Штамм актиномицета Streptomyces antimycoticus 8А13, обладающий способностью подавлять фитопатогенные грибы, бактерии, стимулировать рост растений и осуществлять деструкцию целлюлозосодержащих субстратов Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 A01N63/28 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии и предназначено для защиты растений от комплекса фитопатогенов, увеличения урожайности сельскохозяйственных растений и улучшения фитосанитарного состояния почвы в агроценозах за счет деструкции целлюлозосодержащих корневых и пожнивных остатков.

В последнее время резко возросло распространение токсиногенных грибов – возбудителей болезней сельскохозяйственных культур. Вызываемые грибами заболевания приводят к потере более 40% урожая зерновых [Logrieco A., Rizzo A., Ferracane R., Ritieni A. Occurrence of beauvericin and enniatins in wheat affected by Fusarium avenaceum head blight // Appl. Environ. Microb. – 2002 –V.68(1). – P. 82-85 doi: 10.1128/AEM.68.1.82-85.2002]. Ситуация ухудшается из-за развития устойчивости грибов к химическим фунгицидам с последующей необходимостью увеличения дозы применения препаратов. В связи с этим для создания эффективных, экологически безопасных фунгицидов с разными механизмами действия особое значение приобрело использование микроорганизмов и их вторичных метаболитов [Павлюшин В.А., Новикова И.И., Бойкова И.В. Микробиологическая защита растений в технологиях фитосанитарной оптимизации агроэкосистем: теория и практика (обзор) // Сельскохозяйственная биология. – 2020. – Т. 55. – №. 3. – С. 421-438].

Микроорганизмы-продуценты вторичных метаболитов являются богатым источником для разработки биофунгицидов благодаря высокой изменчивости химической структуры микробных метаболитов и связанному с этим разнообразию биологической активности, которая все еще превосходит возможности органического синтеза химических соединений. Хорошо известны как продуценты антифунгальных метаболитов многие представители актиномицетов, включая виды р. Streptomyces [Дегтярева Е.А., Виноградова К.А., Александрова А.В., Филоненко В.А., Кожевин П.А. Почвенные актиномицеты как потенциальные биофунгициды // Вестник Московского университета. Серия 17. Почвоведение. – 2009.– №2– С. 22-26; Han C., Yu Z., Zhang Y., Wang Z., Zhao J., Huang S-X., Ma Z., Wen Z., Liu C., Xiang W. Discovery of frenolicin B as potential agrochemical fungicide for controlling fusarium head blight on wheat // J. Agric. Food Chem.– 2021.–V. 69. – P. 2108–2117]. Актиномицеты способны также стимулировать рост растений [Vurukonda S. S. K. P., Giovanardi D., Stefani E. Plant growth promoting and biocontrol activity of Streptomyces spp. as endophytes //International journal of molecular sciences. – 2018. – V. 19. – №. 4. – P. 952; Elshafie H. S., Camele I. Rhizospheric actinomycetes revealed antifungal and plant-growth-promoting activities under controlled environment // Plants. – 2022. – V. 11. – №. 14. – P. 1872.] и оздоравливать почву, разлагая инфицированные фитопатогенами корневые и пожнивные остатки [Nguyen B. L., Hoang A. T. P. Screening of Cellulolytic Actinomycetes for Decomposition of Agricultural Waste // CET Journal-Chemical Engineering Transactions. – 2020. – V. 78. – P. 283-288]. Поиск и выявление среди актиномицетов новых штаммов-продуцентов антибиотиков и других ценных метаболитов сохраняет свое значение как источник для разработки средств борьбы с болезнями растений и повышения их продуктивности.

Известен подавляющий рост возбудителей болезней зерновых культур штамм Streptomyces sp. К-541 [Треножникова Л. П., Балгимбаева А. С., Ултанбекова Г. Д., Галимбаева Р. Ш. Антифунгальная активность против патогенов зерновых культур и изучение антибиотика штамма Streptomyces sp. К-541, выделенного из экстремальных экосистем Казахстана // Сельскохозяйственная биология. – 2018. – Т. –53(1). С. 96-102].

Недостатками данного штамма являются отсутствие ростстимулирующих свойств, а также способности продуцировать целлюлолитические ферменты, которые благодаря деструкции корневых и пожнивных остатков сокращают пул почвенных инфекций.

Описан штамм Streptomyces carpaticus К-1 для защиты от насекомых-вредителей, грибных, вирусных болезней и стимуляции роста томатов [Пат. № 2695157 РФ. Григорян Л.Н., Батаева Ю.В., Шляхов В.А., Дзержинская И.С. 2019. Штамм Streptomyces carpaticus для защиты от насекомых-вредителей, грибных, вирусных болезней и стимуляции роста томатов. Заявл. 13.04.2018; опубл. 22.07.2019; Бюл. № 21].

