СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНАЗЫ Российский патент 1998 года по МПК C12N9/64 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к препаративной биохимии, и может быть использовано в клеточной биологии, медицинской практике для лечения ожогов, остеомиелитов, пролежней и удаления рубцов коллагена в косметических целях, косметической и парфюмерной промышленности при изготовлении кремов и мазей для омолаживания кожи, в пищевой промышленности для обработки мяса с целью улучшения его качества и питательных свойств, кожевенно-меховом производстве для получения эластичных, тонких и прочных материалов, а также в научно-исследовательской работе для изучения микроструктуры коллагена, при работе с клеточными структурами, а также с различными тканями и органами для индивидуальных интактных клеток.

Известен способ получения комплекса протеолитических ферментов, включающий гомогенизацию гепатопанкреаса крабов в водном растворе, экстракцию балластных веществ из гомогената путем его отстаивания, очистку полученной жидкой фракции путем введения сульфата до насыщения 0,3, отделение полученного при этом осадка отстаиванием и центрифугированием и фильтрацию жидкой фракции, выделение комплекса ферментов из очищенного ферментного раствора путем его осаждения и центрифугирования при насыщении раствора сульфатом аммония до 0,8, диализ осадка, содержащего комплекс ферментов, и его лиофилизацию [1].

Недостатком известного способа является многостадийность, обусловленная этим длительность технологического процесса и его сложность, а также трудность аппаратурного оформления. Кроме того, имеет место низкое качество конечного продукта ввиду его загрязнения сульфатом аммония, полностью избавиться от которого практически невозможно. Технологический процесс по известному способу трудоемок в реализации и в промышленных условиях трудноприменим. При реализации способа имеет место также загрязненность отходов производства сульфатом аммония, при этом фракции с насыщением 0,8 утилизации вообще не подлежат. Это приводит к загрязнению окружающей среды и необходимости строительства очистных сооружений. Наконец, известный способ позволяет получить не чистую коллагеназу, а комплекс ферментов, включающий трипсии, карбоксипептидазы, лейцинаминопептидазу, а также щелочные и нейтральные протеазы.

Наиболее близким к заявляемому способу является известный способ получения коллагеназы, предусматривающий гомогенизацию в буферном растворе гепатопанкреаса крабов, экстракцию балластных веществ из гомогената путем его центрифугирования, смешивания с трет-бутиловым спиртом, введения в раствор сульфата аммония до его концентрации 15-20%, центрифугирования смеси и ультрафильтрации, выделения коллагеназы из ферментного раствора ионообменной хроматографией, диализ и лиофилизацию коллагеназы [2].

Указанному известному способу [2] в полной мере присущи упомянутые выше недостатки известного способа [1]. Кроме того, указанный известный способ [2] взрыво-пожароопасен, так как предусматривает использование спирта, утилизация которого представляет большие трудности.

Ближайшим аналогом к предложенному является способ получения ферментного препарата, обладающего коллагенолитической активностью, предусматривающий гомогенизацию гепатопанкреаса крабов в водном буферном растворе с pH 6,0-9,5, содержащем неионный детергент в количестве 0,1-5,0% и хлорид щелочного металла, отстаивание гомогената, отделение балластных веществ и флотирующих липидов, микрофильтрацию суспензии и ресуспендирование ее, выделение и очистку от пигмента ультрафильтрацией на полых волокнах с лимитом пропускания 5000 Да, диализацию и лиофильное высушивание [3].

Цель изобретения - увеличение выхода конечного продукта, сокращение продолжительности и упрощение технологического процесса, повышение его безопасности и экологической чистоты.

