СОСТАВЫ СРЕД ДЛЯ МИКОПЛАЗМЫ Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к составам сред, которые не содержат свиной сыворотки и ингредиентов животного происхождения или с их минимальным содержанием. Эти составы пригодны для выращивания различных видов Mycoplasma, в частности Mycoplasma hyopneumoniae. Состав сред рационально составлен, чтобы оптимизировать рост Mycoplasma, поддерживая при этом экспрессию гена антигена. Mycoplasma, выращенная в раскрытых составах сред, пригодна для применения в вакцинах для свиней.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Mycoplasma представляет собой небольшие грам-отрицательные бактерии, у которых отсутствует клеточная стенка, в общем они являются неподвижными и часто паразитными или патогенными для млекопитающих, птиц, рептилий, амфибий, рыб, насекомых и даже растений. Большое количество видов Mycoplasma относятся к семейству Mycoplasmataceae. Mycoplasma могут представлять собой условно-патогенные бактерии и часто обнаруживаются на слизистых оболочках млекопитающих. Более чем один вид Mycoplasma может колонизироваться на поверхности конкретной слизистой. Mycoplasma выступает возбудителем различных болезненных состояний, особенно у организмов с ослабленным иммунитетом. В некоторых случаях патогенность Mycoplasma может быть связана с наличием вирусов или других бактерий. Mycoplasma могут также действовать как вторичные инфекционные агенты.

Для контроля, ослабления или профилактики заболеваний, связанных с Mycoplasma, необходимы эффективные вакцины. Для получения антигенов для таких вакцин необходимы культуры Mycoplasma, но сама природа Mycoplasma представляет трудности. Mycoplasma представляют собой наиболее маленькие самореплицирующиеся невирусные организмы, и они соответственно содержат небольшие геномы из, как оценено, менее чем около тысячи генов в общем. В этом ограниченном геноме отсутствует много ферментов, необходимых для получения незаменимых питательных веществ, так что Mycoplasma зависят от факторов клетки-хозяина или добавок к клеточной культуре для роста. Например, для Mycoplasma часто требуются внешние источники нуклеозидов гуанина и цитозина и холестерина или других липидов. Таким образом, Mycoplasma неизбежно связана с характеристиками окружающей среды, которая изменяет экспрессию и иммуногенность антигена, и вакцины, содержащие Mycoplasma, отличаются по эффективности в зависимости от процесса и добавок, используемых для роста Mycoplasma.

Несколько видов Mycoplasma вовлечено в заболевания свиней. Полагают, что М. hyosynoviae вызывает артрит у свиней, М. suis может приводить к анемии, а М. hyorhinitis может давать вклад в фибринозный полисерозит, особенно у поросят.М. hyopneumoniae («Mhp») вызывает энзоотическую пневмонию и является фактором в комплексе респираторных заболеваний у свиней (PRDC) наряду с вирусом свиного репродуктивно-респираторного синдрома (PRRS) и вирусом гриппа.

Часто необходимы поливалентные вакцины, в которых антигены Mycoplasma объединяют с одной или более другими бактериями или вирусами, такими как, например, вирус PRRS, вирус гриппа, свиной парвовирус, вирус африканской лихорадки свиней и/или цирковирус свиней 2 (PCV-2). Однако, хотя Mycoplasma является наиболее эффективной в качестве антигена, когда ее выращивают в свиной сыворотке в качестве источника холестерина и т.д., сыворотка содержит антитела, которые могут мешать иммунизации против других патогенов, особенно PCV-2. Для снижения уровня или устранения антител к PCV2 антитела удаляют с помощью колонок с белком A/G (см., например, патент США №9120859), но это является трудоемким и затратным способом. Были разработаны культуральные системы с низким содержанием сыворотки (см., например, патент США №9273281), но они могут содержать загрязняющие факторы эукариотических клеток, и культивируемая таким образом Mycoplasma может не обладать оптимальной иммуногенностью.

