СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАНИЙ К ПРИМЕНЕНИЮ ПРЕПАРАТОВ АНТИПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ В ОСТРЫЙ ПЕРИОД ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ И ДЕСТРУКТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ РОГОВИЦЫ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к офтальмологии и предназначено для диагностики и лечения заболеваний роговицы.

В последнее время все больше внимания уделяется разработке неинвазивных методов диагностики. Для глаза эта проблема особенно актуальна, поскольку получение материала для прижизненного исследования метаболических процессов в его внутренних структурах в большинстве случаев затруднено или невозможно. Слеза же является доступной для анализа биологической жидкостью, она принимает участие в метаболизме тканей переднего отрезка глаза, поэтому ее исследование значительно расширяет возможности оценки метаболических процессов в глазу в норме и патологии.

Клинический опыт многих авторов убедительно свидетельствует о том, что целенаправленные биохимические исследования слезной жидкости могут дать много ценных сведений как для диагностики (в т.ч. ранней) многих заболеваний глаз, так и для прогнозирования их течения и эффективности проводимой терапии [4].

Среди биохимических компонентов слезной жидкости важная роль принадлежит протеолитическим ферментам. Протеазы принимают участие как в физиологической репарации тканей, так и в развитии патологических процессов. Особенно велика их роль в воспалительной реакции. За счет протеаз происходит разрушение поврежденных белковых молекул, а также белковых соединений, выполнивших свою функцию и подлежащих удалению. В норме динамическое равновесие процессов распада и синтеза тканевых элементов обеспечивает поддержание структурной целостности и нормального функционирования тканевых структур глаза. При повреждении тканей (механическая травма, ожог, инфекция и др.) происходит активация протеаз, которые осуществляют деструкцию разрушенных тканевых элементов, подготавливая таким образом раневую поверхность к репарации. Чрезмерная активация протеаз может привести к разрушению нативной ткани и развитию в ней деструктивных процессов [6,8-10]. В частности, исходом воспалительного процесса в роговице в этом случае может стать ее изъязвление, последствия которого - вплоть до перфорации роговицы и грубого рубцевания - приводят к значительному ослаблению зрения или полной его утрате.

Существует несколько механизмов, контролирующих активность протеаз, но наиболее универсальным и распространенным является регуляция, осуществляемая с помощью мощной системы ингибиторов этих ферментов. Нарушение баланса активности протеаз и их ингибиторов может привести к избыточной неконтролируемой активации ферментов и последующему развитию язвы роговицы [6].

В офтальмологической и общемедицинской практике с успехом применяются препараты, ингибирующие активность протеолитических ферментов. К их числу относятся препараты, действующим началом которых является ингибитор широкого спектра действия апротинин (Гордокс, Контрикал, Траселол и др.). Гордокс используется для лечения заболеваний роговицы, в ходе которых имеется опасность ее изъязвления [3,5,7]. Однако применение препаратов ингибиторов протеаз должно быть строго обосновано, поскольку чрезмерное подавление активности этих ферментов ведет к нарушению нормального течения репаративного процесса.

Таким образом, состояние протеиназно-ингибиторного баланса в слезной жидкости является важным диагностическим и прогностическим критерием при лечении травм, ожогов роговицы, язвенных кератитов и др., а также при проведении кератопластики. Снижение антипротеолитической активности слезы в острый период воспалительного процесса в роговице создает угрозу резкого возрастания активности протеаз, что может привести к изъязвлению роговицы и ее перфорации. Определение антипротеолитической активности слезной жидкости позволяет контролировать течение воспалительного процесса и при необходимости осуществлять его коррекцию при помощи препаратов, ингибирующих активность протеаз [3,5-7,9].

Для определения ингибиторов протеаз в биологических жидкостях и тканях обычно используют их способность тормозить гидролиз трипсином или другими протеолитическими ферментами специфических пептидных хромо- и флюорогенных субстратов. Однако для проведения таких исследований требуются малодоступные и дорогостоящие реактивы (субстраты и др. ) и специальная аппаратура (спектрофотометры, спектрофлюориметры), поэтому они не получили достаточно широкого распространения в клинической практике.

К числу этих способов относится разработанный в нашей лаборатории способ определения антитриптической активности слезной жидкости с использованием специфического для трипсиноподобных протеаз синтетического пептидного субстрата -N-бензоил-DL-аргинин- ρ- нитроанилид (БАПНА) [1]. Этот способ предназначен для прогнозирования течения воспалительных заболеваний роговицы, а также для обоснования назначения антипротеолитических препаратов и является ближайшим аналогом предлагаемого способа. Способ точен, надежен, с успехом применяется в лаборатории, но малопригоден для широкого использования в офтальмологической практике по перечисленным выше причинам. В связи с этим нами была поставлена задача разработать простой и доступный способ оценки антитриптической активности слезы.