Поставленная цель достигается тем, что при получении коллагеназы, включающем гомогенизацию в буферном растворе гепатопанкреаса крабов, экстракцию балластных веществ из гомогената, выделение коллагеназы из ферментного раствора и ее лиофилизацию, согласно изобретению экстракцию балластных веществ производят путем добавления к гомогенату от 0,2 до 1,5%-ного раствора хитозана в 1%-ной уксусной кислоте из расчета 0,2-1,4 л раствора хитозана на 1 кг гепатопанкреаса крабов, перемешивания, отстаивания в течение 1-3 ч и фильтрации полученной смеси, а выделение коллагеназы осуществляют путем ультрафильтрации ферментного раствора на полых волокнах. Ультрафильтрация может производиться на полых волокнах с диаметром пор 20 - 100 ангстрем.

Для обеспечения стабильности pH ферментного раствора, равного 7,4-7,5, и создания комплекса, обеспечивающего улучшение экстракции балластных веществ из гомогената, в качестве буферного раствора может использоваться трис(оксиметил)аминометан с pH 8,0-8,5.

Для оптимизации технологического процесса по производительности экстракция балластных веществ может производиться путем добавления к гомогенату от 0,8 до 1,0%-ного раствора хитозана в 1%-ной уксусной кислоты из расчета 0,8-1,0 л раствора хитозана на 1 кг гепатопанкреаса крабов. Для расширения технологических возможностей и обеспечения промышленного производства коллагеназы в качестве буферного раствора может использоваться смесь бикарбоната натрия с едким натром в соотношении 7 : 1. Для обеспечения чистоты ферментного раствора путем улучшения контакта балластных веществ с хитозаном перемешивание смеси может производиться в реакторе при частоте вращения мешалки не менее 180 об/мин. Для повышения чистоты ферментного раствора перед ультрафильтрацией на полых волокнах фильтрацию смеси проводят на нутч-фильтре с использованием бельтинг-ткани. Для расширения технологических возможностей путем более полного использования ферментного раствора после выделения коллагеназы ультрафильтрацию производят на полых волокнах с диаметром пор от 1 до 20 ангстрем и от 100 ангстрем и более. Для увеличения выхода коллагеназы гомогенизацию производят на коллоидной мельнице с ножевым зазором, равным 0,1 мм.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что заявленный способ отличается новой совокупностью признаков, состоящих в том, что экстракцию балластных веществ производят путем добавления к гомогенату от 0,2 до 1,5%-ного раствора хитозана в 1%-ной уксусной кислоте из расчета 0,2-1,4 л раствора хитозана на 1 кг гепатопанкреаса крабов, перемешивания, отстаивания в течение 1 - 3 ч и фильтрации полученной смеси, а выделение коллагеназы осуществляют путем ультрафильтрации ферментного раствора на полых волокнах. При этом ультрафильтрацию могут производить на полых волокнах с диаметром пор от 20 до 100 ангстрем. В качестве буферного раствора могут использовать трис(оксиметил)аминометил с pH 8,0-8,5. Экстракцию балластных веществ могут производить путем добавления к гомогенату 0,8 - 1,0 л раствора хитозана на 1 кг гепатопанкреаса крабов. В качестве буферного раствора могут использовать смесь бикарбоната натрия с едким натром в соотношении 7:1. Перемешивание смеси могут производить в реакторе при частоте вращения мешалки не менее 180 об/мин. Фильтрацию смеси могут производить на нутч-фильтре с использованием бельтинг-ткани. Ультрафильтрацию могут производить на полых волокнах с диаметром пор от 1 до 20 ангстрем и более. Гомогенизацию могут производить на коллоидной мельнице с ножевым зазором, равным 0,1 мм. Указанные обстоятельства свидетельствуют о соответствии заявленного технического решения критерию "новизна".

Сравнение заявленного способа с известными показывает, что он для специалиста не следует явным образом из уровня техники, что свидетельствует о соответствии заявленного технического решения критерию "изобретательский уровень".

Заявленное техническое решение промышленно применимо - начато его использование в промышленном производстве коллагеназы на малом предприятии "Биопрогресс" при Всероссийском научно-исследовательском и техническом институте биологической промышленности (см. приведенные ниже примеры конкретного использования способа). Производственные мощности предприятия позволяют перерабатывать в коллагеназу до 50 т гепатопанкреаса крабов в год.

