СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ИММУНОМОДУЛЯТОРА Российский патент 1997 года по МПК A61K35/70 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении ветеринарных препаратов-иммуномодуляторов. Известны способы получения препаратов-иммуномодуляторов из органов животных, включающие измельчение органов, экстрагирование, выделение из экстракта осадка, его переэкстракцию и фильтрацию. Полученный раствор лиофилизируют и используют как иммуностимулятор (авт. св. СССР N 1158201, кл. A 61 K 35/28, 1985, БИ 40). Недостатками этих способов являются: их трудоемкость, применение специального оборудования; химреактивов, загрязняющих окружающую среду; и использование органов животных.

Наиболее близким техническим решением является способ получения препарата ПЭФАГ, включающий культивирование актиномицета Streptomyces griseus на питательной среде, измельчение мицелия, экстрагирование петролейным эфиром при Т= 38-40^oC в течение 20-24 час, фильтрацию и вакуум-перегонку экстракта (Ракова Т. Н. Экспериментальное обоснование и практические аспекты нового направления использования культур стрептомицетов в ветеринарии. Автореф. дис. на соиск. уч. степени д-ра ветерин. наук. Воронеж, 1989 /Воронежский сельскохозяйственный институт/). Недостатками этого способа являются его трудоемкость, использование дорогостоящего оборудования и дефицитных химреактивов.

Задача, которую необходимо решить, заключается в следующем: разработать простой в исполнении и экономичный способ получения в ветеринарной практике.

В процессе решения задачи разработан способ получения препарата грамин (по видовому названию используемого гриба Drechslera graminea), предусматривающий выращивание чистой культуры продуцирующего гриба, культивирование его на жидкой питательной среде при T=26-28^oC, фильтрацию, причем культивирование продуцирующего гриба Drechslera graminea ведут в течение 35-40 сут, фильтрации подвергают культуральную жидкость, полученную после отделения мицелия и проводят расфасовку и стерилизацию фильтрата.

Способ прост в исполнении, не требует дорогостоящего оборудования, в частности фильтровального, так как фильтрацию производят естественным путем через фильтровальную бумагу, реактивы используют только для приготовления питательных сред.

Для получения препарата грамин выращивают чистую культуру продуцирующего гриба Drechslera graminea на среде Чапека с агаром в термостате при T=26-28^oC в течение 5-6 сут. Затем заражают стерильный нетонущий материал и инокулируют им жидкую питательную среду Чапека в колбах. Культивирование осуществляют в течение 35-40 сут при той же температуре. Отделяют мицелий и подвергают фильтрации культуральную жидкость через бумажный фильтр с нанесенным на него активированным углем. Производят расфасовку препарата по емкостям, предназначенным для использования и стерилизуют в автоклаве 30 мин при p= 0,5 атм. Работы проводят при соблюдении установленных правил асептики и антисептики. Хранение препарата осуществляют в холодильнике при T +5.+10^oC в течение шести месяцев.

Культуральную жидкость анализировали методом тонкослойной хроматографии в разные периоды ее культивирования. Анализ показал, что максимальное количество действующий веществ в культуральной жидкости накапливается к 35-40 сут. В период с 10 по 35-40 сут происходит увеличение концентрации действующих веществ, качественный состав не меняется, а после 35-40 сут начинается автолиз гриба с поступлением продуктов дезинтеграции мицелия в культуральную жидкость.

Для получения препарата использовали штаммы гриба Drechslera graminea-93, Drechslera graminea-94, Drechslera graminea-95, выделенные в разные годы с листьев ячменя.

Культурально-морфологические особенности этих штаммов, их биохимические свойства, антагонистическая активность сходные.

На плотной питательной среде указанные штаммы формируют воздушный мицелий через 72-96 ч культивирования при T=25-26^oC. Мицелий штамма Drechslera graminea-93 обладает светло-коричневым цветом. Штаммы Drechslera graminea-94 и 95 образуют мицелий светло-серого цвета.

Штаммы Drechslera graminea-93, 94, 95 обладают низкой биохимической активностью. Не ферментируют сахарозу, лактозу, арабинозу, сорбит, рамнозу, дульцит, экскулин, галактозу, маннит, глицерин, мальтозу, не расщепляют крахмал, не восстанавливают нитраты.

Указанные штаммы проявляют хорошо выраженную антагонистическую активность к стафилококку, кишечной палочке, шигелле. Не оказывают антимикробного действия на возбудителей дизентерии (кроме штамма Sh. flexneri-337) и протея. Безвредны для лабораторных животных (белых мышей).

Штамм Drechslera graminea-95 проявил большую жизнеспособность на используемой для приготовления препарата среде.

Препарат грамин, полученный, как описано в примере, из штаммов Drechslera graminea-93, 94, 95 в таблицах условно обозначен номерами штаммов: грамин 93, грамин 94, грамин 95. Как показали исследования препаратов, полученных из указанных выше штаммов, их характеристики полностью совпадают.

