СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ГЛАЗ, СОПРОВОЖДАЮЩИХСЯ ПЕРСИСТИРУЮЩИМИ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫМИ ДЕФЕКТАМИ РОГОВИЦЫ Российский патент 1998 года по МПК A61F9/00 A61K35/16 

Изобретение относится к области медицины - офтальмологии, предназначено для медикаментозного лечения заболеваний глаза, сопровождающихся персистирующими эпителиальными эрозиями роговицы.

При ряде патологических состояний процессы эпителизации роговицы нарушаются, а порой не достигаются вовсе, что приводит к извращению регенераторных механизмов, изъязвлению роговицы с развитием тяжелых осложнений, вплоть до гибели глаза.

Установлено, что при подобных состояниях (термические и химические ожоги глаз, рецидивирующие травматические эрозии роговицы, нейропаралитические и герпетические кератиты) на стромальной поверхности роговицы имеет место разрушение глипопротеина клеточной поверхности и межклеточного матрикса - фибронектина [3] , дефицит которого играет важную роль в патогенезе описанных заболеваний.

Имеются данные об успешном использовании инстилляций раствора фибронектина при заболевании глаза, сопровождающихся длительно не заживающими эпителиальными дефектами роговицы [5, 8, 9, 10].

Во всех имеющихся в литературе указаниях о применении инстиляций фибронектина при эпителиальных дефектах роговицы использовался раствор аутологичного фибронектина, приготовленного из плазмы пациента extemporae, в концентрации 0,425 мг/мл по методу Nishida с соавт., 1982 [8], который и явился прототипом изобретения. Однако прототип обладает рядом серьезных недостатков: нестабильность фибронектина-прототипа ограничивает его годность и биологическую активность 7-10 днями; низкая концентрация фибронектина в растворе, обусловленная пределами растворимости белкового препарата в предлагаемом растворителе, приводит к выпадению в осадок действующего начала с лишением его биологических свойств. В то время как известно, что увеличение концентрации фибронектина в культуре роговичной ткани сопровождается усилением его биологической активности.

Кроме того, состояния, при которых предполагается применение фибронектина, сопровождаются его дефицитом и даже отсутствием в роговичной ткани и требуют применения высококонцентрированных растворов фибронектина, что практически недостижимо у прототипа. Использование прототипа не исключает возможности разрушения фибронектина тканевыми протеазами с лишением его биологической активности, что особенно важно при состояниях с персистирующими дефектами роговицы [3].

Целью представленного способа является повышение эффективности и сокращение сроков лечения заболеваний глаза, сопровождающихся персистирующими эпителиальными дефектами роговицы.

Цель достигается тем, что для лечения используется высококонцентрированный (не менее 1 мг/мл) раствор фибронектина, стабилизированный 5% раствором глицерина.

Предлагаемый способ позволяет получить следующие преимущества:
повышение эффективности и сокращение сроков лечения персистирующих эпителиальных дефектов роговицы;
увеличение концентрации фибронектина в лекарственной форме до наиболее эффективно действующих величин, что необходимо при лечении состояний, сопровождающихся дефицитом фибронектина в роговичных тканях;
возможность длительного (до 1 года) сохранения биологических свойств фибронектина, стабилизированного 5% раствором глицерина;
уменьшение чувствительности фибронектина на 5% водном глицерине к действию тканевых протеаз роговицы и слезной жидкости, что позволит усилить его биологическую активность при местном применении в виде инстилляций;
условия хранения (+2 - +4^oC) и срок годности (6-8 мес) предлагаемой лекарственной формы фибронектина обусловливают возможность промышленного выпуска препарата, а описанный способ лечения делают распространенным и доступным большинству офтальмологов.

Теоретическое обоснование способа
Фибронектин - гликопротеин клеточной поверхности, межклеточного матрикса и плазмы крови - имеет молекулярный вес около 450 000 и состоит из 2 приблизительно одинакового размера полипептидных цепей, связанных дисульфидным мостиком [6].

