СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ ВАКЦИНЫ, ЭФФЕКТИВНОЙ ДЛЯ ЗАЩИТЫ СВИНЕЙ ОТ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ МИКРООРГАНИЗМОМ РОДОВ MYCOPLASMA И ACHOLEPLASMA ОТРЯДА MYCOPLASMATALES Российский патент 1998 года по МПК A61K39/02 

Настоящее изобретение относится к получению вакцин, в частности к получению вакцин против микоплазмы.

Под термином "микоплазма", используемым в настоящем описании, подразумеваются микроорганизмы отряда Mecoplasmatales и, в частности, родов Mycoplasma и Acholeplasma этого отряда.

Микоплазмы широко распространены в природе, а определенные патогенные штаммы вызывают целый ряд заболеваний человека и животных. Например, подобные микроорганизмы вызывают заболевания дыхательных путей как у человека, так и у животных, причем эти заболевания характеризуются высокой распространяемостью болезней и продолжительным течением. В этой связи нужно особо отметить энзоотическую пневмонию свиней (ЭПС), которая имеет большое экономическое значение, особенно при интенсивном выращивании животных, и которую вызывает Mycoplasma hyopneumoniae (в недавнем прошлом известная также как M.suipneumoniae).

Было предпринято немало попыток сделать вакцины для защиты животных от заболеваний, вызываемых микоплазмами, в частности, ЭПС. В типичном случае способ производства вакцины включал этапы выращивания микроорганизмов, например, M. hyopneumoniae, до желаемого уровня в культуре, инактивации и сбора микроорганизмов, и формирования из собранных клеток вакцины, факультативно - с использованием подходящего адъюванта. В основном, микоплазмы сложно выращивать в культуре, и в приготовлении вакцины очень важно гарантировать, что антигенность живых микроорганизмов сохраняется после инактивации. Наиболее распространенный способ инактивации бактерий при производстве вакцин - воздействие формалином, и именно такой способ применялся при попытках произвести вакцину против микоплазм. До настоящего времени не имели успеха попытки произвести именно таким способом вакцину, которая обеспечила бы удовлетворительную защиту от ЭПС.

Известны также различные способы инактивации вирусов при производстве вакцин против вирусных заболеваний, включающие воздействие на живой вирус этиленимином. Однако использование этиленимина представляет значительные трудности на практике, как результат того факта, что он является высокотоксичным и при работе с ним требует самых строгих мер предосторожности.

Изучалась также возможность использования бинарного этиленимина для устранения микоплазмальной контаминации в сыворотке животных, применяемой для воспроизводства культур клеток (Christinson и др., J.Clin. Microbiol. II (4), 377-379 (1980)), но было сделано заключение, что бинарный этиленимин нельзя рекомендовать для этой цели.

Согласно одному аспекту, настоящее изобретение создает методику инактивации микроорганизмов родов Mycoplasma и Acholeplasma отряда Mycoplasmatales, в частности, во время производства вакцины против упомянутых организмов, которая включает воздействие на микроорганизмы этиленимином или его подходящим производным.

В соответствии с другим аспектом, изобретение создает методику производства вакцины против организмов родов Mycoplasma и Acholeplasma отряда Mycoplasmatales, которая включает выращивание микроорганизмов в культуре, их инактивацию этиленимином или его подходящим производным, сбора клеток и их преобразования в вакцину.

В соответствии с еще одним аспектом, изобретение создает вакцину против организмов родов Mycoplasma и Acholeplasma отряда Mycoplasmatales, включающую клетки упомянутых организмов, инактивированные воздействием этиленимином или его подходящим производным.

Способ настоящего изобретения включает применение этиленимина или его подходящего производного. Подходящие производные включают ацилированные производные, например, ацетилэтиленимин. Настоящее изобретение будет описано ниже с упором на применение самого этиленимина.