Поэтому необходим улучшенный способ культивирования Mycoplasma, в котором рост оптимизирован, а загрязняющие примеси снижены или устранены, и иммуногенность сохранена. Для коммерческих целей способ должен быть рентабельным и легко реализуемым, а нежелательные примеси необходимо ограничить. В данном документе раскрыт рационально разработанный способ культивирования Mycoplasma, составы сред для осуществления указанного способа и вакцины, содержащие Mycoplasma, полученную с использованием указанного способа.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении предложена композиция, содержащая холинхлорид, ниацинамид, никотиновую кислоту, L-метионин, L-цистеин, путресцина дигидрохлорид, тиамина пирофосфат, L-аскорбат натрия, спермин, пиридоксаль-5'-фосфата моногидрат, тетрагидрофолиевую кислоту, 3'-дефосфокофермент и рибофлавин. Композицию можно использовать в качестве добавки для роста Mycoplasma («MGS»). Mycoplasma, которую выращивают с использованием MGS, может представлять собой М. hyosynoviae; M. suis; М. hyorhinitis; или М. hyopneumoniae («Mhp»). Mycoplasma, которую выращивают с использованием указанного способа, может представлять собой М. hyopneumoniae. Mycoplasma, которую выращивают с использованием MGS, может представлять собой любую Mycoplasma, способную расти в или на свинье, ткани или клетке свиньи. Компоненты MGS могут присутствовать в полной питательной среде в конечных концентрациях: около 0,5 мг/л холинхлорида; около 0,025 мг/л ниацинамида; около 0,025 мг/л никотиновой кислоты; около 0,1 мМ L-метионина; около 1,5 мМ L-цистеина; около 0,1 мМ путресцина дигидрохлорида; около 0,01 мг/л тиамина пирофосфата; около 0,284 мМ L-аскорбата натрия; около 0,1 мМ спермина; около 0,025 мг/л пиридоксаль-5'-фосфата моногидрата; около 0,05 мг/л тетрагидрофолиевой кислоты; около 0,025 мг/л 3'-дефосфокофермента А; и около 0,01 мг/л рибофлавина.

В данном изобретении предложен способ культивирования Mycoplasma, включающий помещение Mycoplasma в среду, содержащую основную питательную среду, сыворотку лошади; и добавку для роста Mycoplasma. Основная питательная среда выбрана из среды Фрея и среды со свиной сердечно-мозговой вытяжкой (p-BHI). MGS содержит холинхлорид, ниацинамид, никотиновую кислоту, L-метионин, L-цистеин, путресцина дигидрохлорид, тиамина пирофосфат, L-аскорбат натрия, спермин, пиридоксаль-5'-фосфата моногидрат, тетрагидрофолиевую кислоту, 3'-дефосфокофермент и рибофлавин. Компоненты MGS могут присутствовать в полной питательной среде в конечных концентрациях: около 0,5 мг/л холинхлорида; около 0,025 мг/л ниацинамида; около 0,025 мг/л никотиновой кислоты; около 0,1 мМ L-метионина; около 1,5 мМ L-цистеина; около 0,1 мМ путресцина дигидрохлорида; около 0,01 мг/л тиамина пирофосфата; около 0,284 мМ L-аскорбата натрия; около 0,1 мМ спермина; около 0,025 мг/л пиридоксаль-5'-фосфата моногидрата; около 0,05 мг/л тетрагидрофолиевой кислоты; около 0,025 мг/л 3'-дефосфокофермента А; и около 0,01 мг/л рибофлавина.

В данном изобретении предложен способ культивирования Mycoplasma, причем Mycoplasma, которую выращивают с использованием указанного способа, может представлять собой любую Mycoplasma, способную расти в или на свинье, ткани или клетке свиньи. Mycoplasma, которую выращивают с использованием указанного способа, может представлять собой М. hyosynoviae; M. suis; M. hyorhinitis; или М. hyopneumoniae («Mhp»). Mycoplasma, которую выращивают с использованием указанного способа, может представлять собой М. hyopneumoniae.

В данном изобретении предложен способ культивирования Mycoplasma, включающий помещение Mycoplasma в среду, содержащую основную питательную среду, сыворотку лошади; и добавку для роста Mycoplasma. Сыворотка лошади может присутствовать в полной питательной среде в количестве от около 2,5% до около 10% об./об. Сыворотка лошади может присутствовать в полной питательной среде в количестве от около 5% до около 10% об./об. Сыворотка лошади может присутствовать в полной питательной среде в количестве около 10% об./об. Сыворотка лошади может присутствовать в полной питательной среде в количестве около 2%, 2,5%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% или 10%.

