СРЕДА ДЛЯ ЗАМОРАЖИВАНИЯ СЕМЕНИ БЫКОВ Российский патент 2009 года по МПК A61D19/02 

Изобретение относится к животноводству, в частности к способам размножения животных, а именно к средам для замораживания семени быков-производителей.

Известна унифицированная комплексонатная среда для разбавления и замораживания семени сельскохозяйственных животных. В се состав на 1000 мл дистиллированной воды входят:

- сахар-рафинад 100 г - этилендиаминтетрауксусной кислоты   динатриевая соль, кальциевый комплексонат   6-водная 3 г - этилендиаминтетрауксусной кислоты   дикалиевая соль, магниевый комплексонат,   водная 3 г - натрий фосфорнокислый, 2-замещенный 0,7 г - калий фосфорнокислый, 1-замещенный 1,5 г - 2,6-ди-трет-бутил-1,4-крезол 0,5 г - глицерин 40 мл - желток куриного яйца, оранжевой   окраски 50 мл - спермосан-3 500-700 ед.

(Животноводство, 1985, №7, с.39-41). Среда имеет преимущество над другими своей универсальностью. Она в определенной мере предохраняет от разрушения и обогащает макро- и микроэлементный комплекс семени, а соли ЭДТА снижают нуклеазную активность среды. Однако использование в этой среде сахарозы не обеспечивает в необходимой мере обменные процессы в плазматической мембране живчиков; наличие натриевых солей не обеспечивает оптимальных характеристик поверхностного электрического потенциала плазматических мембран живчиков; уменьшенное содержание желтка в среде вызывает недостаток лецитина и других веществ криопротекторного характера.

Известна среда для разбавления и замораживания семени быка, используемая в Литовской технологии содержания племенных быков (П.Пакенас. Литовская технология содержания и использования племенных быков. МСХ Литвы, 1993). Среда включает (на 100 мл дистиллированной воды):

- лактозу 10,5 г - натрий лимоннокислый, 3-замещенный,   5-водный 0,2 г - глицерин 5 мл - желток куриного яйца 20 мл - спермосан-3 50 ед. или спермосан-ППК 50-100 ед.

Известна среда для разбавления семени сельскохозяйственных животных, состоящая из:

- сахар 101,1-101,3 г - комплексная соль этилендиаминтетра   уксусной кислоты 5,9-6,1 г - желток куриного яйца 49-51 мл - глицерин 39-41 мл - пенициллин 250-350 тыс.и.е. - стрептомицин сернокислый 250-350 тыс.и.е. - 2,3,5,7,8-Пента-гидрокси-   6-этил-1,4-нафто-хинон 0,0049-0,0051 г - вода дистиллированная до 1000 мл.

(SU 1080819 A, A61D 19/02,23.03.1984. Бюл. №11).

Данная среда, по сравнению с контрольной, обеспечила абсолютный показатель подвижности сперматозоидов выше на 1,9; полупериод подвижности и живучести на 4 часа, сохранность акросом - на 10%. Однако она содержит сравнительно небольшой удельный объем куриного желтка, что снижает ее криопротекторные свойства. Кроме того, сахароза обладает менее выраженными диэлектрическими свойствами в сравнении с лактозой, а это, в свою очередь, отрицательно влияет на распределение электрических зарядов по поверхности спермиев. В среде отсутствует источник макро- и микроэлементов.

Наиболее близкой по технической сущности и достигаемому результату является синтетическая среда для разбавления и замораживания семени быка (в форме гранул) в составе:

- лактоза 11,5 г - желток куриного яйца 20,0 мл - глицерин 5 мл - спермосан-3 50,0 тыс.ед. - вода дистиллированная 100 мл

Среда была рекомендована для работы станций и предприятий по искуственному осеменению сельскохозяйственных животных («Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных», МСХ СССР, Гл. упр. животноводства. М., Колос, 1981, 159 с.).

Данная среда содержит лактозу, достаточное количество желтка куриных яиц и глицерина. Однако в ней отсутствуют комплексонаты макро- и микроэлементов и компоненты, в достаточной мере обеспечивающие ее бактериостатические свойства.

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение сохранности биологической полноценности сперматозоидов и улучшение показателя стельности коров, осемененных семенем с использованием предложенной среды.

Технический результат изобретения достигается тем, что предложена среда для замораживания семени быков, включающая лактозу, желток куриных яиц, глицерин и воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит комплексонаты макро- и микроэлементов - кальциевый комплексонат этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА-кальций), цинковый комплексонат (ЭДТА-цинк), медный комплексонат (ЭДТА-меди) и антибиотики: пенициллин, стрептомицин и полимиксин - при следующем соотношении компонентов:

- лактоза 105-115 г - ЭДТА-кальций 0,45-0,80 г - ЭДТА-цинк 1,0-1,7 г - ЭДТА-меди 0,45-0,80 г - глицерин 40-70 мл - желток куриных яиц 170-200 мл - пенициллин 250-750 тыс.ед. - стрептомицин 250-750 тыс.ед. - полимиксин 1,0-2,0 млн ед. - вода дистиллированная до 1000 мл

В предложенной среде наличие комплексонатов металлов обеспечивает стабилизацию макро- и микроэлементного состава и снижение ее нуклеазной активности. Наличие ионов меди в комплексе с антибиотиками повышает бактериостатические свойства предлагаемой среды.

Изотонические концентрации компонентов среды найдены криоскопическим (расчетным) методом с последующим уточнением по подвижности и выживаемости живчиков.

Оптимальное соотношение компонентов определяли с использованием биологического метода, то есть по показателям подвижности и выживаемости сперматозоидов после замораживания в том или ином варианте сред (таблица 1).