Как отмечалось выше, этиленимин является высокотоксичным и опасным веществом, и, хотя он может применяться в качестве такового, в соответствии с изобретением, для инактивации микоплазмы, было бы весьма желательно, чтобы он получался непосредственно в культуре микроорганизмы, т.е. in situ. Способ выработки этиленимина in situ может быть таков: этиленимин получается из его предшественника, безопасного в применении; затем сам этиленимин может быть инактивирован после того, как он выполнил свою функцию инактивации микроорганизмов. Сами способы выработки и инактивации этиленимина не должны оказывать существенного влияния на антигенность микроорганизмов.

Согласно особенно предпочтительному практическому варианту осуществления изобретения, этиленимин получается in situ добавлением 2-бром-этиламин гидробромида (БЭА) в культуру микоплазмы. БЭА является относительно инертным твердым веществом, однако в слабощелочной среде происходит его циклизация и образуется этиленимин. Соответственно, перед добавлением БЭА необходимо довести pH среды в культуре до слабощелочных значений, предпочтительно, в пределах от 7,0 до 8,0, более предпочтительно от 7,3 до 7,7, наиболее предпочтительно - около 7,5.

Если не предпринимать непрерывно действий по поддержанию этого слабощелочного уровня, пока идет инактивация микроорганизмов, pH имеет тенденцию снижаться. В соответствии с этим, после добавления БЭА, pH в культуре должен непрерывно корректироваться, для поддержания требуемого слабощелочного уровня, в течение достаточного периода времени, чтобы гарантировать, что микроорганизм полностью инактивирован. Добавление щелочи необходимо в течение первых нескольких часов, например, в течение первых трех часов, но также может оказаться необходимым корректировать уровень pH и в течение более длительного времени, например, в течение 20 - 24 ч. pH культуральной среды может подправляться до желаемых слабощелочных значений добавлением любой подходящей щелочи, например, гидроксидов щелочных металлов, предпочтительно гидроксида натрия.

После того как инактивация микроорганимзов закончится, сам этиленимин можно инактивировать добавлением подходящего реагента, который превращает этиленимин в безопасную в обращении форму. Примеры подходящих инактивирующих агентов включают тиосульфат натрия, который инактивирует этиленимин, разрушая его кольцевую структуру, и лимонную кислоту. Клетки микоплазмы впоследствии собирают, например, центрифугированием, а остатки питательной среды можно смешивать с водным раствором тиосульфата натрия, чтобы избежать возможного воздействия этиленимина на лабораторного работника.

Настоящее изобретение применимо к любому микроорганизму родов Mycoplasma и Acholeplasma отряда Mycoplasmatales. Примеры таких микроорганизмов включают M.hyopneumoniae, M.bovis, M.orale, M. dispar, M.hominis, M.arginini, A. laidlawii. Изобретение особенно применимо для производства вакцины против ЭПС и в дальнейшем будет описываться на примере M.hyopneumoniae.

Процесс производства вакцины против M.hyopneumoiae начинается посевом культуры микроорганизма, о котором идет речь. Подходящие культуры выбирают из коллекции культур, например, M.hyopneumoniae 10110 можно получить из национальной коллекции типичных культур, Colindale, UK. Культура для посева выращивается на подходящей питательной среде и затем инокулируется в окончательный объем питательной среды. В зависимости от объема производства вакцины, окончательный объем питательной среды может составлять, например, от 40-45 л до 200 л и более, а культура для посева может выращиваться в объеме от 1 до 10% от окончательного объема до ее инокуляции в этот окончательный объем питательной среды.

Подходящая питательная среда включает, например, промышленно приготовленный бульон в качестве основы, обогащенный сывороткой и дрожжевым экстрактом. В общем случае также включают источник энергии, такой как глюкоза, и антибиотик, такой как полимиксин. Уровень pH, в основном, должен находиться в пределах от 7,2 до 7,6. Микроорганизм выращивают в культуре в условиях контролируемого pH, предпочтительно pH от 7,1 до 7,3 при его регулировании путем добавления щелочи, такой как гидроксид натрия. Рост происходит при нормальной температуре в термостате, например, 36±1^oC и продолжается до тех пор, пока метаболическая активность культуры не начнет падать, что показывает расход щелочи, используемой для корректировки pH.

