коллагеназа в коллалитине представлена тремя изоферментами с молекулярной массой в пределах от 18 до 27 кДа. Содержание белка в препарате не менее 97%
Препарат стабилен при температуре до 60^oC и в области pH 5,0 9,0. оптимум коллагенолитической активности при pH 7,9 и температуре 37^oC.

Коллалитин не обладает токсичным и аллергизирующим действием, не вызывает патологических изменений ультраструктуры кожи.

Указанная задача решается тем, что в способе получения ферментного препарата, обладающего коллагенолитической активностью, включающем выделение фермента из гепатопанкреаса камчатского краба экстракцией в присутствии раствора хлорида щелочного металла, отделение осадка и липидов, и очистку последовательной микрофильтрацией на мембранах с номинальным размером пор 0,45 мкн и ультрафильтрацией концентрата с последующей лиофильной сушкой, согласно изобретению выделение фермента экстракцией ведут непосредственно из замороженного гепатопанкреаса краба выдержкой в 0,1 1 М растворе хлорида щелочного металла в соотношении 1 2,1 2,3 при периодическом перемешивании в течении 14 16 ч, отделение осадка ведут последовательной фильтрацией через фильтры с размером пор 10,0 мм, 0,5 мм и 0,1 мм, обезжиривание проводят в процессе микрофильтрации.

Ультрафильтрационную очистку концентрата проводят на мембранных фильтрах с лимитом пропускания 10000 Да.

Технический результат предлагаемого изобретения в сравнении с существующими аналогами заключается в упрощении технологии получения целевого продукта, обладающего широкой субстратной специфичностью уникальным сочетанием коллагенолитической и общепротеолитической, эластазной, ДНКазной и липолитической, а также стабильностью коллагеназы при высокой температуре (60^oC).

Проведение согласно изобретению экстракции ферментного комплекса непосредственно из замороженного гепатопанкреаса краба, помещением его в 0,1 - 1 М раствор хлорида щелочного металла в соотношении 1 2,1 2,3 в течение 14 16 ч и температуре 19 21^oC, обеспечивает не только упрощение способа (не требует предварительного оттаивания и механической гомогенизации исходного сырья), но и достигает за указанное время эффекта гомогенизации, что ускоряет выход фермента и способствует полноте выхода.

Существенно, что проведение последовательной очистки от механических загрязнений через систему фильтров (стреннеров) позволяет удалить липидную фракцию на стадии микрофильтрации.

Пример.

50 Кг замороженного гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtschatica заливают 110 л 10% раствора хлорида натрия, выдерживают для разморозки и экстракции фермента 15 ч при периодическом перемешивании, поддерживая температуру смеси 20^oC.

Затем нерастворимые частицы отделяют последовательной фильтрацией через фильтры (стреннеры) с размером пор 10 мм, 0,5 мм и 0,1 мм. Продукт перекачивают в реакционный бак системы Ceraflo (Millipore) и подвергают микрофильтрации через мембраны с номинальным размером пор 0,45 мкн для удаления эмульгированного жира, клеточных обломков и микроорганизмов.

Продукт, прошедшей мембраны, направляется в реакционный бак системы для ультрафильтрации Prostak (Millipore). Ультрафильтрацию ведут через мембраны с лимитом пропускания 10000 Да.

Процесс концентрирования заканчивают из расчета 8 л концентрата, который собирают в полиэтиленовые емкости. Концентрат разливают в лотки из нержавеющей стали и высушивают лиофильно. Продолжительность процесса не превышает 57 ч.

Получают 400 г порошка ферментного препарата коллалитин.

Порошок желтовато-серого цвета, легко растворимый в дистиллированной воде или буферном растворе с легким специфическим запахом.

Коллагенолитическая активность составляет не менее 2000 ед Мандл/мг (сустрат ¹⁴-C-коллаген 1 типа).

Содержание белка в препарате составляет 97%

Использование: биотехнология, пищевая, медико-фармацевтическая промышленность, может быть использовано в меховой, кожевенной промышленности, ветеринарии и медицине. Сущность изобретения: способ предусматривает использование в качестве исходного сырья замороженный гепатопанкрес камчатского краба Paralithodes camtschatica, из которого выделяют экстракцией комплекс ферментов, помещением его в раствор 0,1 - 1,0 M хлорида щелочного металла. Смесь выдерживают в течение 14 - 16 ч, поддерживая температуру 19 - 21^oC, при соотношении сырья и хлорида щелочного металла. 1:2,2 - 2,3, периодически перемешивая. Осадок отделяют последовательной фильтрацией через фильтры с размером пор 10 мм, 0,5 мм и 0,1 мм. Отделение липидной фракции осуществляют микрофильтрацией на мембранах с размером пор 0,45 мкн, ультрафильтрацию проводят на мембранных фильтрах с лимитом пропускания 10000 Да. Полученный концентрат лиофильно высушивают. Удельная коллагенолитическая активность препарата, названного "Коллалитин", составляет не менее 500 - 3000 ед. Мандл/мг. Коллагеназа в коллалитине представлена тремя изоферментами с молекулярной массой в пределах от 18 до 27 кДа. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ получения ферментного препарата, обладающего коллагенолитической активностью, предусматривающий выделение фермента экстракцией из гепатопанкреаса краба в присутствии раствора хлорида щелочного металла, отделение осадка и липидов обезжириванием, очистку последовательной микрофильтрацией и ультрафильтрацией и лиофильную сушку концентрата, отличающийся тем, что выделение фермента экстракцией ведут непосредственно из замороженного гепатопанкреаса краба выдержкой в 0,1 1,0 М растворе хлорида щелочного металла в соотношении 1 2,2 2,3 при периодическом перемешивании в течение 14 16 ч, поддерживая температуру 19 21^oС, отделение осадка ведут последовательной фильтрацией через фильтры с размером пор 10 мм, 0,5 мм и 0,1 мм, обезжиривание проводят в процессе микрофильтрации. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ультрафильтрацию проводят на мембранных фильтрах с лимитом пропускания 10000 Дальтон.