СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИКА ДЛЯ ВЕТЕРИНАРИИ Российский патент 1997 года по МПК A61K35/66 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении препаратов пробиотиков для лечения эндометритов, маститов и диспепсий крупного рогатого скота.

Известен способ получения лактобактерина сухого, включающий получение чистых культур Lactobacillus fermenti и Lactobacillus plantarum, внесение их на подготовленную питательную среду, выращивание 8 10 ч при T=37^oC и лиофильное высушивание препарата [1] Лактобактерин используют при лечении желудочно-кишечных заболеваний.

Известен способ получения бификола сухого, включающий получение чистых культур бифидобактерий и кишечной палочки, внесение их на подготовленную питательную среду, выращивание глубинным способом, фасовку взвеси во флаконы, замораживание и высушивание [2] Используют при лечении желудочно-кишечных заболеваний.

Недостатками этих способов являются:
снижение концентрации жизнеспособных микробов до 50% в процессе лиофилизации;
необходимость смешивать препарат с жидкостью перед употреблением;
использование для лечения только желудочно-кишечных заболеваний.

Наиболее близким техническим решением является способ получения препарата биосан, включающий выращивание чистых культур Lactobacillus plantarum и Lactobacillus buchneri, внесение их в колбу на подготовленную соево-печеночную питательную среду и культивирование в термостате 48 ч при T=36-38^oC. В 1 мл биосана должно быть 2,5 3,5 млрд микробных тел. В ветеринарной практике биосан используют для лечения эндометрита и санации матки при искусственном осеменении коров [3]
При совместном культивировании каких-либо микроорганизмов, в том числе при получении препарата биосан, происходит их спонтанный рост и преимущество в наращивании биомассы бывает за теми видами, у которых большая скорость роста, что приводит к потере контроля над концентрацией отдельных культур микроорганизмов и их процентным соотношением. Кроме того, препарат, состоящий из микроорганизмов одного рода, обладает односторонним тропизмом, заключающимся в проявлении антагонизма лишь к части условно-патогенной микрофлоры, следовательно, локализованным воздействием.

Задача, которую необходимо решить, заключается в следующем: разработать такой способ получения пробиотика для применения в ветеринарной практике, который позволит осуществлять достоверный контроль над процентным соотношением и концентрацией микроорганизмов в дозе препарата и получать препарат с широким спектром действия.

В процессе решения задачи разработан способ получения пробиотика ЛЦЛ (по начальным буквам названий препаратов-пробиотиков, в которых содержатся данные виды микроорганизмов: бактисубтил, целлобактерин и лактобактерин), включающий выращивание чистых культур микроорганизмов и культивирование их на питательной среде при T=36 38^oC, причем культивирование микроорганизмов Bacillus subtilis, Rumenococcus albus, Lactobacillus plantarum проводят раздельно в течение 72 ч, а затем смешивают жидкости, содержащие биомассу микроорганизмов, в равных объемах.

Для получения пробиотика БЦЛ выращивают чистые культуры микроорганизмов Bacillus subtilis, Rumenococcus albus, Lactobacillus plantarum на скошенном мясо-петонном агаре (МПА) с добавлением 1% глюкозы в термостате при T=37^oC±1 в течение 48 ч. Для получения жидкой питательной среды берут свежую печень крупного рогатого скота, разрезают на куски размером не более 5х5х5 см, взвешивают, заливают равным по весу количеством водопроводной воды и варят в течение часа. Полученный экстракт фильтруют через ватно-марлевый фильтр, смешивают с соевым гидролизатом в соотношении 1:3, добавляют 0,5% NaCl, 2% глюкозы, кипятят 15 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в емкости, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. В охлажденную до комнатной температуры жидкую питательную среду с МПА бактериологической петлей вносят чистые культуры Bacillus subtilis, Rumenococcus albus, Lactobacillus plantarum, каждую в отдельную емкость, и культивируют в термостате при T=37^oC±1 в течение 72 ч.

Количество выросших микроорганизмов определяют путем сравнения со стандартом мутности. Концентрация микроорганизмов в каждом случае должна быть не менее 2,5 млрд в 1 мл. Смешивают культуральные жидкости, содержащие биомассу микроорганизмов, в равных объемах и расфасовывают препарат БЦЛ по емкостям, предназначенным для использования.

При проведении работ по изготовлению препарата необходимо соблюдать установленные правила асептики и антисептики.

Хранение препарата осуществляют в холодильнике при T=+5.+10^oC в течение шести месяцев.

Пример 1.

Для получения пробиотика БЦЛ приготавливают чистые культуры микроорганизмов Bacillus subtilis 534, Rumenococcus albus 1-33, Lactobacillus plantarum 8p-A3. Для этого каждую культуру выращивают в термостате при T=37^oC на скошенном мясо-пептонном агаре с добавлением 1% глюкозы.