После того как метаболическая активность культуры начинает падать, микроорганизм инактивируют добавлением БЭА в питательную среду. Например, БЭА можно добавлять в виде водного раствора известной концентрации до окончательной концентрации в питательной среде около 0,82 г/литр, что соответствует приблизительно 4 мМ. В это же время или непосредственно до добавления БЭА pH питательной среды доводят до слабощелочного уровня, в основном, около pH 7,5, путем прибавления подходящей щелочи, такой как гидроксид натрия.

БЭА подвергают циклизации при этих же условиях и превращают в этиленимин, который и инактивирует M.hyopneumoniae. Этот процесс инактивации требует периода времени в несколько часов, в основном, около 24 ч, в течение которых культуру продолжают выдерживать при нормальной температуре инкубации. Важно, чтобы этиленимин продолжал находиться в культуральной среде в течение всего времени, которое требуется для инактивации. При отсутствии постоянной корректировки, pH питательной среды имеет тенденцию становится со временем более кислым. В соответствии с этим в течение процесса инактивации должно постоянно осуществляться слежение за уровнем pH питательной среды, который должен поддерживаться слабощелочным с помощью прибавления щелочи, если потребуется.

Когда инактивация микроорганизмов завершится, этиленимин в питательной среде в свою очередь разрушается прибавлением избытка подходящего реагента, такого как тиосульфат натрия или лимонная кислота. Например, избыток водного раствора тиосульфата натрия добавляется для создания концентрации около 1 г/литр питательной среды.

После дезактивации этиленимина клетки микроорганизмов собирают, а остатки питательной среды можно добавить в водный раствор тиосульфата натрия, опять-таки предпочтительно до конечной концентрации около 1 г/литр.

После того как клетки собраны, выход антигена можно измерить определением количества белка. Клеточный концентрат, получившийся после сбора, может быть подвергнут стандартным методикам для получения вакцины. В частности, клетки разводят до подходящего уровня, исходя из содержания антигена, например физиологическим раствором с буфером, и, по желанию, можно формировать вакцину с использованием подходящего адъюванта, такого как масло, сапонин или декстран DEAE. Предпочтительным адъювантом является масло.

Было обнаружено, что вакцина, полученная распространенным способом, описанным выше, из M.hyopneumoniae, сохраняла антигенные свойства живого микроорганизма и с успехом применялась для защиты свиней от ЭПС.

Без желания ограничиваться любой специфической теорией, считают, что стандартные способы инактивации бактерий в процессе приготовления вакцин (например, воздействие формалином) воздействуют на поверхностные белки бактерий, в результате чего изменяются антигенные свойства бактерий. В некоторых случаях воздействие на поверхностные белки бактерий таково, что эти клетки далее уже не могут использоваться для получения удовлетворительных по качеству вакцин, и это может происходить и в случае с микоплазмами, которые весьма трудно выращивать в культурах.

При таких обстоятельствах для производства удовлетворительной вакцины необходимо применять такой способ инактивации микроорганизмов, который производит по возможности наименьший вредный эффект на антигенные свойства клеток. Считают, что этиленимин дезактивирует микроорганизмы посредством разрушения генетического материала (ДНК) клеток без какого-либо существенного воздействия на их поверхностные белки.

Далее изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. БЭА (0,082 г) добавляли к 100 мл активно растущей культуры M. hyopneumoniae 10110 для получения конечной концентрации в питательной среде 4 мМ. pH доводили до 7,5 IN водным раствором гидроксида натрия, впоследствии pH измеряли и корректировали тем же способом, как указано в табл. 1.

Образцы отбирали каждый час в течение 6 ч для разведения, посева на чашки Петри с последующим подсчетом, а также спустя 24 ч - для посева для разведения. Через 24 ч жизнеспособные микроорганизмы не обнаруживались.