Недостатками данного штамма являются узкая направленность фитостимулирующего действия, ограниченная одной культурой – томаты, отсутствие активности в отношении возбудителей бактериальных заболеваний и способности к деструкции целлюлозосодержащих субстратов.

Наиболее близким к предлагаемому штамму (прототипом) является штамм Streptomyces chrysomallus р-21, обладающий широким спектром действия в отношении фитопатогенных грибов и высокой фиторегуляторной активностью [Пат. № RU 2226214, Новикова И.И., Бойкова И.В. Штамм актиномицета Streptomyces chrysomallus P-21 для получения биопрепарата полифункционального действия. Заявитель ВИЗР. Заявл. 02.07.2002, опубл. 27.03.2004. – 4 с.].

Недостатком указанного штамма является отсутствие у него целлюлазной активности, способствующей разложению в почве корневых и пожнивных остатков как субстратов сосредоточения почвенных инфекций и улучшению фитосанитарного состояния почвы.

Технической задачей изобретения является выделение штамма с комплексом хозяйственно-ценных свойств, обладающего одновременно фунгицидными и бактерицидными свойствами, фитостимулирующим действием и целлюлазной активностью.

Сущность изобретения заключается в получении штамма Streptomyces antimycoticus 8А13, депонированного в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) под номером RCAM06766, обладающего высокой антагонистической активностью против комплекса фитопатогенных грибов и бактерий, стимулирующего рост зерновых, бобовых и луковых культур, способного к деструкции целлюлозосодержащих субстратов.

Технический результат от использования изобретения достигается тем, что в качестве средства для защиты и стимуляции роста растений, улучшения фитосанитарного состояния почвы предлагается штамм Streptomyces antimycoticus 8А13.

Способ получения штамма

Штамм Streptomyces antimycoticus 8А13 выделен из дерново-подзолистой ризосферной почвы при высеве на питательную среду (казеин-глицериновый агар) и, в последующем, в чистую культуру методом последовательных пересевов по общепринятой методике [Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии: учеб. пособие для высших учеб. заведений / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук [и др.]; под ред. А.И. Нетрусова. – М.: Академия, 2005. - 352 с.]. Культура идентифицирована методом полифазной таксономии с использованием ключа Гаузе [Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А., Терехова Л.П., Максимова Т.С. Определитель актиномицетов. Роды Streptomyces, Streptoverticillium, Chainia. М.: Наука, 1983. 248 с.] и данных секвенирования фрагмента гена 16S рРНК. По результатам выполненного в НПЦ «Синтол» (г. Москва) анализа полученной последовательности (993 п.н.) штамм 8Аl3 наиболее близок к виду Streptomyces antimycoticus и имеет сходные с ним фенотипические признаки.

Штамм S. antimycoticus 8Аl3 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки

На минеральном агаре Гаузе 1, глицерин-нитратном и овсяном агаре штамм образует плотные округлые уплощенные колонии с волнистыми краями. Воздушный мицелий бархатистый, обильный или умеренно обильный, белый до светло-серого, со временем становится серым (фиг. 1), иногда с темными ослизненными пятнами (склонен к автолизу). Субстратный мицелий бесцветный, растворимых пигментов нет, меланоидные пигменты на пептон-дрожжевом агаре с железом не образуются.

Воздушный мицелий обильно-разветвленный (диаметр гиф 0,5-1,5 мкм). Цепочки спор в виде крючков, петель, коротких неправильных спиралей (RA) (фиг. 2). Склероции и спорангии не выявлены.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм является аэробом, способен переносить концентрацию NaCl не более 3,0% и рН среды в пределах 5,0-9,0 ед. Растет при 19-38°С. Температурный оптимум – 28-37°C; гидролизует казеин, крахмал, карбоксиметилцеллюлозу; в качестве единственного источника углерода использует глюкозу, лактозу, ксилозу, манит, сахарозу, фруктозу, не использует арабинозу. Чувствителен к антибиотикам: полимиксин (300 ед.), тетрациклин (1,25/23,75 мкг), амоксициллин (20 мкг), тетрациклин (30 мкг), азитромицин (15 мкг), налидиксовая кислота (30 мкг), устойчив к рифампицину (5 мкг). Продуцирует в присутствии 100 мг/л L-триптофана индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) в количестве 18,5 мкг/мл. Штамм способен к синтезу экзоцеллюлаз, активно разлагает целлюлозу, входящую в состав фильтровальной бумаги, используемой при культивировании чистой культуры на твердой питательной среде Гетчинсона. При этом происходит нарушение структуры волокон целлюлозы, это отчетливо видно на снимке, сделанном с помощью микроскопа (фиг. 3).

Активность целлюлазы в жидкой минеральной среде с измельченой соломой в качестве единственного источника углерода, определяемая согласно [Miller G.L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar // Analytical chemistry. ─ 1959. ─ V. 31. - №3. - P. 426-442] составляет 3782,3±196,49 усл. ед./10 мин. За условную единицу активности принято такое количество фермента, при действии которого на субстрат в условиях ферментативной реакции за 1 час образуется 1 μмоль редуцирующих сахаров в пересчете на глюкозный эквивалент.