Предлагаемый способ получения коллагеназы осуществляется следующим образом.

Гепатопанкреас крабов гомогенизируют в буферном растворе. Гомогенизация может производиться на коллоидной мельнице или гомогенизаторе. При этом максимальный выход каллогеназы имеет место при гомогенизации исходного сырья на коллоидной мельнице с ножевым зазором, равным 0,1 мм. В качестве буферных растворов могут использоваться фосфатный, карбонатный и др. буферные растворы.

Для обеспечения стабильности ферментного раствора при pH (7,4-7,5) и создания комплекса, обеспечивающего улучшение экстракций балластных веществ из гомогената, в качестве буферного раствора используют трис(оксиметил)аминометан с pH 8,0-8,5.

Для расширения технологических возможностей и обеспечения производства коллагеназы в промышленных масштабах в качестве буферного раствора может использоваться смесь бикарбоната натрия с едким натром в соотношении 7:1.

Гомогенат загружается в реакторе, в него добавляется от 0,2 1,5%-ный раствор хитозана в 1%-ной уксусной кислоте из расчета 0,2-1,4 л раствора хитозана на 1 кг гепатопанкреаса крабов.

Максимальная производительность технологического процесса достигается при добавлении к гомогенату от 0,8 до 1%-ного раствора хитозана в 1%-ной уксусной кислоте из расчета 0,8-1,0 л раствора хитозана на 1 кг гепатопанкреаса крабов. Включается мешалка и производится перемешивание смеси. При этом наилучший контакт балластных веществ с хитозаном имеет место при интенсивном перемешивании смеси - частоте вращения мешалки не менее 180 об/мин. Улучшение контакта балластных веществ с хитозаном позволяет повысить чистоту ферментного раствора. Перемешивание смеси производят до появления балластных веществ в верхней части реактора. Через 15-20 мин мешалку выключают и смесь отстаивают в течение 1-3 ч. Полученную смесь фильтруют на нутч-фильтре с использованием плотной ткани. Это позволяет повысить чистоту ферментного раствора перед его ультрафильтрацией. При этом наилучшие результаты имеют место при использовании в нутч-фильтре бельтинг-ткани.

Отделенный от балластных веществ ферментный раствор направляется на ультрафильтрацию, где производится выделение конкретного целевого продукта - коллагеназы. Ультрафильтрация раствора производится на полых волокнах. При этом для выделения чистой коллагеназы из коллагеналитической протеиназы используют полые волокна с диаметром пор 20 - 100 ангстрем. С целью расширения технологических возможностей за счет более полного использования ферментного раствора он подвергается ультрафиксации на полых волокнах с диаметром пор 1 - 20 ангстрем и от 100 ангстрем и более.

Полученную жидкую коллагеназу замораживают до (-30) - (-50)^oC и лиофилизируют. Удельная активность коллагеназы равна 4500 - 4800 ед. на 1 мг белка.

Пример 1.

200 кг гепатопанкреаса крабов в течение 1,5 ч. гомогенизируют в буферном растворе коллоидной мельнице. В качестве буферного раствора используют раствор бикарбоната натрия с едким натром из расчета 7:1. Гомогенат направляют в реактор объемом 1 м³. В реактор добавляется 200 л 0,8%-ного раствора хитозана в 1%-ной уксусной кислоте. Включается мешалка с частотой вращения 180 об/мин и производится перемешивание смеси. Перемешивание смеси производится до появления балластных веществ в верхней части реактора (15-20 мин). Мешалка останавливается и смесь в течение 2 ч. отстаивается в реакторе. Полученную смесь направляют на нутч-фильтр с бельтинг-тканью. Балластные вещества задерживаются фильтрующим материалом, а полученный ферментный раствор направляется на ультрафильтрацию. Ультрафильтрация ведется на полых волокнах с диаметром пор 20 ангстрем. Выход целевого продукта - жидкой коллагеназы составляет 8 л. Лиофильная сушка производится в течение 1,5 суток. Удельная активность полученной коллагеназы равна 4600 ед. на 1 мг белка.