Пример 2. M.hyopneumoniae 10110 культивировали на питательной среде следующего состава:
Основной бульон - 65 мл
Сыворотка свинья - 15 мл
Кипяченый экстракт крови - 10 мл
Дрожжевой экстракт - 10 мл
Цистеин HCl (1%) - 1 мл
Глюкоза (20%) - 5 мл
Красный фенол (0,4%) - 1 мл
Ампициллин (0,5%) - 0,5 мл
Ацетат таллия (1%) - 2,5 мл
Субкультуру выращивали последовательно в 10, 100, 400, 4000 мл питательной среды. Когда культура на 4 л начала проявлять признаки активного роста (легкое помутнение и изменение pH в кислую сторону), ее инокулировали в 40 л свежей питательной среды. pH этой культуры поддерживалась на уровне 7,2 добавлением к ней водного раствора гидроксида натрия, если падение уровня требовало корректировки.

По истечении 13 дней потребность в гидроксиде натрия пошла на убыль, и в культуру добавили через стерилизующий фильтр 36,5 г БЭА в 100 мл дистиллированной воды. pH поддерживали на уровне 7,5 добавленного водного раствора гидроксида натрия по мере надобности. Спустя 24 ч культуру собрали центрифугированием, а использованную питательную среду смешали с лимонной кислотой до получения 0,2% раствора. Альтернативной процедурой на этой стадии является прибавление тиосульфата натрия спустя 24 ч до уровня 1,0 г/литр перед центрифугированием и помещение использованной питательной среды в добавочный водный раствор тиосульфата натрия. Эта альтернативная процедура дает эквивалентные результаты.

Полученный после центрифугирования концентрированный антиген гомогенизировали в 300 мл физиологического раствора с фосфатным буфером (ФРФБ) и вновь подвергли центрифугированию. Оставшийся антиген снова суспендировали в 300 мл ФРФБ и хранили в аликвотных количествах при -70^oC.

Достаточное количество антигена эмульгировали с масляным адъювантом (Marcol:Arlacel), так чтобы получить приблизительно 13 мг на подкожную дозу, и вводили 6 свиньям при 10 животных в контроле. Спустя 4 недели все свиньи получали интраназально три дня подряд по 5 мл легочного гомогената, M.hyopneumoniae. Спустя 4 недели после заражения у всех контрольных свиней на секции обнаруживали обширные поражения, отсутствовавшие у вакцинированных животных, т. е. была достигнута полная защита от микроорганизма посредством вакцинации.

Настоящее изобретение относится к способу инактивации организмов рода Mycoplasma и Acholeplasma отряда Mycoplasmatales, в частности к способу, который включает воздействие на эти микроорганизмы этиленимином или его подходящим производным. В частности, микроорганизм можно инактивировать in situ путем добавления в их культуры гидробромида 2-бром-этиламин до тех пор, пока реакция среды не станет слабощелочной. Настоящее изобретение, в частности, применимо при производстве вакцины против Mycoplasma hyopneumoniae, используемой для борьбы с энзооптической пневмонией свиней. 3 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения антигена для вакцины, эффективной для защиты свиней от инфекции, вызванной микроорганизмом родов Mycoplasma и Acholeplasma отряда Mycoplasmatales, включающий выращивание микроорганизма в культуральной среде, его инактивацию, сбор клеток микроорганизма и выделение антигена из клеток, отличающийся тем, что микроорганизм инактивируют обработкой этиленимином, вырабатываемым in situ в процессе добавления 2-бромэтиламин-гидробромида в культуральную среду, pН которой регулируют добавлением щелочи, такой, как гидрооксид щелочного металла, на уровне от выше 7 до около 8 в течение по меньшей мере 3 ч для обеспечения полной инактивации микроорганизма. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что pН поддерживают в пределах 7,3 - 7,7, предпочтительно 7,5. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что после инактивации микроорганизма этиленимин или его производное инактивируют добавлением тиосульфата натрия или лимонной кислоты, которые превращают этиленимин в безопасную форму. 4. Способ по любому из пп.1 3, отличающийся тем, что микроорганизмом является M. hyopneumonial.