Структурная стабильность молекулы фибронектина поддерживается дисульфидными мостиками в пределах каждой из полипептидных цепей у мест, предназначенных для сцепления с коллагеном, фибрином, клетками, гепарином. Сохранение структурной стабильности необходимо для выполнения фибронектином специфических биологических функций [4, 6, 8, 9]: ускорение миграции клеток, опосредование сцепления клеток с субстратом и межклеточных связей, опсонизирующий эффект, положительный хемотаксис к фибробластам и макрофагам и др., что указывает на его значение в регенераторных процессах. Указание на существование центра (центров) самоагрегации в фибронектине было впервые получено Yamada et al (1977) [11]. Кроме того, фибронектин легко образует дисульфидносвязанные мультимеры, через свободные SH-группы [7].

Центр самоагрегации расположен рядом с коллаген-связывающем доменом, а свободные SH-группы участвуют в осуществлении фибронектином клеточных и матриксных взаимодействий [6]. Таким образом, самоагрегирование мономерных и мультимерных молекул фибронектина ведет, во-первых, к блокированию коллаген-связывающего домена (4) и, во-вторых, к формированию крупных агломератов, выпадающих в осадок. Оба указанных процесса ведут к существенному изменению конформации молекулы фибронектина, что значительно снижает его биологическую активность [6].

В физиологических условиях плазменный фибронектин существует в виде свернутой, но удлиненной и гибкой цепи [12]. Разворачивание по крайней мере части полипептидной цепи на N-конце снижает родство к фибрину, коллагену, повышает чувствительность фибронектина к протеазам, индуцирует самоассоциацию и перекрестное сшивание [13], что делает водные растворы фибронектина нестабильными по сроку хранения (7-10 дней при температуре до +4^oC и 6-8 недель при -20^oC с потерей биологических свойств при повторных размораживаниях) и обусловливает низкий предел растворимости фибронектина.

Известно, что в органических растворителях доля β-спиралей в белковых молекулах повышается [2], поэтому естественно было предположить, что водные растворы глицерина (4-5%) будут предотвращать разворачивание молекул фибронектина и их последующую самоаггрегацию.

Достигнутое 5% глицерином состояние стабильности фибронектиновой молекулы позволяет получить:
высокую биологическую активность и стабильность его высококонцентрированных растворов,
снижение чувствительности фибронектина в предлагаемой лекарственной форме к разрушительному действию протеаз слезной жидкости и роговичной ткани при местном применении в виде глазных капель.

Известно, что выбранный органический растворитель 5% водный раствор глицерина, добавляемый в качестве стабилизатора в предлагаемую лекарственную форму, не оказывает токсического действия на глазные ткани и широко применяется в практике офтальмологов в виде инстилляций и субконъюктивальных инъекций при состояниях, связанных с отеком роговицы [1].

Пример: опыты по лечению травматических дефектов эпителия роговицы проводили на 20 кроликах (40 глаз) породы шиншилла, самцах весом 2,5 кг.

Всем животных после местной анестезии была проведена отметка в центральной зоне роговицы трепаном ⊘ 8 мм. Эпителий в центральной зоне был полностью удален шпателем. Животные были разделены на 4 группы в зависимости от вида лечения:
I. Контрольная группа, получавшая инстилляции 0,25% раствора левомицетина.

II. Группа с традиционным лечением эрозий роговицы, получавшая инстилляции 0,25% раствора левомицетина, витаминные капли, солкосерил-желе.

III. Группа с прототипным лечением, получавшая инстилляции водного раствора фибронектина в концентрации 0,425 мг/мл.

IV. Опытная группа, получавшая инстилляции фибронектина на 5% растворе глицерина в концентрации 1 мг/мл.

Закапывание капель во всех группах проводилось в одно и то же время, три раза в день.

Контроль за процессом заживления эпителиальных дефектов проводился с помощью точной количественной фотобиометрии после закапывания 1 капли 2% флюоресцеина, сразу после ранения, а также через 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 ч после ранения. Полученные изображения переносились с 10-кратным увеличением на бумагу. Площади дефектов вычислялись на полуавтоматическом анализаторе изображений МОР-3.

Скорость заживления эпителиальной раны в каждом глазу вычислена методом линейной регрессии и выражена в % зажившей площади в час и в квадратных миллиметрах.

Эксперимент выполнен двойным слепым методом. Результаты обработаны с помощью критерия Стьюдента.

Средняя скорость заживления травматических эпителиальных дефектов роговицы в исследуемых группах выражается в следующих цифрах:
I контрольная группа - 1,03±0,01 мм²/ч,
II группа с традиционным лечением - 1,24±0,07 мм²/ч,
III группа с прототипным лечением - 1,58±0,14 мм²/ч,
IV опытная группа - 1,97±0,04 мм²/ч.