Пример. Для получения препарата грамин выращивают чистую культуру продуцирующего гриба Drechslera graminea в пяти чашках Петри на твердой питательной среде Чапека следующего состава,
NaNO₃ 0,2
KH₂PO₄ 0,1
MgSO₄•7H₂O 0,05
Fe₂(SO₄)•7Н₂O 0,001
KCl 0,1
Глюкоза 2,0
Агар 2,0
Вода дистиллированная Остальное
в термостате при T= 26,8^oC в течение 5-6 сут. Для получения инокулята кладут в каждую чашку Петри по 4-5 кусочков проавтоклавированной соломы злаковых культур длиной 5-7 см и выдерживают в термостате еще 3-5 сут при той же температуре. Подготавливают 10 колб, содержащих по 200 мл жидкой питательной среды того же состава, за исключением агара, опускают в них инокулят и культивируют при T=26,8^oC в течение 35-40 сут. Для наработки препарата отделяют мицелий, а культуральную жидкость подвергают фильтрации через фильтровальную бумагу с нанесенным на нее активированным углем. Полученный препарат в количестве 1900 мл фасуют по емкостям, предназначенным для использования, закрывают ватно-марлевыми пробками и проводят стерилизацию в автоклаве 30 мин при P=0,5 атм. Ватно-марлевые пробки заменяют резиновыми и стерильно укупоривают.

Характеристика препарата грамин.

Препарат грамин представляет собой жидкость с легко разбивающимся осадком. При высушивании остается сухой остаток коричневого цвета массой 5-30 мг/мл, хорошо растворим в энтаноле, ацетоне, хлороформе, гексане, слабо растворим в воде.

Содержит,
Общий азот до 0,51
Небелковый азот до 0,36
Фосфор до 0,22
Калий до 0,31
Магний до 0,16
Аминокислоты, мг/мл.

Аспарагиновая 0,034
Треонин 0,016
Серин 0,02
Глутаминовая 0,009
Аланин 0,069
Валин 0,032
Метионин 0,014
Изолейцин 0,024
Лейцин 0,04
Тирозин 0,045
Фенилаланин 0,036
Гистидин 0,047
Лизин 0,013
Аргинин 0,055
Триптофан 0,02
Сумма 0,47
Методом тонкослойной хроматографии в системе растворителя хлороформ-этанол 19:5 на пластинах "Силуфол" установлен показатель Rf (отношение расстояния, пройденного веществом, к расстоянию, пройденному растворителем) равный 1. Характер флуоресценсии при длине волны 254 нм - желто-голубое пятно.

Проведено сравнительное изучение свойств предложенного препарата грамин и известного препарата тимоген на организм белых мышей и двухмесячных телят. Тимоген представляет собой синтетический пептид-глютамил-триптофан.

Влияние грамина и тимогена на фагоцитарную активность крови исследовали на телятах (три группы по 10 голов). Результаты исследований приведены в табл. 1.

В табл. 2 показаны результаты исследований защитного действия грамина и тимогена на организм белых мышей (три группы по 10 мышей), которых через три дня после введения препарата инфицировали культурой Stafilococcus aureus в концентрации 1 млрд, микробных тел в 1 мл.

Влияние препаратов грамин и тимоген на организм белых мышей и телят двухмесячного возраста представлено в табл. 3.

Как видно из табл. 1 и 2 фагоцитарная активность сыворотки крови у телят и защитная функция организма белых мышей повышаются после введения грамина так же, как и после введения тимогена.

Как следует из таблицы 3 увеличение гамма-глобулиновой фракции сыворотки крови как у телят, так и белых мышей наиболее выражено после применения грамина, что свидетельствует о формировании в организме неспецифического иммунитета.

Как видно из приведенных материалов, исследуемые штаммы гриба, в разное время выделенные из природных источников, одинаково хорошо зарекомендовали себя в качестве продуцента препарата грамин. Грамин, полученный согласно заявленному способу, обладает выраженным иммуностимулирующим действием.

Таким образом, предложенный способ получения препарата грамин позволяет получить экологически чистый иммуномодулятор, превосходящий по отдельным иммунологическим показателям известные препараты того же назначения, но с гораздо меньшими затратами сырья, реактивов, оборудования.

Использование: биотехнология, может быть использовано для получения экологически чистых препаратов-иммуномодуляторов, применяемых с целью профилактики и комплексной терапии широкого спектра заболеваний крупного рогатого скота. Сущность изобретения: способ предусматривает выращивание чистой культуры продуцирующего гриба Drechslera graminea, культивирование его на жидкой питательной среде, фильтрацию, расфасовку и стерилизацию фильтрата. 3 табл.

Способ получения препарата иммуномодулятора, предусматривающий выращивание чистой культуры продуцирующего гриба, культивирование его на жидкой питательной среде при 26 28^oС, фильтрацию, отличающийся тем, что осуществляют культивирование продуцирующего гриба Drechslera graminea в течение 35 40 суток, фильтрации подвергают культуральную жидкость, полученную после отделения мицелия, и проводят расфасовку и стерилизацию фильтрата.