В данном изобретении предложен способ культивирования Mycoplasma, включающий помещение Mycoplasma в среду, содержащую основную питательную среду, сыворотку лошади; и добавку для роста Mycoplasma, и культивирование Mycoplasma при 37°С в течение 3-15 дней. В данном изобретении предложен способ культивирования Mycoplasma, включающий помещение Mycoplasma в среду, содержащую основную питательную среду, сыворотку лошади; и добавку для роста Mycoplasma, и культивирование Mycoplasma при 37°С в течение 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 дней. Культивирование Mycoplasma может также включать перемешивание на орбитальном встряхивателе.

В данном изобретении предложен способ получения иммуногенной композиции, включающий помещение Mycoplasma в среду, содержащую основную питательную среду, сыворотку лошади; и добавку для роста Mycoplasma; инкубацию Mycoplasma при 37°С; и инактивацию Mycoplasma. Основная питательная среда выбрана из среды Фрея и среды со свиной сердечно-мозговой вытяжкой (р-BHI). MGS содержит холинхлорид, ниацинамид, никотиновую кислоту, L-метионин, L-цистеин, путресцина дигидрохлорид, тиамина пирофосфат, L-аскорбат натрия, спермин, пиридоксаль-5'-фосфата моногидрат, тетрагидрофолиевую кислоту, 3'-дефосфокофермент и рибофлавин. Сыворотка лошади может присутствовать в полной питательной среде в количестве от около 2,5% до около 10% об./об. Mycoplasma, которую включают в иммуногенную композицию, может представлять собой любую Mycoplasma, способную расти в или на свинье, ткани или клетке свиньи. Mycoplasma, которую включают в иммуногенную композицию, может представлять собой М. hyosynoviae; M. suis; M. hyorhinitis; или М. hyopneumoniae («Mhp»). Mycoplasma можно инактивировать с помощью 2-бромэтиламина.

В данном изобретении предложено применение MGS в производстве лекарственного препарата для профилактики, ослабления или улучшения состояния при заболеваниях, вызванных Mycoplasma. MGS содержит холинхлорид, ниацинамид, никотиновую кислоту, L-метионин, L-цистеин, путресцина дигидрохлорид, тиамина пирофосфат, L-аскорбат натрия, спермин, пиридоксаль-5'-фосфата моногидрат, тетрагидрофолиевую кислоту, 3'-дефосфокофермент и рибофлавин. Лекарственный препарат может представлять собой иммуногенную композицию или вакцину. Лекарственный препарат может быть эффективным для лечения человека и других животных, в том числе свиней.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1. Результаты полномасштабного анализа CCU трехдневных культур Mhp в указанных составах сред. Данные представляют среднее трех повторений эксперимента зг исключением того, что указанные три состава, содержащие Acutone, были включены только в один эксперимент.

Фиг. 2. Рост Mhp в шести различных составах сред в крупномасштабной системе биореактора, как определено в полномасштабном анализе CCU. Уровни CCU в 0 день оценивают на инокуляте.

Фиг. 3. Оценки поражения легких свиней, вакцинированных Mhp, выращенной в экспериментальных составах сред, а затем зараженных вирулентной Mhp. Суммарную оценку поражения легких осуществляют с использованием метода краниовентральной консолидации легочной ткани (CVPC) и выражают как процент общего поражения легкого, определяемый как сумма процентов поражения легкого в отдельных семи долях (правая верхушечная, правая сердечная, правая задняя, левая задняя, левая сердечная, левая верхушечная и медиальная) легких, умноженных на приблизительный объем каждой доли легкого, дающей вклад в целое легкое. Коммерческая вакцина FOSTERA (Zoetis Animal Health) представлена в качестве положительного контроля.

Фиг. 4. Титры антител, нейтрализующих PCV-2, в сыворотке вакцинированных свиней, что измерено с помощью ELISA. ELISA выполняли с помощью набора INGEZIM CIRCO IgG ELISA в соответствии с инструкциями производителя (Professional Veterinary Service, Inc.).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

При использовании в последующем обсуждении, термины в единственном числе следует понимать как охватывающие один или более, если иное не указано.