Пример 2.

150 кг гепатопанкреаса крабов в течение 2 ч. гомогенизируют в буферном растворе на колоидной мельнице. В качестве буферного раствора используют трис(оксиметил)аминометил. Гомогенат направляют в реактор объемом 0,63 м³, куда добавляют 120 л 1%-ного раствора хитозана в 1%-ной уксусной кислоте. Включают мешалку с частотой вращения 200 об/мин и производят перемешивание смеси. После появления балластных веществ в верхней части реактора мешалку останавливают и смесь в течение 3 ч. отстаивают. Полученную смесь направляют на нутч-фильтр с бельтинг-тканью. Балластные вещества задерживаются на нутч-фильтре. Профильтрованный ферментный раствор направляют на ультрафильтрацию. Ультрафильтрация ведется на полых волокнах с диаметром пор 40 ангстрем. Выход жидкой коллагеназы составляет 6 л. Жидкую коллагеназу лиофилизируют в течение 1,5 суток. Удельная активность полученной коллагеназы равна 4750 ед. на 1 мг белка.

Изобретение позволяет увеличить выход конечного продукта за счет более полного выделения конечного продукта (коллагеназы) из ферментного раствора (коллагенолитической протеазы), содержащего ряд ферментов с различными молекулярными массами.

Кроме того, достигается уменьшение длительности технологического процесса, т.к. из него исключается целый ряд операций, таких как центрифугирование раствора, очистка его ионообменной хроматографией и др.

Сам технологический процесс и его аппаратурное оформление упрощаются, т. к. вся технология содержит всего 4 стадии: гомогенизация исходного сырья, экстракция балластных веществ из гомогената, выделение коллагеназы из ферментного раствора и ее лиофилизация.

Повышается безопасность и экологическая чистота производства, т.к. из технологического процесса исключается применение спиртов, сульфата аммония и других пожаро-взрывоопасных и загрязняющих окружающую среду веществ.

Использование: в биотехнологии и может быть использовано в медицине, косметической, парфюмерной, пищевой промышленности, а также в кожевенно-меховом производстве. Сущность изобретения: способ состоит в том, что гепатопанкреас крабов гомогенизируют в буферном растворе, балластные вещества экстрагируют из гомогената, из ферментного раствора выделяют коллагеназу и лиофилизируют ее. При этом экстракцию балластных веществ производят путем добавления к гомогенату от 0,2 до 1,5%-ного раствора хитозана в 1%-ной уксусной кислоте из расчета 0,2 - 1,4 л, раствора хитозана на 1 кг гапатопанкреаса крабов, перемешивания, отстаивания в течение 1 - 3 ч и фильтрации полученной смеси. Причем выделение коллагеназы осуществляют путем ультрафильтрации ферментного раствора на полых волокнах. 3 з.п.ф-лы.

1. Способ получения коллагеназы, включающий гомогенизацию в буферном растворе гепатопанкреаса крабов, экстракцию балластных веществ из гомогената, выделение коллагеназы из ферментного раствора путем ультрафильтрации на полых волокнах и лиофилизацию коллагеназы, отличающийся тем, что экстракцию балластных веществ производят путем добавления к гомогенату от 0,2 до 1,5%-ного раствора хитозана в 1%-ной уксусной кислоте из расчета 0,2 - 1,4 л раствора хитозана на 1 кг гепатопанкреаса крабов, перемешивания, отстаивания в течение 1 - 3 ч и фильтрации полученной смеси, а ультрафильтрацию производят на полых волокнах с диаметром пор 20 - 100 . 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора используют трис(оксиметил) аминометан с pH 8,0 - 8,5. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора используют смесь бикарбоната натрия с едким натром в соотношении 7 : 1. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фильтрацию смеси проводят на нутч-фильтре с использованием бельтинг-ткани.