Эпителиальный дефект был полностью закрыт в I группе к 120-125 ч с момента травмы; во II группе - к 90-94 ч; в III группе - к 60-68 ч; в IV группе - к 47-50 ч.

Таким образом, местное применение фибронектиновых глазных капель в концентрации 1 мг/мл на 5% водном глицерине повысило среднюю скорость заживления роговичного эпителия по сравнению с контролем на 91,2%, в то время как применение водного раствора фибронектина 0,425 мг/мл повысило среднюю скорость заживления эпителия роговицы на 53,4% по сравнению с контролем, а традиционное лечение на 20,4% ускоряет контрольную скорость заживления эпителия.

Определение стабильности и сохранности биологических свойств предлагаемой лекарственной формы фибронектина (в концентрации 1 мг/мл на 5% водном растворе глицерина) по сравнению с прототипом проведено в эксперименте in vivo на 18 кроликах (36 глаз) по ускоряющему эффекту исследуемого препарата на заживление эпителиальных травматических эрозий роговицы по методике, описанной выше, при различных сроках выдержки (1 мес, 2 мес, 4 мес, 6 мес, 12 мес) при температуре 2 - 4^oC.

Установлено, что раствор фибронектина в концентрации 1 мг/мл на 5% водном глицерине сохраняет биологические функции в течение 12 мес с момента изготовления при температурном режиме хранения 2 - 4^oC, в то время как водный раствор фибронектина, взятый за прототип, теряет биологическую активность в виде ускорения регенерации эпителия роговицы уже через 2 недели при указанных условиях хранения.

Способ осуществляется следующим образом.

При наличии у больных заболеваний роговицы, сопровождающихся персистирующими эпителиальными дефектами, применяют 6-8-кратные инстилляции в конъюктивальную полость фибронектиновых глазных капель в концентрации 1 мг/мл на 5% водном растворе глицерина до момента эпителизации роговицы и 7-10 дней после ее достижения.

Источники информации
1. Краснов М.Л., Шульгина Н.Б. Терапевтическая офтальмология, с.34.

2. Alexander S.S., Colonna G., Yamada K.M., et al. -Biol. Chem., 1978, 253, 5820-5824.

3. Berman M., Manseau E., Aiken D-Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1983, 24, N 10, 1358-1356.

4. Kleinman N.K., McGoodwin E.B., Martin G.R., et al. -J. Biol. Chem., 1978, 253, 5642-5646.

5. Manabe R., Nichida T., Ochashi Y., et al-Acta Soc. Ophthalmol. Jpn., 1984, 88, N 3401-413.

6. Mosseson M.W., Armani D.L.B-Blood, 56, N 2, 145-158.

7. Mosher D. F., Johnson R.B. -J. Biol. Chem., 1983, 258, N 10, 6595-6601.

8. Nichida T., Nacagawa S., Awata T., et al. -Jap. J. Ophthalmol., 1982, 26, 4, 416-424.

9. Nichida T. , Nacagawa T.S., Awata T. et al. -Lancet, 1983, 2 9348, 551-552.

10. Nichida T. , Ohashi Y., Awata T., et al. -Arch. Ophthalmol., 1983, 101, N 7, 1046-1048.

11. Yamada K. M., Schesinger D.N., Kennedy D.W., et al. -Biochemistry, 1977, 16, 5525-5559.

12. Williams E. C. , Jamney P.A., Perry J.D., et al. -J. Biol. Chem., 1982, 257, N 24, 14973-14978.

13. Williams E. C., Jamney P.A., Johnson R.B., et al. -J. Biol. Chem., 1983, 258, N 9, 5911-5914.

Изобретение относится к офтальмологии, а именно к способам лечения заболеваний глаза. В конъюктивальную полость осуществляют введение высококонцентрированного раствора фибронектина (не менее 1 мг/мл), стабилизированного 5% водным раствором глицерина.

Способ лечения заболеваний глаза, сопровождающихся персистирующими эпителиальными дефектами роговицы, предусматривающий инстилляции в конъюнктивальную полость раствора фибронектина, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности и сокращения сроков лечения, используют высококонцентрированный раствор фибронектина в концентрации не менее 1 мг/мл, стабилизированный 5%-ным водным раствором глицерина.