При использовании в данном документе, (Mycoplasma (микоплазма)» относится к любым видам, относящимся к семейству Mycoplasmataceae. Термин может означать отдельный организм или культуру, содержащую множество организмов. В частности, в это определение включены М. hyosynoviae, M. suis, M. Hyorhinitis и М. hyopneumoniae («Mhp»). При использовании в данном документе, «инактивированная» Mycoplasma означает организмы, которые больше не реплицируются в хозяине или культуре. Инактивированные организмы считаются уничтоженными или мертвыми. Инактивацию можно осуществить с помощью различных способов, в том числе, но не ограничиваясь этим, химическое изменение белков, химические или физические изменения в структуре клетки или химические или физические изменения в нуклеиновых кислотах.

При использовании в данном документе, «добавка для роста Mycoplasma» («MGS») означает рационально составленную композицию компонентов, которые, как установлено, являются важными для роста Mycoplasma. Идентификация компонентов основана на геномном анализе Mhp. MGS обычно получают в виде концентрированного раствора, который добавляют к составу основной питательной среды во время приготовления полной питательной среды. MGS, раскрытая в данном документе, содержит холинхлорид, ниацинамид, никотиновую кислоту, L-метионин, L-цистеин, путресцина дигидрохлорид, тиамина пирофосфат, L-аскорбат натрия, спермин, пиридоксаль-5'-фосфата моногидрат, тетрагидрофолиевую кислоту, 3'-дефосфокофермент и рибофлавин. Специалист в данной области техники знает некоторые солевые формы этих компонентов, которые могут быть взаимозаменяемыми.

При использовании в данном документе, «полная питательная среда» относится к культуральной среде, которая содержит необходимые органические факторы для роста указанного организма или клетки. Для Mhp полная среда содержит по меньшей мере основную питательную среду, сыворотку и MGS. «Конечная концентрация» означает концентрацию указанного компонента в полной среде.

При использовании в данном документе, среда «Фрея» и среда со «свиной сердечно-мозговой вытяжкой» («р-BHI») означает составы, указанные в Таблицах 11 и 12.

При использовании в данном документе, «иммуногенная композиция» представляет собой композицию, которая вызывает иммунный ответ при введении животному. Иммуногенная композиция содержит по меньшей мере один антиген и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Антиген может представлять собой целый вирус, бактерию или другой патоген, как живой, так и инактивированный. Антиген может также быть выделенной, очищенной или частично очищенной молекулой антигена от вируса, бактерии или другого патогена. Антиген может представлять полипептид, полисахарид, нуклеиновую кислоту или липид или их любую комбинацию.

При использовании в данном документе, «вакцина» представляет собой иммуногенную композицию, которая предоставляет защиту от, устойчивость к, профилактику или ослабление симптома заболевания, при введении животному, при этом указанный симптом вызван патогенным организмом, например бактерией, конкретнее Mycoplasma.

При использовании в данном документе, термин «свиной» и «свинья» относится к свиньям, любым животным из рода Sus семейства парнокопытных Suidae.

Специалисты в данной области техники понимают термин «около», и он будет изменяться в некоторой степени в зависимости от контекста, в котором он используется. При использовании в данном документе, предполагается, что «около» охватывает изменения ±10% от величины, с которой связан этот термин.

При использовании в данном документе, термины «лечащий», «лечить» или «лечение» включают сдерживание, замедление, остановку, ослабление, улучшение или обращение прогрессирования или тяжести существующего симптома, расстройства, патологического состояния или заболевания. Лечение можно применять профилактически или терапевтически.

Следующие экспериментальные примеры являются иллюстрацией способов культивирования Mycoplasma, в том числе материалов, пригодных для них, и применений таким образом культивированной Mycoplasma. Понятно, что другие варианты осуществления и применения будут очевидны для специалистов в данной области техники, и что изобретение не ограничено этими конкретными иллюстративными или предпочтительными вариантами осуществления.

Целью исследований, представленных в данном документе, является определить, можно ли М. hyopneumoniae успешно выращивать в среде без свиной сыворотки и без бычьей сердечно-мозговой вытяжки (или любых ингредиентов животного происхождения, если возможно). Наиболее эффективные составы затем будут применяться для получения материала для исследования эффективности у животных. Основная переменная отклика для оценки успеха новых составов сред представляла собой количество жизнеспособных клеток, оцененных с помощью анализа единиц изменения цвета (CCU). Анализ протеомики роста клеток в наиболее перспективных составах выполняют, чтобы определить, значимо ли влияет отсутствие свиной сыворотки на профиль экспрессии белка клетками, который может снижать антигенные свойства клеток и уменьшать иммуногенный эффект вакцины-продукта.