Таблица 1
Качество замороженного семени быков в связи с разной концентрацией лактозы и комплексонатов в среде Соотношение объемных долей изотонических растворов лактозы и комплексонатов Подвижность спермиев (%) Выживаемость после оттаивания (час) Сохранность акросом (в %) После замораживания После оттаивания 80% лактозы + 4% ЭДТА-кальция + 4% ЭДТА меди + 12%
ЭДТА цинка 80 50 9,0 82 90% лактозы + 2% ЭДТА-кальция + 2% ЭДТА меди + 6%
ЭДТА цинка 80 60 9,5 84 95% лактозы + 1% ЭДТА-кальция + 1% ЭДТА меди + 3%
ЭДТА цинка (взята за основу) 80 60 9,5 86

При испытании разных вариантов состава среды применяли метод так называемого расщепленного эякулята, то есть для всех вариантов использовали семя из одного и того же эякулята.

Нуклеазную активность сред в связи с включением в них комплексонатов определяли по степени деградации контрольного образца ДНК (таблица 2).

Таблица 2
Нуклеазная активность сред для замораживания семени быка в связи с включением в них комплексонатов металлов Среды Степень деградации контрольного образца ДНК фага-лямбда (по длине фрагментов, в нуклеотидных парах). Инкубация - 1 час при + 37°С Лактозная (контроль) 400-500 Лактозная + комплексонаты 5000-6000

Из представленных в таблице 2 данных следует, что добавление комплексонатов в рекомендуемых количествах способствует снижению нуклеазной активности и меньшей степени деградации контрольного образца ДНК (5000-6000 пар нуклеотидов вместо 400-500 в контроле).

Для замораживания использовали общепринятую технологию. Гранулы замораживали на сухом льду, соломинки - в парах жидкого азота.

Пример 1. В лабораторных условиях ВИЖ было проведено испытание качества бычьего семени, замороженного в предлагаемой среде. Согласно полученным результатам качество семени, замороженного в предлагаемой среде, было выше, чем качество семени, замороженного в известной среде, при всех вариантах степеней разбавления (таблица 3).

Таблица 3
Показатели качества оттаянного семени в зависимости от примененной разбавляющей среды и степени разбавления. Средние данные по 14 экспериментам Среда для замораживания Кратность разбавления семени Показатели сразу после оттаивания Показатели через 5 час инкубации при +37°С % спермиев с ППД* % спермиев с целой акросомой % спермиев с ППД % спермиев с целой акросомой Предлагаемая 10 51±4,9 79±9,2 34,6±14,9 54,5±13,6 То же 12,5 52±5,7 68±13,6 32,3±15,7 52,7±2,7 То же 16,7 50±5,1 68±8,7 26,8±15,5 48,8±11,6 То же 25 49±2,6 63±4,8 28,4±12,9 41,8±10,7 Среда-прототип 10 45±6,5 60±9,1 14,3±11,2 35,4±6,8 То же 12,5 44±5,0 58±7,5 12,8±11,2 35,0±7,0 То же 16,7 37±8,2 59±7,3 7,7±8,2 33,6±5,0 То же 25 35±0,1 52±7,2 7,7±8,5 30,0±6,3 * - ППД - сперматозоиды с прямолинейно-поступательным движением.

Как видно из данных таблицы 3, при всех вариантах степени разбавления лабораторные показатели качества семени, замороженного в предлагаемой среде, выше, чем в семени, замороженном в среде-прототипе. Причем при использовании предлагаемой среды (в сравнении со средой-прототипом) увеличение степени разбавления до 25 раз не вызывает снижения показателей качества оттаянного семени.

Пример 2. На фермах экспериментального хозяйства ВИЖ «Кленово-Чегодаево» было осеменено 205 коров с использованием предлагаемой среды и 183 коровы - с использованием среды-прототипа. При использовании предложенной, лактозо-комплексонатной, среды стельность коров после первого осеменения была на 8% выше по сравнению с использованием среды-прототипа.

Изобретение применимо на станциях и предприятиях по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных.

Изобретение относится к области животноводства. Среда включает лактозу, желток куриных яиц, глицерин и воду. Дополнительно среда содержит комплексонаты макро- и микроэлементов - кальциевый комплексонат этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА-кальций), цинковый комплексонат (ЭДТА-цинк), медный комплексонат (ЭДТА-меди) и антибиотики - пенициллин, стрептомицин и полимиксин, при следующих соотношениях компонентов: лактоза - 105-115 г, ЭДТА-кальций - 0,45-0,80 г, ЭДТА-цинк- 1,0-1,7 г, ЭДТА-меди - 0,45-0,80 г, глицерин - 40-70 мл, желток куриных яиц - 170-200 мл, пенициллин - 250-750 тыс.ед., стрептомицин - 250-750 тыс.ед., полимиксин - 1,0-2,0 млн ед., вода дистиллированная - до 1000 мл. Среда способствует повышению сохранности биологической полноценности сперматозоидов и улучшает показатель стельности коров после первого осеменения. 3 табл.

Среда для замораживания семени быков, включающая лактозу, желток куриных яиц, глицерин и воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит комплексонаты макро- и микроэлементов - кальциевый комплексонат этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА-кальций), цинковый комплексонат (ЭДТА-цинк), медный комплексонат (ЭДТА-меди) и антибиотики - пенициллин, стрептомицин и полимиксин при следующих соотношениях компонентов:
Лактоза 105-115 г ЭДТА-кальций 0,45-0,80 г ЭДТА-цинк 1,0-1,7 г ЭДТА-меди 0,45-0,80 г Глицерин 40-70 мл Желток куриных яиц 170-200 мл Пенициллин 250-750 тыс.ед. Стрептомицин 250-750 тыс.ед. Полимиксин 1,0-2,0 млн. ед. Вода дистиллированная до 1000 мл