Генетические особенности штамма: штамм не нуждается в факторах роста, стабилен и не является генетически модифицированным, поскольку выделен из естественных условий.

Условия культивирования

Штамм хорошо растет на минеральной среде Гаузе 1 (г/л): крахмал – 20; K₂HPO₄ –0,5; KNO₃ – 1,0; MgSO₄ – 0,5; NaCl – 0,5; агар-агар – 20; вода дистиллированная – 1000 мл; рН - 7,0-7,4.

Для наращивания биомассы штамм культивируют при температуре 28°С на жидкой овсяной среде в течение 5-7 суток на качалке (120 об/мин).

Хранение штамма

Культура Streptomyces antimycoticus 8А13 поддерживается на косяках с овсяным агаром (г/л): овсяные хлопья – 20,0; агар-агар микробиологический – 20,0; водопроводная вода до 1,0 л, pH 7,0-7,4. Для хранения штамма используют метод периодических пересевов (4-6 раз в год). Культивирование на овсяном агаре после пересева ведут при температуре 28°С в течение 7-10 дней. Затем культуру хранят под минеральным маслом в холодильнике при температуре +4°С.

Длительное хранение штамма Streptomyces antimycoticus 8А13 может быть обеспечено на овсяной среде, без применения криопротекторов, при температуре –80°С, скорость замораживания 3,5°С/мин.

Штамм хранится в рабочей коллекции лаборатории биотехнологии растений и микроорганизмов ФГБНУ ФАНЦ Северо-Востока, а также в Ведомственной коллекции сельскохозяйственного назначения (RCAM) – ФГБНУ ВНИИСХМ.

Основными критериями отбора штамма служили подавление роста фитопатогенных грибов и бактерий, положительное влияние на рост растений, синтез ауксинов, продукция целлюлазы.

Предлагаемый штамм Streptomyces antimycoticus 8А13 отличается от штамма-прототипа Streptomyces chrysomallus р-21 более широким спектром действия на фитопатогенные микроорганизмы, стимуляцией роста широкого круга таксономически различных растений (зерновые злаки, бобовые, луковые), способностью осуществлять деструкцию целлюлозосодержащих материалов.

Область применения штамма – может использоваться в сельском хозяйстве.

Более подробно сущность описываемого изобретения раскрывается в приведенных ниже примерах.

Пример 1. Исследование фунгицидных свойств штамма S. antimycoticus 8Al3 в лабораторных условиях

Фунгицидные свойства штамма S. antimycoticus 8Al3 в отношении возбудителей вредоносных грибных заболеваний определяли методом агаровых блоков на среде Чапека (г/л): сахароза – 20; NaNO₃ – 2,0; KH₂PO₄ – 1,0; MgSО₄×7H₂O – 0,5; KCl – 0,05; FeSО₄ – 0,01; агар-агар – 20; вода дистиллированная – 1000 мл; рН – 5,0-5,2. После культивирования штамма S. antimycoticus 8Al3 на овсяном агаре в течение 5 сут, вырезали блоки растущей культуры пробочным сверлом (диаметр 6 мм), переносили их в чашки Петри на среду Чапека, предварительно засеянную тест-культурами фитопатогенных грибов Bipolaris sorokiniana, Alternaria alternate, Fusarium moniliforum, F. avenaceum, F. oxysporum, F. culmorum, F. proliferatum, Parastagonospora nodorum, и культивировали при 28°С. Об антагонистической активности судили по диаметру зоны ингибирования роста тест-культур, которую измеряли через 72 час культивирования.

Результаты представлены в таблице 1.

Табл. 1. Величина зон задержки роста фитопатогенных грибов под влиянием штамма S. antimycoticus 8Al3

Тест-культуры грибов Диаметр зон ингибирования роста, мм Контроль 0 Fusarium avenaceum 45±1,6 F. oxysporum 33±2,6 F. moniliforum 40±1,2 F. culmorum 40±3,6 F. proliferatum 26±0,6 Alternaria alternata 38±0,9 Bipolaris sorokiniana 45±1,3 Parastagonospora nodorum 54 ±1,7

Анализ полученных данных показал высокую фунгицидную активность штамма S. antimycoticus 8Al3. Спектр зон подавления роста фитопатогенных грибов колеблется в пределах от 26±0,6 до 54±1,7 мм. Наиболее значительные зоны задержки роста отмечены в отношении возбудителя септориоза пшеницы P. nodorum (54 мм), возбудителей корневых гнилей Fusarium avenaceum (45 мм) и Bipolaris sorokiniana (45 мм).