Все процентные содержания представлены в объемах на объем (об./об.), если иное не указано.

ПРИМЕР 1

Целью этого исследования является подтвердить идентичность штамма М. hyopneumoniae {Mhp) и установить рабочие исходные концентрации для дальнейшего проведения эксперимента.

Для установления рабочих исходных концентраций используют североамериканский штамм Mhp, обозначенный GL713 (активный ингредиент в PNEUMOSTAR MYCO). Для примеров 1, 4 и 5 аликвоту 0,5 мл пассажа Х+4 GL713 используют для инокуляции 25 мл среды Фриза (Teknova), которая содержит 10% свиной сыворотки (кат.№HyClone SH30908.04) в несообщающейся с атмосферой поликарбонатной колбой вместимостью 125 мл с дефлектором. Через 3 дня при 37°С при перемешивании на орбитальном встряхивателе (100 об./мин) 12,5 мл культуры используют для инокуляции 100 мл среды Фриза, которая содержит 10% свиной сыворотки в колбе вместимостью 500 мл. Через 3 дня к культуре добавляют 100 мл среды Фриза, которая содержит 20% глицерина с 10% свиной сыворотки, и перемешивают. Смесь делят на аликвоты (1 мл) и замораживают при -80°С для получения рабочего посевного материала Х+5. Во время осуществления представленных исследований культуры Mhp пересевают каждые 3-4 дня в свежую среду Фриза, которая содержит 10% свиной сыворотки для поддержания источника инокулята при пассаже Х+6.

Для подтверждения идентичности посевного материала GL713 геномную ДНК выделяют с использованием фенол-хлороформного способа. Количество и качество выделенного генома оценивают с использованием NANODROP (ThermoScientific) и электрофореза в агарозном геле. Электрофорез в агарозном геле демонстрирует наличие геномной ДНК, движущейся выше около 8 тыс. оснований. Анализ NANODROP демонстрирует выход геномной ДНК 77,3 нг/мкл.

Геномную ДНК анализируют с помощью методов полимеразной цепной реакции (ПНР) для подтверждения идентичности гена 16S рРНК. Вкратце, 50 мкл реакционной смеси для ПЦР готовят с использованием 25 мкл исходной реакционной смеси GREENTAQ НОТ START GREEN PCR (ThermoScientific), 1 мкл прямого праймера (5' GTAGAAAGGAGGTGTTCCATCC 3'; SEQ ID №: 1), 1 мкл обратного праймера (5' ACGCTAGCTGTGTGCTTAAT 3'; SEQ ID №: 2), 20,0 мкл H₂O и 3 мкл выделенной геномной ДНК. Для амплификации ПЦР исходную температуру денатурации 95°С выдерживают в течение 3 минут, а затем 35 циклов: температура денатурации 95°С в течение 30 секунд, температура отжига 60°С в течение 30 секунд и температура удлинения цепи 72°С в течение 1 минуты. Заключительную стадию удлинения цепи проводят при 72°С в течение 10 минут. Продукты ПЦР очищали с помощью набора для очистки ПЦР QIAQUICK (Qiagen). Количество и качество продуктов ПЦР оценивали с использованием NANODROP и электрофореза в агарозном геле. Результаты амплификации ПЦР показали продукт ПЦР размером приблизительно 1600 пар оснований, что коррелирует с ожидаемым размером 1503 пар оснований.

Очищенные продукты ПЦР разбавляют и смешивают с праймерами для получения предварительно смешанных образцов для секвенирования (GenScript). Продукты ПЦР секвенируют с обоих концов (т.е. с использованием как прямых, так и обратных праймеров). После секвенирования результаты анализируют с использованием средства поиска основного локального выравнивания, и подтверждают, что последовательность 16S рРНК GL713 на 99% идентична М. hyopneumoniae 232 (номер доступа GenBank АЕ017332).