Известен разработанный К.Н.Веремеенко и соавт. в 1986 г. экспресс-метод определения ингибиторов трипсина в сыворотке крови, позволяющий с достаточной степенью точности оценивать содержание в крови одного из основных плазменных ингибиторов протеолиза - α₁- антитрипсина с целью прогнозирования течения и назначения соответствующих схем терапии некоторых бронхолегочных, аллергических, онкологических заболеваний, патологии печени, почек и др. [3] . В основе этого способа лежит способность ингибиторов сыворотки крови подавлять способность ферментного препарата трипсина расщеплять желатин (один из субстратов трипсина), входящий в состав фотоэмульсии рентгеновской пленки (засвеченной и проявленной). В результате расщепления желатина на пленке образуются прозрачные зоны лизиса, в случае подавления активности трипсина ингибитором они отсутствуют.

Разведенную в 4 раза 0,05 М трис-HCl буфером сыворотку крови смешивали с раствором трипсина в различных концентрациях (от 0,125 до 1 мг/мл), капли наносили на рентгеновскую пленку, инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. После инкубации на пленке образуются зоны лизиса. По концентрации трипсина в пробе, которой соответствует последняя зона лизиса судили об антитриптической активности сыворотки крови. В разработанной К.Н. Веремеенко и соавт. (1986 г.) форме способ неприменим для анализа слезной жидкости, т.к. исследуемые соединения находятся в ней в значительно меньшем количестве, чем в сыворотке крови, а также потому, что объем получаемой от пациентов слезы обычно очень невелик и недостаточен для постановки реакции. Поэтому потребовалось изменение концентраций реагентов, их соотношения, времени и условий инкубации проб.

Для выявления антитриптической активности слезы нами были подобраны следующие условия постановки реакции.

Концентрации трипсина были значительно уменьшены по сравнению с предложенными К.Н.Веремеенко и подобраны таким образом, чтобы после инкубации в течение 30 мин в термостате при 37^oC на рентгеновской пленке образовывалась зона лизиса. Объем раствора фермента, наносимого на пленку, также был подобран так, чтобы зона лизиса имела вид правильного круга диаметром 5 мм. Согласно методике К.Н.Веремеенко и соавт. измерения проводятся при комнатной температуре, однако мы пришли к заключению, что постановка реакции при постоянной температуре, при которой скорость реакции наибольшая - 37^oC - дает более стабильные результаты, что особенно важно при работе с низкими концентрациями фермента.

Далее нами была изучена зависимость между активностью трипсина и концентрацией его ингибитора. Это необходимо для того, чтобы подобрать такие условия реакции, при которых зависимость между активностью фермента и ингибитора будет линейной, т. к. только в линейной области можно достаточно точно оценить антиферментную активность. В качестве стандартного ингибитора трипсина использовали апротинин - белковый ингибитор широкого спектра сериновых протеаз. Для этого выбрали препарат Гордокс (Гордокс, Гедеон Рихтер, Венгрия), в котором апротинин является действующим началом, и концентрация его составляет 1,4 мг/мл, а в ингибирующих единицах - 10000 ИЕ/мл. Нами было опытным путем установлено, что линейная зависимость имеется в области концентраций трипсина от 3 до 25 мкг/мл и апротинина -от 2 до 10 ИЕ/мл. Поэтому для исследования слезной жидкости подбирались такие ее количества, которые по ингибиторной активности находились бы в пределах участка линейной зависимости.

Для определения оптимального количества слезной жидкости изучили зависимость антитриптической активности слезы от ее концентрации (фиг.1). Для этого слезную жидкость, полученную от пациента, разводили 0,05М трис-HCl буфером (pH 8,1)в 5, 10, 20, 40 и 80 раз. Разведение в 20 раз было признано оптимальным, т.к. в этом случае зависимость антитриптической активности слезы от ее концентрации носит характер, приближающийся к линейному, и в то же время эта точка находится в пределах линейного участка калибровочной кривой.

Принцип предлагаемого способа.

Измерение антитриптической активности слезной жидкости основано на торможении ингибиторами, содержащимися в ней, способности ферментного препарата трипсина расщеплять желатиновый слой на поверхности рентгеновской пленки.

Антитриптическую активность слезы в данной методике предложено выражать в ингибирующих единицах (ИЕ). Для этого используется калибровочная кривая, отражающая зависимость между ингибиторной активностью апротинина и минимальной концентрацией трипсина, способной осуществлять в присутствии апротинина полный лизис желатинового слоя на пленке (фиг. 2). Определив минимальную концентрацию трипсина, при которой на пленке еще образуется зона лизиса, с помощью калибровочной кривой находят соответствующее значение активности ингибитора, которое и принимается за антитриптическую активность данного образца слезы.