Для культивирования микроорганизмов готовят соево-печеночную среду, которая состоит из трех частей соевого гидролизата и одной части печеночного бульона. Соевый гидролизат приготавливают следующим образом: 80 г соевых шротов заливают двумя литрами водопроводной воды, добавляют 3% соляной кислоты с удельным весом 1,19, автоклавируют при 127^oC и 1,5 атм в течение трех часов. После охлаждения массу фильтруют через вату, а затем через бумажный фильтр с нанесенным на него активированным углем. Добавляют едкий натр до достижения pH= 6,0 и буфер K₂HPO₄ 0,18% и KH₂PO₄ - 0,8% Печеночный бульон готовят общепринятым способом: 0,5 кг печени крупного рогатого скота нарезают кусками не более 5х5х5 см, помещают в эмалированную кастрюлю, заливают одним литром воды и кипятят 1 ч, бульон охлаждают, фильтруют через вату, добавляют едкий натр до достижения pH=6,0. Объединяют 1,5 л соевого гидролизата и 0,5 л печеночного бульона, вносят 0,5% NaCl и 2% глюкозы, что составляет 10 г и 40 г соответственно, разливают во флаконы емкостью 200 мл и автоклавируют 30 мин при 0,5 атм. Соево-печеночную среду охлаждают до 35 38^oC и вносят чистые культуры микроорганизмов каждую в отдельный флакон бактериологической петлей (один соскоб с МПА на один флакон). Культивируют в термостате при T=37^oC±1 в течение 72 ч. Концентрация микроорганизмов после выращивания в каждом случае не менее 2,5 млрд в 1 мл. Культуральные жидкости, содержащие биомассу Bacillus subtilis 534, Rumenococcus albus 1-33, Lactobacillus plantarum 8p-A3 смешивают в соотношении 1:1:1.

При хранении полученного препарата БЦЛ происходит изменение концентрации микроорганизмов, поскольку составляющие его микроорганизмы обладают разными свойствами, в частности скоростью роста.

Изменение концентрации микроорганизмов в зависимости от срока хранения представлено в табл. 1.

Проведено сравнительное изучение лечебного эффекта пробиотика БЦЛ путем использования его для терапии эндометритов и маститов у коров и диспепсий у телят в разные сроки периода хранения. Введение препарата осуществлялось внутриматочно, интрацистернально и перорально. Результаты исследований приведены в табл. 2.

Пример 2.

Получение пробиотика БЦЛ осуществляют, как описано в примере 1, за исключением того, что смешивание культуральных жидкостей, содержащих биомассы B. subtilis 534, R. albus 1-33, L. plantarum 8p-A3, производят в соотношении 2:1:3.

Изменение концентрации микроорганизмов в зависимости от срока хранения представлено в табл. 1.

Результаты исследований лечебного эффекта препарата БЦЛ приведены в табл. 2.

Пример 3.

Получение пробиотика БЦЛ осуществляют, как описано в примере 1, за исключением того, что смешивание культуральных жидкостей, содержащих биомассы B. subtilis 534, R. albus 1-33, L. plantarum 8p-A3, производят в соотношении 1:1:2.

Изменение концентрации микроорганизмов в зависимости от срока хранения представлено в табл. 1.

Результаты исследований лечебного эффекта препарата БЦЛ приведены в табл. 2.

Пример 4.

Получение пробиотика осуществляют, как описано в примере 1, за исключением того, что чистые культуры B. subtilis 534, R. albus 1-33, L. plantarum 8p-A3 бактериологической петлей (один соскоб с культуры) вносят в одну емкость с соево-питательной средой и культивируют при T=37^oC±1 в течение 72 ч. Полученную культуральную жидкость с биомассой микроорганизмов расфасовывают во флаконы, предназначенные для использования.

Изменение концентрации микроорганизмов в зависимости от срока хранения представлено в табл. 1.

Результаты исследований лечебного эффекта препарата БЦЛ приведены в табл. 2.

В каждом примере общая концентрация микроорганизмов при хранении в течение 90 суток уменьшается с 9 10 млрд в 1 мл до 4 5 млрд в 1 мл.

Как видно из табл. 1 и 2, препарат, полученный в примере 1, содержит оптимальную концентрацию микроорганизмов и обладает самой высокой общей терапевтической эффективностью.

Терапевтическая эффективность при лечении острого эндометрита в примере 2, мастита в примере 3, а также острого эндометрита в примере 4 недостаточна.

Таким образом, предложенный способ приготовления препарата БЦЛ обладает рядом преимуществ по сравнению с существующими. В результате осуществления контроля над соотношением и концентрацией микроорганизмов достигаются широкий спектр действия препарата и высокий терапевтический эффект. Кроме того, способ предусматривает приготовление и использование экологически чистого лечебного препарата пробиотика.

Использование: биотехнология, для получения препарата - пробиотика для лечения эндометритов, маститов и диспепсий крупного рогатого скота. Сущность изобретения: способ предусматривает выращивание чистых культур Bacillus subtilis, Rumenococcus albus, Lactobacillus plantarum, дальнейшее раздельное культивирование на жидкой соево-печеночной среде в течение 72 ч, смешивание культуральных жидкостей, содержащих биомассу микроорганизмов, в равных объемах. 2 табл.

Способ получения пробиотика для ветеринарии, предусматривающий выращивание лактобактерий и культивирование на соево-печеночной среде в термостате при температуре 36 38^oС, отличающийся тем, что дополнительно выращивают чистые культуры Bacillus subtilis, Ruminococcus albus, из лактобактерий используют Lactobacillus plantarum, культивирование проводят раздельно в течение 72 ч, после чего полученные культуральные жидкости смешивают в равных количествах.