СПОСОБ ОБРАБОТКИ СПЕРМЫ БЫКА Российский патент 2004 года по МПК A61D19/02 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способам искусственного осеменения животных, а именно к способам обработки и замораживания спермы быка.

Известен способ обработки спермы быка, согласно которому свежезамороженную сперму разбавляют защитной средой, в разбавленную сперму добавляют адекалин, обладающий антиоксидантным действием, подвергают эквилибрации и замораживают в парах жидкого азота (а.с. СССР 1331499, кл. A 61 D 7/02, 1987). Способ позволяет стабилизировать биологическую полноценность спермиев и снизить затраты пищевого продукта - куриных яиц на цели искусственного осеменения животных. Однако применяемый препарат адекалин дорог и дефицитен.

Известен способ обработки спермы сельскохозяйственных животных, согласно которому свежеотобранную сперму смешивают с метилаэросилом из расчета 3-30 мг метилаэросила на 1 млрд. спермиев; далее сперму разбавляют защитной средой, эквилибрируют и замораживают в парах жидкого азота до -196^oС (а.с. СССР 1144698, кл. A 61 D 7/02, 1985). Способ способствует улучшению сохранности мембранных структур сперматозоидов в процессе замораживания-оттаивания. Однако данный способ, как и предыдущий, не всегда способствует повышению живучести оттаянных спермиев. Применяемый препарат метилаэросил также сравнительно дорог.

Известен способ обработки спермы быка, взятый в качестве прототипа, согласно которому свежеполученную сперму разбавляют синтетической средой, включающей: лактозу - 11,5 г, желток куриных яиц - 20,0 мл, глицерин - 5 мл, спермосан - 3-50 тыс. ед. , вода дистиллированная - 100 мл. Разбавленную сперму охлаждают при 2-5^oС в течение 3-4 часов, подвергают эквилибрации и замораживают в виде гранул объемом 0,2 мл на фторопластовой пластине в парах азота и хранят в азоте при -196^oС (Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных. - М.: Колос. - 1981. - 159 с.). Способ позволяет получить в одной оттаянной спермодозе 10 млн. активных спермиев и использовать доступные компоненты, кроме спермосана-3. Недостатком способа является также снижение биологической полноценности спермы при замораживании в связи с нарушением мембранных структур спермиев.

При создании настоящего изобретения задача заключалась в повышении живучести спермиев после оттаивания, расширении арсенала применяемых криопротекторов (антиоксидантных средств) и профилактике повреждений мембранных структур сперматозоидов при замораживании спермы.

Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ обработки спермы быка, включающий разбавление цельной спермы лактозо-глицерино-желточной средой, эквилибрацию и замораживание в парах житкого азота, особенностью которого является введение в среду 0,1-0,3% сукцината хитозана.

Хитозан представляет собой N-диацетилизированную форму хитина. Он обладает антиоксидантными, сорбционными и антибактериальными свойствами, которые способствуют ингибиции процесса перекисного окисления липидов при замораживании спермы и предупреждению повреждения мембранных структур спермиев веществами, образующимися при пероксидации липидов путем их сорбирования. Кроме того, хитозан повышает вязкость криозащитной среды, что также способствует снижению криогенных повреждений сперматозоидов.

Согласно предлагаемому способу, сперму быка обрабатывают по следующей схеме. Свежеполученные эякуляты быка разбавляют известной лактозо глицерине желточной средой (прототип), в состав которой предварительно вводят 0,1-0,3% хитозана. Затем разбавленную сперму эквилибрируют 2-3 часа при +4^oС и замораживают с использованием фторопластовой пластины в жидком азоте до -196^oС в виде гранул объемом 0,2 мл. Оттаивают гранулы спермы в 3%-ном растворе цитрата натрия при +37^oС.

Пример 1.

В 2001 году на ЦСИО было испытано влияние различных дозировок хитозана на устойчивость сперматозоидов быка к глубокому замораживанию до -196^oС.

Свежеполученные эякуляты разбавляли синтетической средой до конечной концентрации 30 млн. сперматозоидов в 0,2 мл. При этом разные дозировки хитозана предварительно растворяли в следующей криозащитной среде:
- вода дистиллированная - 100 мл;
- лактоза - 11,5 г;
- глицерин - 5 мл;
- желток куриного яйца - 20 мл.

Разбавленную сперму охлаждали в холодильнике до +4^oС в течение 3-х часов, а затем замораживали в виде гранул объемом 0,2 мл на фторопластовой пластине в парах азота и хранили в азоте при -196^oС. Контрольные пробы спермы разбавляли известной средой (прототип), но без добавления в нее хитозана и замораживали по той же схеме. Оттаивали гранулы спермы в 3%-ном растворе цитрата натрия и затем инкубировали в термостате при +37^oС. Биологическую полноценность спермы, обработанную известным и предлагаемым способами, оценивали по показателям подвижности и абсолютному показателю живучести сперматозоидов.

В таблице 1 показана биологическая полноценность оттаянной спермы в опытных и контрольной группах.

Из данных таблицы 1 видно, что хитозан в дозах 3-0,12 мг/мл среды оказал определенное положительное влияние на живучесть замороженно-оттаянных сперматозоидов быка. Оптимальными дозировками хитозана в составе разбавителя является 1-3 мг препарата на 1 мл среды; При этом абсолютный показатель живучести оттаянных сперматозоидов быка в группах с 1, 2 и 3 мг хитозана на 1 мл среды был соответственно выше, чем в известном способе на 23, 24 и 22% (Р<0,05). Более низкие концентрации препарата оказали менее заметный эффект на повышение живучести оттаянных сперматозоидов. Подвижность сперматозоидов сразу после оттаивания была практически одинаковой при всех изученных дозировках хитозана.

Пример 2.

Было проверено влияние оптимальных дозировок хитозана на устойчивость сперматозоидов быка к глубокому замораживанию в зависимости от концентрации желтка куриного яйца в составе разбавителя.

Разбавление и замораживание спермы в данном примере проводили аналогично примеру 1.

Как видно из таблицы 2, введение хитозана в оптимальных дозировках в состав замораживающей среды, содержащей различные дозировки желтка, способствовало повышению живучести оттаянных сперматозоидов, причем все три дозировки хитозана оказали практически одинаковый защитный эффект. Более высокая живучесть сперматозоидов была отмечена в группе с 20% желтка в составе разбавителя. В этой группе при введении в состав разбавителя 1, 2 и 3 мг хитозана на 1 мл среды, живучесть сперматозоидов была соответственно выше, чем в контроле на 56, 48 и 41% (Р<0,05).

Предлагаемый способ позволяет повысить устойчивость мембранных структур сперматозоидов к криогенным повреждениям в процессе замораживания, о чем свидетельствует более высокий показатель живучести спермиев при +37^oС после оттаивания и заменить дефицитный антиоксидант более доступным.

Изобретение может быть использовано в работе станций и предприятий по искусственному осеменению коров и телок.

Изобретение относится к ветеринарии. В лактозо-глицерино-желточную среду вводят 0,1-0,3% сукцинат хитозана и полученной синтетической средой разбавляют цельную сперму быка, после чего ее подвергают эквилибрации и замораживанию в парах жидкого азота. Способ позволяет снизить биологические повреждения мембранных структур сперматозоидов в процессе глубокого замораживания и повышает время их живучести после оттаивания. 2 табл.

Способ обработки спермы быка, включающий разбавление цельной спермы лактозо-глицерино-желточной средой, эквилибрацию и замораживание в парах жидкого азота, отличающийся тем, что в среду вводят 0,1-0,3% сукцинат хитозана.