Предложенный нами способ расчета антитриптической активности слезы в отличие от используемого К.Н.Веремеенко и соавт. позволяет сравнивать данные, полученные этим способом, с результатами других способов измерения антитриптической активности.

Техническим результатом предлагаемого способа является упрощение определения антипротеолитической активности слезной жидкости больных и сокращение времени проведения анализа, что позволяет использовать его в качестве экспресс-метода для определения показаний к применению препаратов антипротеолитического действия.

Способ осуществляется следующим образом.

Забор слезы у пациентов проводят с помощью стеклянного капилляра. При необходимости применяют стимуляцию.

Засвеченную и проявленную рентгеновскую пленку размером 8 х 4 см размечают по горизонтали на 4 ряда (для образцов слезы от 4-х больных) и по вертикали
- на 8 столбцов (для 8 разведений трипсина). В образовавшиеся 32 клетки в дальнейшем помещают смесь трипсина и слезы.

Растворы трипсина в 0,05М трис-HCl буфере pH 8,1 готовят из расчета, чтобы в 1 мл содержалось соответственно 25, 20, 15, 10, 8, 5, 4 и 3 мкг трипсина. Можно использовать кристаллический трипсин любой доступной фирмы. Растворы готовят в день определения.

Слезную жидкость, полученную от пациента, разводят 0,05М трис-HCl буфером рН 8,1 в 20 раз. В отдельные пробирки вносят не менее чем по 10 мкл приготовленных растворов трипсина различных концентраций и такое же количество разведенной слезы, тщательно перемешивают встряхиванием и инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре для образования комплексов трипсина с ингибиторами, содержащимися в слезе. Затем на рентгеновскую пленку наносят по 20 мкл смеси из каждой пробирки так, что образцы слезы от каждого больного занимают один горизонтальный ряд клеток на пленке. Пленку помещают в чашку Петри с влажной фильтровальной бумагой, накрывают крышкой и инкубируют 30 минут при 37^oC. За это время происходит расщепление желатинового слоя на поверхности пленки трипсином, не связанным с ингибиторами, - чем выше содержание ингибиторов в слезе, тем большее количество трипсина инактивируется, и зоны лизиса в этом случае отмечаются в пробах с более высокими концентрациями трипсина. По окончании инкубации пленку промывают водопроводной водой и оценивают антитриптическую активность слезы по образовавшимся зонам лизиса (фиг. 3). Для этого в каждом ряду определяют концентрацию трипсина в пробе, показавшей первый положительный результат (наличие зоны лизиса), и по калибровочной кривой находят соответствующее значение активности ингибитора в ИЕ/мл. Одновременно ставят контроль на желатинолитическую активность чистого трипсина.

С помощью предложенного метода была исследована слезная жидкость 5 здоровых людей и 8 пациентов с различной офтальмопатологией.

Значения антитриптической активности слезной жидкости в здоровых глазах оказались очень близки и находились в пределах 1,7 и 2,5 ИЕ/мл. В то же время, между пациентами с различными заболеваниями глаз имеются заметные отличия. Высокие значения антитриптической активности слезы у больных с травмами глаз и щелочными ожогами роговицы можно объяснить компенсаторным увеличением уровня ингибиторов в ответ на активацию протеолитических ферментов. Пониженное содержание ингибиторов в слезе часто является неблагоприятным прогностическим признаком и может служить основанием для назначения экзогенных ингибиторов в целях коррекции протеиназно-ингибиторного баланса. По нашим данным значение антитриптической активности слезы больного ниже 2,5 ИЕ/мл при активном патологическом процессе, а также отсутствие повышения ее после оперативного вмешательства может служить основанием для назначения препаратов ингибиторов протеаз.

Пример 1.

Больной Н. 1968 г.р. Госпитализирован 5.03.98, диагноз - щелочной ожог роговицы. Исследование проведено 18.03.98 (13-е сутки после ожога). Антитриптическая активность слезы - 10 ИЕ/мл, т.е. имеет место заметное увеличение собственного ингибиторного потенциала слезы, что свидетельствует о нормальной компенсаторной реакции организма на увеличение активности протеаз после ожога. Введения экзогенных ингибиторов протеаз в данном случае не требуется. Продолжено лечение по традиционной схеме.

Пример 2.

Больной К. 1922 г.р. Госпитализирован 19.02.98 по поводу плановой экстракции старческой катаракты, оперирован 20.02.98. Исследование проведено 19.02.98 (до операции) и 23.02.98 (3-и сутки после операции). Антитриптическая активность слезы до операции - 5 ИЕ/мл, после операции - 1,25 ИЕ/мл. Несмотря на традиционное послеоперационное лечение у больного отмечались клинические признаки воспалительного процесса в переднем отрезке глаза. После проведенного на третьи сутки после операции исследования слезной жидкости было выявлено понижение ее антипротеолитической активности, что явилось показанием для назначения Гордокса в качестве экзогенного ингибитора протеолитических ферментов. На третьи сутки после начала лечения воспаление было купировано.