Пример 2. Исследование антибактериальной активности штамма S. antimycoticus 8Al3 в лабораторных условиях

Антагонистическую активность штамма S. antimycoticus 8Al3 в отношении бактерий-возбудителей семенных инфекций определяли методом агаровых блоков на среде RHM следующего состава (г/л): KH₂P0₄ – 0,4; K₂HP0₄ – 0,1; MgS0₄ – 0,2; NaCl – 0,1; CaCl₂ – 0,02; FeCI₃ – 0,01; Na₂Mo0₄ – 0,002; сахароза – 1; глюкоза – 1; дрожжевой экстракт – 1; pH = 6,2. После культивирования штамма S. antimycoticus 8Al3 на овсяном агаре в течение 5 сут, вырезали блоки растущей культуры пробочным сверлом (диаметр 6 мм), переносили их в чашки Петри на среду RHM, предварительно засеянную тест-бактериями Curtobacterium flaccumfaciens, Bacillus aryabhattai, Bacillus sp., Erwinia rhapontici. Об антагонистической активности судили по диаметру зон ингибирования роста тест-культур бактерий, которую измеряли через 24 час культивирования при 28°С.

В таблице 2 указан диаметр зон задержки роста тест-бактерий исследуемым штаммом.

Табл. 2. Величина зон задержки роста бактерий-возбудителей семенной инфекции

под влиянием штамма S. antimycoticus 8Al3

Тест-бактерии Диаметр зон ингибирования роста, мм Bacillus aryabhattai 31±3,5 Bacillus sp. 32±2 Curtobacterium flaccumfaciens 40±1,0 Erwinia rhapontici 22±1,0

Наиболее значительно S. antimycoticus 8Al3 угнетал рост Curtobacterium flaccumfaciens (40 мм) – возбудителя бактериального увядания фасоли, гороха, сои и некоторых других бобовых культур. В результате проведенного анализа установлено, что штамм S. antimycoticus 8Al3, наряду с фунгицидным действием, обладает бактерицидной активностью.

Пример 3. Сравнительная оценка эффективности штамма S. antimycoticus 8Аl3 и коммерческих биопрепаратов против фитопатогенных грибов в лабораторных условиях

Проведена оценка эффективности жидкой культуры (ЖК) S. antimycoticus 8Аl3 и коммерческих биопрепаратов: Алирин Б (Bacillus subtilis 10-ВИЗР, титр не менее 10¹¹ живых спор и клеток/г), Фитолавин (комплекс стрептотрициновых антибиотиков, продуцируемых почвенными грибами), Фитоспорин-М (Bacillus subtilis 26Д, титр не менее 2×10⁹ живых спор и клеток/ г), против фитопатогенных грибов F. proliferatum, F. moniliforme, Alternaria sp. Растворы биопрепаратов готовили согласно инструкции (на 100 мл стерильной дистиллированной воды добавляли 1 таб. Алирина Б; 0,20 г Фитолавина; 0,15 г Фитоспорина). S. antimycoticus 8Аl3 предварительно выращивали на жидкой питательной среде Гаузе 1 в течение семи суток до плотности суспензии 3×10⁴ колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл.

В чашку Петри вносили по 0,1 мл споровой суспензии одного из грибов, заливали агаризованной питательной средой Чапека. После застывания среды на поверхности агара на равном расстоянии друг от друга и стенок чашки размещали по 4 стерильных диска из фильтровальной бумаги диаметром 5 мм и наносили на них по 10 мкл: 1) ЖК S. antimycoticus 8Аl3 и биопрепаратов: 2) Алирин Б, 3) Фитолавин, 4) Фитоспорин-М. Для каждого гриба использовали три повторения. Чашки инкубировали при 28°С, об эффективности действия судили по диаметру зон ингибирования роста тест-грибов, которую измеряли через 72 час культивирования.

Результаты эксперимента представлены в таблице 3.

Табл. 3. Величина зон ингибирования роста фитопатогенных грибов ЖК штамма S. antimycoticus 8Al3 и коммерческими биопрепаратами

Вариант Диаметр зон ингибирования роста грибов, мм F. moniliforum F. proliferatum Alternaria sp. ЖК S. antimycoticus 8Al3 20,3±0,6 20±0 27,3±0,6 Алирин Б 11,7±0,6 14,7±1,2 24,3±1,2 Фитолавин 0 0 0 Фитоспорин 0 0 20,7±1,5

В результате проведенного эксперимента выявлена чувствительность грибов F. proliferatum, F. moniliforme и Alternaria sp. к S. antimycoticus 8Аl3 и алирину Б. Зоны угнетения роста грибов в случае с S. antimycoticus 8Al3 были существенно больше (от 20±0 до 27,3±0,6 мм), чем в случае с алирином Б (от 11,7±0,6 до 24,3±1,2 мм). Фитоспорин угнетал рост только одного гриба – Alternaria sp., а Фитолавин не оказал ингибирующего действия на рост взятых в опыт тест-грибов (фиг. 4).

