СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА КОЛЛАГЕНАЗЫ Российский патент 2005 года по МПК C12N9/48 C12N9/64 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению высокоочищенных и высокоактивных ферментных препаратов, которые могут быть использованы в медицине, ветеринарии, биохимии и пищевой промышленности, а также для исследовательских целей.

Гепатопанкреас крабов, особенно камчатского краба, богат протеолитическими ферментами, в том числе и коллагеназами. Гепатопанкреас является доступным, дешевым и нетоксичным сырьем для получения ферментных препаратов.

Известен способ получения протеолитического комплекса, включающего коллагеназную активность, из измельченных панкреассодержащих наземных или водяных животных. Экстракцию комплекса осуществляют 1 мМ раствором хлористого кальция, содержащим 0,2% детергента в течение 12 ч. Осадок отделяют сепарированием и центрифугированием надосадочной жидкости для удаления липидной фракции. Очистку от мелкодисперсных частиц ведут микрофильтрацией на мембранах с диаметром пор 200 мкм, концентрирование полученного раствора осуществляют ультрафильтрацией на мембране с диаметром пор 15 кДа. Концентрированный раствор стерилизуют фильтрацией и сушат сублимацией. Коллагенолитическая активность по кислоторастворимому коллагену - 672 ед/мг (Патент РФ (RU) №2034028, C 12 N 9/64, 1995.04.30).

Недостатками способа является использование высоких концентраций поверхностно-активных веществ, которые несомненно снижают активность ферментов, а также отрицательно влияют на экологию, требуя разработки специальных способов утилизации отходов производства. Существенным недостатком является также отсутствие стадии обессоливания препарата и применение сублимационной сушки вместо лиофильной. В результате удельная активность полученного продукта соответствует активности технических препаратов.

Известен способ получения ферментного препарата, обладающего коллагенолитической активностью, предусматривающий выделение фермента из гепатопанкреаса промысловых крабов гомогенизацией тканей в буферном растворе с рН 6-9,5, содержащем неионный детергент в количестве 0,1-5% и 0,1-2,0 М раствор хлорида щелочного металла. После отделения осадка и слоя липидов раствор очищают микрофильтрацией на мембранах с диаметром пор 0,45 мкм, концентрирование полученного раствора осуществляют ультрафильтрацией на мембране с диаметром пор 5 кДа. Концентрированный раствор лиофильно высушивают. Удельная протеолитическая активность не ниже 10000 ед/мг, а удельная активность индивидуальных коллагеназ существенно меньше удельной активности суммарного препарата (ЕР № 0402321, кл. С 12 N 9/64, 1990.12.12).

В указанном способе присутствуют те же недостатки, что и в предыдущем, - высокая ионная сила детергентов и соли натрия, отсутствие стадии обессоливания. Собирают фракцию, включающую слишком широкий диапазон белков с молекулярными массами от 15-1200000 кДа, куда попадают не только коллагеназы ( 20-25,5 кДа), но и большое количество примесных белков, включая ингибиторы.

Известен способ получения протеолитического комплекса, включающего коллагеназную активность, из замороженного гепатопанкреаса камчатского краба, гомогенизированного перемешиванием в 0,1-1,0 М растворе хлорида щелочного металла при комнатной температуре. Затем нерастворимые частицы отделяют последовательной фильтрацией через фильтры с размером пор 10, 0,5 и 0,1 мм. После отделения осадка раствор очищают микрофильтрацией на мембранах с диаметром пор 0,45 мкм, пропускающих белки с ММ 1200 кДа. Для удаления эмульгированного жира, клеточных обломков и микроорганизмов концентрирование полученного раствора осуществляют ультрафильтрацией на мембране с диаметром пор 10 кДа. Концентрированный раствор лиофильно высушивают. Удельная коллагенолитическая активность составляет не менее 2000 ед. Мандл/мг (патент РФ №2096456, С 12 N 9/48, 1998. 20.11).

Указанный способ несколько более экономичен, чем предыдущий, однако препарат содержит большое количество примесных белков, не относящихся к коллагенолитическим ферментам, что приводит к небольшой удельной коллагеназной активности.

Наиболее близким по технической сущности к изобретению является способ получения коллагеназы, описанный в патенте РФ №2039819 (C 12 N 9/48, 1995.20.07). В качестве сырья для получения коллагеназы используют гепатопанкреас промысловых крабов, выделение проводят при смешивании гомогената гепатопанкреаса крабов, полученного в результате автолитического гидролиза за счет эндопротеаз с раствором хитозана рН 2,5-6,5, а полученный раствор после отделения нерастворимого материала последовательно подвергают 2-х стадийной ультрафильтрации сначала на мембране, отсекающей примесные вещества с М.М. 100 кДа и более, собирая проходящий через мембрану раствор, а затем на мембране, отсекающей вещества с М.М. 30 кДа, собирая фермент, не проходящий через мембрану. Раствор, содержащий ферментативную активность, лиофилизируют. Удельная активность коллагеназы 9800-11200 ед./мг белка.