Способ может быть использован в офтальмологических стационарах в целях прогнозирования изъязвления роговицы при различных видах ее повреждения и для обоснования назначения антипротеолитической терапии.

Для оценки результата не требуется специальной аппаратуры, определение может быть проведено как при повышенном, так и при пониженном содержании ингибиторов в слезе, все используемые реактивы и оборудование доступны, измерение занимает мало времени и может быть использовано для экстренной диагностики локальной недостаточности антипротеолитической активности и назначения корригирующей терапии.

Список литературы
1. Биохимические методы исследования в клинике.//ред.А.А.Покровский. - М., 1969, - с.206-210.

2. Веремеенко К. Н. , Волохонская Л.И., Ханюченко С.И., Пилипчук В.Н., Романенко О. А. Экспресс-метод определения ингибиторов трипсина в сыворотке крови человека.//Лабораторное дело. - 1986. - N 9. - с.531-533.

3. Касавина Б. С., Чеснокова Н.Б., Щипанова А.И. Биохимические обоснования к применению ингибиторов протеолиза при воспалительных процессах в роговице.//Вестник офтальмологии. - 1983. - N 1. - С.48-50.

4. Сомов Е. Е. , Бржеский В.В. Слеза (физиология, методы исследования, клиника).- СПб.: Наука, 1994.

5. Сосулина Н. Е., Чеснокова Н.Б., Багдаш С. Экспериментальное обоснование терапии ожогов роговицы препаратами антипротеазного действия.//Тез. докл. Всесоюз. офтальмол. съезда.-М., 1985-т.6.-с.47-48.

6. Чеснокова Н.Б. Роль протеолитических ферментов и их ингибиторов в патологии роговицы. - М., 1991. - Дисс. на соискание уч.ст.д.б.н.

7. Чеснокова Н.Б., Брикман И.В., Сосулина Н.Е., Ибадова С.И. Эффективность применения гордокса после хирургической травмы глаза.//Венгерская фармокотерапия.-1989. - N 3. - с.78-80.

8. Berman M., Leary R., Gage L. Evidence for a role of the plasminogen activatorplasmin system in corneal ulceration.-Invest/ Ophthalmol. Vis. Sci. -1980.-vol.19 (10).-p.1204-1221.

9. Brown S.I., Weller A. Collagenase inhibitors in prevention of ulcers of alkaliburned cornea.//Arch. Ophthalmol.-1970.-vol.83.-p.352-353.

10. Prause J.I. Serum albumin, serum antiproteases and polymorphonuclear leucocyte neutral collagenlytic protease in the tear fluid of patients with corneal ulcers.//Acta ophthalmologica.-1983.-vol.61.-p.272-282.

Способ может быть использован в медицине, а именно для диагностики и лечения заболеваний роговицы. В качестве субстрата ферментативной реакции используют желатин, входящий в состав фотоэмульсии на засвеченной и проявленной рентгеновской пленке. Добавляют смесь трипсина и слезы (в разведении в 20 раз). Оценку результатов проводят визуально полуколичественно по зоне лизиса. Концентрацию трипсина и слезы подбирают так, чтобы соблюдалась линейная зависимость между активностью фермента и антипротеолитической активностью слезы. Антипротеолитическую активность слезы выражают в ингибирующих единицах (ИЕ) и определяют по калибровочной кривой, полученной с использованием апротинина в качестве стандартного ингибитора трипсина. При значениях антипротеолитической активности, равных 2,5 ИЕ/мл и ниже, считают препараты ингибиторов протеаз показанными. Способ позволяет значительно упростить определение антипротеолитической активности слезной жидкости больных и сократить время проведения анализа и может быть использован в качестве экспресс-метода для определения показаний к применению препаратов антипротеолитического действия. 3 ил.

Способ определения показаний к применению препаратов антипротеолитического действия в острой фазе воспалительных и деструктивных заболеваний роговицы, включающий измерение антипротеолитической активности слезной жидкости, отличающийся тем, что в качестве субстрата ферментативной реакции используют желатин, входящий в состав фотоэмульсии на засвеченной и проявленной рентгеновской пленке, добавляют смесь трипсина и слезы ( в разведении в 20 раз) так, чтобы соблюдалась линейная зависимость между активностью фермента и антипротеолитической активностью слезы, инкубируют в течение 30 мин при 37^oC, антипротеолитическую активность слезы выражают в ингибирующих единицах (ИЕ) и определяют по калибровочной кривой, полученной с использованием апротинина в качестве стандартного ингибитора трипсина, и при значениях антипротеолитической активности, равных 2,5 ИЕ/мл и ниже, считают препараты ингибиторов протеаз показанными.