Полученные данные говорят о более высокой эффективности штамма S. antimycoticus 8Аl3 в подавлении роста фитопатогенных грибов в сравнении с коммерческими биопрепаратами Алирин Б, Фитолавин, Фитоспорин.

Пример 4. Исследование фитотоксичности и фитостимуляции штамма S. antimycoticus 8Аl3 в лабораторных условиях

Для исследования фитотоксического действия S. antimycoticus 8Аl3 использовали жидкую культуру с титром 4,5×10⁶ КОЕ/мл. Штамм стрептомицета выращивали в жидкой овсяной среде на качалке (120 об/мин) при 20±2°С в течение пяти суток.

В качестве тест-культур использовали семена таксономически различных сельскохозяйственных растений: пшеницу яровую (Triticum aestivum L.), клевер паннонский (Trifolium pannonicum L.), горчицу сарептскую (Brassica juncea L.). Семена замачивали на 20 час в жидкой культуре. Контролем служили семена, замоченные в стерильной воде. По завершении обработки семена помещали между листами (пшеница) или на поверхности (клевер, горчица) увлажненной фильтровальной бумаги и проращивали в водно-бумажной культуре при 20±2°С, в течение 6 сут при фотопериоде 16 час и освещенности 7 кЛк. Повторность в опытах с пшеницей – 100 (4 рулона по 25 семян), в опытах с клевером и горчицей – 80 (4 чашки Петри по 20 семян). Учитывали всхожесть, линейные размеры и воздушно-сухую биомассу проростков.

Результаты представлены в таблице 4.

Табл. 4. Всхожесть и морфометрические показатели растений в зависимости от обработки штаммом S. antimycoticus 8Аl3 в лабораторных условиях

Вариант опыта Всхожесть, % Биомасса, г Высота побега, см Длина корня, см Пшеница яровая Контроль 57±18,0 0,20±0,04 7,0±0,46 12,5±0,22 Обработка штаммом 71±6,0 0,29±0,01 7,5±0,79 12,5±0,59 Клевер паннонский Контроль 64±10,3 0,03±0,01 1,2±0,28 1,5±0,38 Обработка штаммом 80±8,2 0,05±0,01 1,2±0,14 2,0±0,33 Горчица сарептская Контроль 43±3,83 0,05±0,01 2,9±0,51 2,5±0,68 Обработка штаммом 61±5,66 0,07±0,01 2,3±0,45 1,4±0,23

Анализ полученных данных показал, что штамм S. antimycoticus 8Аl3 не токсичен для проростков зерновой, бобовой и крестоцветной культур. Всхожесть обработанных семян была в зависимости от культуры на 14-18% выше, чем в контроле. Биомасса и линейные размеры проростков в результате обработки семян жидкой культурой стрептомицета достоверно не отличались от контроля.

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии у S. antimycoticus 8А1-3 фитотоксического действия, а также демонстрируют способность штамма стимулировать прорастание семян таксономически различных культур.

Пример 5. Исследование фиторегуляторного действия штамма S. antimycoticus 8Аl3 в лабораторных условиях на горохе

Пораженные бактериальной инфекцией семена зернобобовой культуры – гороха (Pisum sativum L.) замачивали в жидкой культуре (ЖК) S. antimycoticus 8Аl3 с титром 5×10⁶ КОЕ/мл на 20 час, после чего проращивали их в рулонной водно-бумажной культуре при 20±2°С в течение 6 суток. В контроле семена замачивали в стерильной воде. В каждом варианте опыта закладывали в рулоны в четырех повторениях по 20 шт. (всего по 80 шт.) семян гороха сортов Вита и Е-483. Учитывали всхожесть, линейные размеры и воздушно-сухую биомассу проростков.

Результаты представлены в таблице 5.

Табл. 5. Всхожесть и морфометрические показатели проростков гороха в зависимости от обработки штаммом S. antimycoticus 8Аl3 в лабораторных условиях

Вариант Длина корня, мм Высота проростка, мм Биомасса, г Всхожесть, % сорт Е-483 Контроль 65,9±2,86 38,74±1,09 0,30±0,02 82,57±2,89 Обработка штаммом 99,65±6,70 53,66±6,09 0,56±0,05 90,0±7,07 сорт Вита Контроль 61,66±5,42 18,53±2,53 0,33±6,05 81,25±4,79 Обработка штаммом 109,88±6,92 28,2±1,28 0,56±0,02 96,25±2,5

Результаты эксперимента показали, что обработка ЖК S. antimycoticus 8Аl3 оказала на пораженные бактериями семена гороха стимулирующее действие. Всхожесть пораженных бактериозами семян гороха повысилась по сравнению с контролем у сортов Е-483 и Вита соответственно на 9,0 и 18,5%, биомасса проростков в вариантах с обработкой семян была выше на 86,7 и 69,7%, высота побегов – на 38,5 и 53,2%, длина корня – на 51,2 и 78,2%, чем у контрольных растений.