К недостаткам способа следует отнести невысокую очистку целевого продукта. Это, по-видимому, связано с потерями активной коллагеназы, возникающими на стадии прибавления кислого раствора хитозана (рН 2,5-5,0), который приводит к частичной инактивации коллагенолитических ферментов, а также потерями коллагеназы при применении мембраны с размером пор 30 кДа. Работами последних лет по выделению генов коллагенолитических ферментов гепатопанкреаса камчатского краба, манящего краба, креветок было показано, что их ММ составляет 21,5-25,0 кДа, поэтому при размере пор мембраны 30 кДа коллагеназы в значительной мере проходят через мембрану и суммарная активность конечного препарата снижается.

Задачей изобретения является повышение суммарной коллагенолитической активности препарата, удельной активности, чистоты препарата.

Поставленная задача достигается тем, что в способе получения препарата коллагеназы, включающем гомогенизацию гепатопанкреаса промысловых видов крабов в буферных водных растворах, выделение раствора коллагеназы, очистку его последовательной 2-х стадийной ультрафильтрацией на мембранах, отсекающих примесные вещества и лиофильную сушку препарата, ультрафильтрацию проводят на поливолоконных мембранах с размером пор 15 кДа, при этом концентрат, полученный на 1-ой стадии ультрафильтрации, разбавляют водой в соотношении 1:5-10, а концентрат, полученный на 2-ой стадии ультрафильтрации, дополнительно последовательно подвергают микрофильтрации на мембранах с размером пор 100 кДа и ультрафильтрации на мембранах с размером пор 15 кДа.

Гомогенизацию гепатопанкреаса промысловых видов крабов ведут в ацетат-аммонийном буфере, содержащем ацетат кальция при рН 6,4-6,7, с последующим осаждением коллагенолитических ферментов сульфатом аммония 60-70% насыщения.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем. В качестве источника коллагеназы используют гепатопанкреас промысловых видов краба, который гомогенизируют в 0,1 М ацетате аммония рН 6,4, содержащем 0,1-1,0 мМ ацетата кальция, отделяют экстракт центрифугированием, добавляют сульфат аммония 60-70% насыщения, осадок, содержащий коллагеназу, отделяют центрифугированием, растворяют в воде с добавлением 0,1-1,0 мМ ацетата кальция до получения истинного раствора. Концентрирование, обессоливание, очистку проводят следующим образом. Концентрирование раствора проводят на мембранном аппарате общей площадью фильтрации 2 м² (ПВУ, Мытищи) с использованием поливолоконных мембран и размером пор 15 кДа. Полученный концентрат разбавляют дистиллированной водой в 5-10 раз и снова концентрируют. В результате 2-х стадийной ультрафильтрации происходит концентрирование и обессоливание комплексного препарата коллагеназ. Полученный раствор далее подвергают очистке на мембранном аппарате для микрофильтрации с размером пор 100 кДа с целью удаления высокомолекулярных примесей предположительно углеводного характера, а также ингибиторов. Целевой продукт содержится в фильтрате, который снова направляют на ультрафильтрацию, концентрат промывают водой и лиофильно высушивают.

В результате получают очищенный ферментный препарат, обладающий высокой коллагенолитической активностью. Выход по активности - 850-110%, определяемой методом Мандла. Удельная активность коллагеназы 48000-56000 ед. Мандл/мг белка.

Пример 1.

20 кг гепатопанкреаса гомогенизируют в 0,1М ацетате аммония рН 6,4, затем осадок отделяют центрифугированием при 10000 об/мин, к супернатанту добавляют сульфат аммония 60% насыщения и через 20 ч снова центрифугируют. Полученный осадок (сульфат-паста) растворяют в 15 л дистиллированной воды до получения истинного раствора. Объем полученного раствора доводят до 100 л, тщательно перемешивают. Концентрирование раствора проводят на мембранном аппарате (ПВУ, Мытищи) с поливолоконной мембраной с размером пор 15 кДа и общей площадью фильтрации 2 м². Полученный концентрат объемом 10 л доводят водой до 50 л и снова концентрируют до 10 л. Затем концентрат сливают, а установку промывают двукратно дистиллированной водой для смыва оставшейся на волокнах коллагеназы. Промывные воды объединяют с концентратом. В результате проделанных операций происходит обессоливание и концентрирование исходного препарата коллагеназы. Полученный раствор далее подвергают очистке на мембранном аппарате для микрофильтрации PELLICON, "Millipore" с размером пор 100 кДа, целевой продукт содержится в фильтрате. Фильтрат затем концентрируют, как указано выше, до 10 л, три раза промывают дистиллированной водой, объединяют с промывными водами от поливолоконного аппарата, жидкость замораживают до -40°С и высушивают на сублимационной сушке TG-50, Германия.