Полученные в опыте данные демонстрируют способность штамма S. antimycoticus 8Аl3 стимулировать рост пораженного бактериозом гороха, очевидно, за счет ограничения развития семенной инфекции, в сравнении с необработанным контролем.

Пример 6. Исследование применения штамма S. antimycoticus 8Al3 для защиты от грибных болезней в условиях полевого опыта на растениях гороха

Исследования проведены на Фаленской селекционной станции – Филиале ФАНЦ Северо-Востока. Почва опытного поля дерново-подзолистая среднесуглинистая, рН_KCl 4,3, содержание подвижного фосфора 296 мг/кг почвы, обменного калия 123 мг/кг. Минеральные удобрения внесены под культивацию в дозе NPK (36:36:18 кг д.в./га).

Сорта гороха Фалёнский юбилейный, Фалёнский усатый, Е-483 высевались ручным способом, гнездовым методом, площадь делянки 0,49 м², в трёх повторениях. Размещение делянок рендомизированное [Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований) // 5-е изд., доп. и перераб. – М.: АГРОПромиздат, 1985 – 351 с.]. Учёт поражения посевов болезнями производили согласно методике, с использованием показателей «развитие» и «распространение болезни» [Овчинникова А.М., Андрюхина Р.М., Азарова Е.Ф. Методы ускоренной оценки селекционного материала гороха на инфекционных и провокационных фонах (Методические рекомендации). 1990. – М. – 23 с.].

Предпосевную обработку семян производили ЖК S. antimycoticus 8А13 с титром 5,0×10⁷ из расчета 1 л/т семян. В качестве препаратов сравнения использовали химический фунгицид Пионер, кс и биопрепарат Псевдобактерин-2, расход препаратов – в соответствии с инструкциями производителей.

Результаты опыта приведены в таблице 6.

Табл. 6. Поражение гороха грибными заболеваниями в зависимости от предпосевной обработки семян штаммом S. antimycoticus 8А13 и коммерческими препаратами (среднее по трём сортам)

Вариант обработки Корневые гнили Фузариозное увядание Аскохитоз 1 2 1 2 бобы листья 1 2 1 2 Контроль (вода) 38,44 94,64 18,83 48,52 12,88 45,93 10,1 48,87 Обработка штаммом 8Аl3 28,97* 85,97* 10,45* 28,80* 12,22 39,26 7,26* 34,08* Препараты сравнения: Пионер 38,51 92,95 15,14* 40,22 5,33* 22,21* 6,52* 30,36* Псевдобактерин-2 35,08 91,38 12,27* 30,52 11,93 41,11 7,92 37,40* HCP _0,95 3,46 3,32 3,62 8,42 3,5 8,68 1,84 8,62

Примечания: 1 – развитие болезни, %; 2 – распространение болезни, %

* – различия с контролем значимы при р≥095.

Фитопатологическая оценка в год проведения исследований выявила в посевах гороха поражение растений корневыми гнилями, фузариозом и аскохитозом. Обработка семян штаммом S. antimycoticus 8А13 снизила на 6,1-9,5% развитие и на 5,4-8,67% распространение корневых гнилей в посевах гороха по сравнению с контролем и вариантами с химическим фунгицидом Пионер и коммерческим биопрепаратом Псевдобактерин-2. Предпосевная обработка семян S. antimycoticus 8А13 способствовала также защите гороха от фузариозного увядания. Развитие и распространение болезни уменьшились соответственно на 8,43 и 19,72% по сравнению с контролем. Применение штамма S. antimycoticus 8А13 снизило на 2,84% развитие и на 14,8% распространение в посевах гороха аскохитоза листьев.

Полученные результаты свидетельствуют о способности штамма Streptomyces antimycoticus 8Al3 достоверно снижать в полевых условиях поражение гороха корневыми гнилями, фузариозом и аскохитозом. По эффективности защитного действия в отношении фузариозного увядания и аскохитоза листьев штамм сопоставим с химическим фунгицидом Пионер и Псевдобактерином-2, а в отношении корневых гнилей –превосходит коммерческие препараты по эффективности.

Пример 7. Исследование применения штамма S. antimycoticus 8Al3 для стимуляции роста и повышения урожайности в условиях полевого опыта на растениях чеснока

Исследования проведены в полевом микроделяночном опыте ООО научно-производственной фирмы «Агросемтомс» (г. Киров) на дерново-подзолистой почве. Изучали влияние предпосевной обработки штаммом S. antimycoticus 8Al3 на показатели роста, развития и урожайность ярового чеснока сорта Мотовский. Площадь делянки 0,3 м². Схема посадки 30×10 см, повторность четырехкратная. Суспензию клеток S. antimycoticus 8Al3 с титром 10⁵ КОЕ/мл получали при культивировании в жидкой овсяной среде в течение 5 сут на качалке (120 об/мин). Зубки чеснока перед посадкой в почву замачивали в течение 30 мин. Препаратами сравнения служили химический фунгицид контактного действия Максим Дачник, КС (флудиоксонил – 25 г/л), Syngenta AG (Швейцария) и натуральный гуминовый регулятор роста Росток, производства НПЦ «Эврика». Предпосадочную обработку производили путем замачивания зубков в растворах препаратов с концентрациями, рекомендованными производителями. В контрольном варианте предпосадочную обработку зубков производили водой. Продолжительность вегетационного периода от всходов до уборки во всех вариантах опыта составила 81 сутки.

Результаты представлены в таблице 7.

Табл. 7. Ростстимулирующая активность штамма S. antimycoticus 8Al3 в отношении растений чеснока в полевых условиях

Вариант обработки Число листьев, шт./длина*/ширина* Масса луковицы, г Урожай, кг/м² Прибавка урожая к контролю, % Контроль 8,1/39,6/19,4 28,1±4,1 0,928±0,156 - Обработка штаммом
S. antimycoticus 8Al3 8,5/46,1/23,1 36,4±3,9 1,169±0,128 26,0 % Препараты сравнения: Росток 0,1 % 8,6/43,1/22,5 33,9±2,8 1,089±0,106 17,3 % Максим Дачник (флудиоксонил - 25г/л) 9,2/48,1/24,7 35,1±3,5 1,129±0,112 21,6 %

Примечание: * Длина (см) и ширина (мм) наибольшего листа.

В результате предпосадочной обработки зубков чеснока клеточной суспензией S. antimycoticus 8Al3 отмечены значимые различия в формировании у растений фотосинтетического аппарата. Средние значения числа листьев, их длины и ширины увеличились по сравнению с контролем на 0,4 шт., 6,5 см и 3,7 мм соответственно. Масса луковицы увеличилась в среднем на 8,3 г, а сбор урожая возрос на 26% по сравнению с контролем. Значимых различий между вариантами с обработкой штаммом S. antimycoticus 8Al3 и препаратами сравнения не выявлено.

Полученные данные свидетельствуют, что ростстимулирующее и защитное действие штамма S. antimycoticus 8Al3 сопоставимы с действием коммерческих препаратов – гуминового регулятора роста и адаптогена Росток и химического фунгицида Максим Дачник. Это демонстрирует полифункциональный характер действия штамма, а также его пригодность к применению на луковых культурах.

Пример 8. Исследование применения штамма S. antimycoticus 8Al3 для стимуляции роста и повышения урожайности в условиях полевого опыта на растениях лука шалота

Эксперимент проводили в лаборатории овощеводства ФГБНУ ФАНЦ Северо-Востока на дерново-подзолистой почве опытного поля. Изучали влияние обработки штаммом S. antimycoticus 8Al3 на показатели роста и развития лука шалота в однолетней культуре, сохранность растений к уборке, урожайность. Лук шалот сорта Грант выращивали рассадным способом, используя кассеты с грунтом следующего состава: торф и опилки мелкие в соотношении 3:1. Период выращивания рассады от посева до посадки на постоянное место составил 40 дней. Площадь делянки 0,3 м². Схема посадки 35×25 см, повторность четырехкратная.

Суспензию клеток S. antimycoticus 8Al3 с титром 10⁵ КОЕ/мл получали при культивировании в жидкой овсяной среде в течение 5 сут на качалке (120 об/мин). Рабочий раствор готовили из расчета 10 мл/л воды. В качестве препаратов сравнения использовали Витоплан СП (0,4 г/л) и химические фунгициды Профит Голд (1,2 г/л) и Фанданго (1,25 мл/л). Расход препаратов – в соответствии с инструкциями производителей. Обработку растений проводили путем опрыскивания трижды за вегетационный период с интервалом 17 суток (23 июня, 11 и 28 июля). Продолжительность вегетационного периода в зависимости от варианта опыта колебалась от 115 до 122 сут.

Результаты опыта приведены в таблице 8.

Табл. 8. Ростстимулирующая активность штамма S. antimycoticus 8Al3 в отношении растений лука шалота в полевых условиях

Вариант Число листьев, шт./ длина* /диаметр* Растений
к уборке, шт. Масса луковицы, г Урожай, кг/м² Прибавка к контролю,
% Контроль (вода) 6,2/35,0/7,5 11,5±1,3 45,0±13,5 1,6±0,2 - Обработка штаммом S. antimycoticus 8Al3 7,5/47,8/10,2 12,2±1,5 55,0±9,1 2,1±0,3 31,2 Препараты сравнения: Витаплан СП 5,5/37,0/9,2 10,7±1,9 70,0±5,8 1,7±0,7 6,2 Профит Голд 5,0/35,7/9,0 12,2±1,5 31,2±11,1 1,4±0,7 - Фанданго 6,0/22,5/5,7 10,5±2,1 17,5±9,6 0,8±0,3 -