Выход по активности 850%, удельная активность 48000 ед. Мандл/мг белка.

Пример 2.

500 г препарата коллагеназы производства фирмы «Биопрогресс» растворяют в 15 л дистиллированной воды до получения истинного раствора. Объем полученного раствора доводят до 50 л, тщательно перемешивают. Концентрирование раствора проводят на мембранном аппарате (ПВУ, Мытищи) с поливолоконной мембраной с размером пор 15 кДа и общей площадью фильтрации 2 м². Полученный концентрат объемом 10 л доводят дистиллированной водой до 50 л и снова концентрируют до 10 л. Затем концентрат сливают, а установку промывают двукратно дистиллированной водой для смыва оставшейся на волокнах коллагеназы. Промывные воды объединяют с концентратом. В результате происходит обессоливание исходного препарата коллагеназы.

Полученный раствор далее подвергают очистке на мембранном аппарате для микрофильтрации PELLICON, "Millipore" с размером пор 100 кДа. Целевой продукт содержится в фильтрате. Фильтрат затем концентрируют, как указано выше, до 10 л, три раза промывают дистиллированной водой, жидкость замораживают до -40°С и высушивают на сублимационной сушке TG-50, Германия. Выход по активности 1100%, удельная активность 56000 ед. Мандл/мг белка.

Таким образом, предлагаемый способ благодаря использованию наиболее оптимального размера пор мембран (15-100 кДа) позволяет повысить до 850-1100% выход целевого продукта за счет удаления ингибирующих примесей, увеличить удельную активность коллагенолитических ферментов в 4-6 раз по сравнению с известным способом. Проведение ультрафильтрации на мембранах с размером пор 15 кДА позволяет удалять низкомолекулярные примеси, но полностью сохранить коллагенолитические ферменты и осуществить одновременно обессоливание и концентрирование препарата, что приводит к получению концентрированных растворов, время высушивания которых значительно сокращается. Замена стадии осаждения нерастворимых примесей кислым раствором дорогостоящего хитозана на высаливание белков дешевым сульфатом аммония при слабокислом и нейтральном рН способствует сохранению активности коллагенолитических ферментов и удешевлению процесса. Кроме того, применение ацетата и сульфата аммония для экстракции и высаливания коллагенолитических ферментов более удачно с точки зрения экологической безопасности процесса, т.к. растворы солей аммония при разбавлении могут быть использованы для удобрения растений.

Изобретение относится к биотехнологии и направлено на получение высокоочищенного и высокоактивного ферментного препарата коллагеназы, который может быть использован в медицине, ветеринарии, биохимии и пищевой промышленности, а также для исследовательских целей. Способ получения препарата коллагеназы включает гомогенизацию гепатопанкреаса промысловых видов крабов в буферных водных растворах, выделение раствора коллагеназы, очистку его последовательной 2-х стадийной ультрафильтрацией на мембранах, отсекающих примесные вещества, и лиофильную сушку препарата. Ультрафильтрацию проводят на поливолоконных мембранах с размером пор 15 кДа, концентрат, полученный на 1-ой стадии ультрафильтрации, разбавляют водой в соотношении 1:5-10, а концентрат, полученный на 2-ой стадии ультрафильтрации, дополнительно подвергают последовательно микрофильтрации на мембранах с размером пор 100 кДа и ультрафильтрации на мембранах с размером пор 15 кДа. Гомогенизацию гепатопанкреаса промысловых видов крабов ведут в ацетат-аммонийном буфере, содержащем ацетат кальция при рН 6,4-6,7, с последующим осаждением коллагенолитических ферментов сульфатом аммония 60-70% насыщения. Изобретение обеспечивает повышение суммарной коллагенолитической активности препарата, удельной активности и чистоты препарата. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ получения препарата коллагеназы, включающий гомогенизацию гепатопанкреаса промысловых видов крабов в буферных водных растворах, выделение раствора коллагеназы, очистку его последовательной 2-стадийной ультрафильтрацией на мембранах, отсекающих примесные вещества, и лиофильную сушку препарата, отличающийся тем, что ультрафильтрацию проводят на поливолоконных мембранах с размером пор 15 кДа, при этом концентрат, полученный на 1-й стадии ультрафильтрации, разбавляют водой в соотношении 1:5-10, а концентрат, полученный на 2-й стадии ультрафильтрации, дополнительно подвергают последовательно микрофильтрации на мембранах с размером пор 100 кДа и ультрафильтрации на мембранах с размером пор 15 кДа.2. Способ получения препарата коллагеназы по п.1, отличающийся тем, что гомогенизацию ведут в ацетат-аммонийном буфере, содержащем ацетат кальция при рН 6,4-6,7, с последующим осаждением коллагенолитических ферментов сульфатом аммония 60-70% насыщения.