Примечание: * Длина (см) и диаметр (мм) наибольшего листа

Фитопатологическая оценка в год проведения исследования выявила в посадках лука поражение в слабой степени переноспорозом, в результате чего снизилась сохранность растений к уборке. Обработка штаммом S. antimycoticus 8Al повысила сохранность растений по сравнению с контролем в среднем на 6,1%. Опрыскивание лука-шалота суспензией клеток S. antimycoticus 8Al3 привело к увеличению средних показателей числа, длины и диаметра листьев на 1,3 шт., 12,8 см, 2,7 мм соответственно. Это обусловило увеличение площади фотосинтетической поверхности у обработанных S. antimycoticus 8Al растений и, в конечном итоге, формирование луковиц с большей на 22% массой, чем в контроле. Прибавка урожайности в результате применения S. antimycoticus 8Al3 составила 31,2% к контролю, тогда как в результате применения препарата Витаплан СП урожайность увеличилась только на 6,2%, а эффектов от применения химических фунгицидов в условиях года не наблюдали.

Полученные результаты показывают, что в полевых условиях, при низкой степени развития переноспороза, штамм S. antimycoticus 8Al3 превзошел по эффективности химические фунгициды Профит Голд и Фанданго и был сопоставим с эффективностью биофунгицида Витаплан СП, изготовленного на основе Bacillus subtilis. Применение S. antimycoticus 8Al3 можно рекомендовать как предупредительно-профилактическую меру при выращивании лука-шалота рассадным способом.

Пример 9. Оценка пригодности штамма S. antimycoticus 8Al3 для использования в качестве деструктора целлюлозосодержащих субстратов

В лабораторных условиях исследовали способность штамма S. antimycoticus 8Al3 к разложению послеуборочных остатков лука и отработанного торфо-тепличного грунта. Эксперимент осуществляли в трехкратной повторности в моделируемых условиях, приближенных к естественным. После уборки урожая лука на перо, остатки (внешние чешуи и корни в торфяном грунте) измельчали. Навески, массой 350± 50 г, помещали в пластиковые контейнеры, объемом 1,0 л. В контейнеры с луково-торфяным субстратом вносили по 100 мл 5-суточной суспензии штамма S. antimycoticus 8Al3 (титр 3,0×10⁵ КОЕ/мл), перемешивали и оставляли на 5 месяцев при температуре 18-20°С. Влажность субстрата поддерживали не менее 60% от полной влагоемкости субстрата.

Убыль массы субстрата определяли весовым методом, степень разложения субстрата – методом отмучивания на ситах [Куликова Г.Г. Краткое пособие к ботаническому анализу торфа.– М.: МГУ, – 1974. – С. 15].

Результаты эксперимента представлены в таблице 9.

Табл. 9. Убыль массы и степень разложения луково-торфяного субстрата

Вариант Убыль массы,
% к исходной Степень разложения, % Луково-торфяный субстрат 0 2,3% Луково-торфяный субстрат + S. antimycoticus 8Al3 21,5±0,81 72,0

Луково-торфяный субстрат с естественным содержанием пропагул микроорганизмов, при увлажнении до 60% от полной влагоемкости субстрата, практически не подвергается деструкции (2,3% разложившегося сухого вещества).

Добавление к субстрату штамма S. antimycoticus 8Al3 способствовало процессу деструкции, что выразилось в снижении массы луково-торфяного субстрата на 21,5±0,81% от исходной. Степень разложения послеуборочных остатков лука в торфяном грунте при использовании штамма S. antimycoticus 8Al3 составила 72%.

Таким образом, степень разложения смеси послеуборочных остатков лука и отработанного торфо-тепличного грунта под воздействием штамма S. antimycoticus 8Аl3 увеличилась по сравнению с естественным протеканием процесса деструкции (фиг. 5).

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в качестве средства для защиты растений от болезней, стимуляции их роста и для снижения пула почвенных инфекций за счет увеличения деструкции корневых и пожнивных остатков. Предложен штамм Streptomyces antimycoticus 8А13, депонированный в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) – ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии» под номером RCAM06766. Данный штамм способен ингибировать рост фитопатогенных грибов и бактерий, стимулирует рост зерновых, бобовых культур, лука, чеснока, способен к деструкции целлюлозосодержащих субстратов. 5 ил., 9 табл., 9 пр.

Штамм актиномицета Streptomyces antimycoticus 8А13, депонированный в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) – ФГБНУ ВНИИСХМ под номером RCAM06766, в качестве средства защиты от фитопатогенных грибов и бактерий, стимуляции роста и увеличения урожайности зерновых, бобовых и луковых культур, обладающий способностью к деструкции целлюлозосодержащих субстратов.