ПРИМЕР 2

Для получения исходных материалов GL713 для применения в этих исследованиях аликвоту 1 мл пассажа Х+1 GL713 используют для инокуляции 50 мл среды Фриза, которая содержит 10% свиной сыворотки в несообщающейся с атмосферой поликарбонатной колбе вместимостью 250 мл с дефлектором. Через 4 дня при 37°С при перемешивании на орбитальном встряхивателе (100 об./мин) к культуре добавляют 15 мл свежей основной среды Фриза, которая содержит 20% глицерина, но без свиной сыворотки, и перемешивают.Аликвоты по 1 мл каждая замораживают при -80°С для получения Х+2 пред-пред-главных посевных материалов. Одну аликвоту используют для инокуляции 3×500 мл колб с дефлекторами, причем каждая содержит 100 мл среды Фриза, содержащей 10% сыворотки свиньи. Культуру инкубируют в течение 5 дней при 37°С при перемешивании при 100 об./мин на орбитальном встряхивателе. На 5 день 3 колбы объединяют, чтобы получить 300 мл культуры. Предглавный посевной материал при Х+3 получают путем объединения 300 мл культуры с 300 мл свежей основной среды Фриза, содержащей 20% глицерина (без сыворотки свиньи), и хранят в виде аликвот по 1,25 мл при -80°С. Предглавный посевной материал исследуют относительно выживаемости с использованием полномасштабного анализа CCU и относительно стерильности с использованием пластинок с кровяным агаром, которые инкубируют в аэробных и анаэробных условиях как при комнатной температуре, так и при 37°С. Во время осуществления представленных исследований культуры Mhp пересевают каждые 3-4 дня в свежую среду Фриза, которая содержит 10% свиной сыворотки для поддержания источника инокулята при пассаже Х+4.

Секвенирование полного генома Х+2 предпредглавного посевного материала осуществляют для дальнейшего подтверждения идентичности GL713 и для облегчения анализа путей для установления потенциальных метаболических/питательных возможностей или недостатков Mhp.

Высокомолекулярную геномную ДНК выделяют с использованием фенол-хлороформного способа. Количество и качество выделенного генома оценивают с использованием NANODROP и электрофореза в агарозном геле. Электрофорез в агарозном геле демонстрирует наличие геномной ДНК, движущейся выше около 8 тыс. оснований, а анализ NANODROP демонстрирует выход геномной ДНК 377,6 нг/мкл. Выделенную ДНК секвенируют в ACGT, Inc. (Уилинг, Иллинойс, США). После секвенирования контиги реферируют и анализируют их идентичность с помощью BLAST.

Секвенирование GL713 дает 38410897 необработанных считываний при секвенировании спаренных концов (paired end) и 3102689 считываний при секвенировании спаренных пар (mate pair). Конечная сборка дает 5 контигов. Оцененный размер генома GL713 составляет 862838 пар оснований. Анализ BLAST демонстрирует, что геномная последовательность GL713 на 99% идентичнаМ. Hyopneumoniae 232.

ПРИМЕР 3

Целью этого исследования является установить ключевые метаболические потребности Mhp посредством анализа метаболических путей. Геномные последовательности GL713 из Примера 2 иМ. hyopneumoniae 232 (номер доступа GenBank АЕ017332) анализируют с использованием следующих четырех подходов:

биоинформатический, пути идентифицируют путем сравнения геномов Mhp с геномами Escherichia coli и Coxiella burnetii;

геномы GL713 и 232 М. hyopneumoniae сканируют вручную относительно существующих метаболических путей;

информацию о путях собирают из опубликованной литературы (как компьютерное моделирование, так и экспериментальные исследования); и предсказанную информацию о путях у других видов Mycoplasma, в частности видах Mycoplasma человека, сравнивают с геномными последовательностями Mhp.

На основании этого анализа Mhp, по-видимому, не содержит пути для синтеза аминокислот, хотя в мембране существует несколько аминокислотных и пептидных транспортеров. Таким образом, для Mhp безусловно необходимы внешние источники аминокислот и/или пептидов.

Mhp обладает ограниченной возможностью синтеза липидов и не имеет распознаваемых путей биосинтеза жирных кислот.Таким образом, для Mhp безусловно необходимы внешние источники жирных кислот, глицерина, глицерофосфодиэфиров и холина. Холестерин, вероятно, необходим для стабильности мембраны и может адсорбироваться на клеточной поверхности, но не было обнаружено путей или транспортеров для использования холестерина.

Mhp не обладает способностью синтезировать de novo пурины и пиримидины для конструкций ДНК и РНК. Однако, Mhp обладает путями для использования L-аскорбата, который снабжает путь фосфата пентозы, и таким образом она может создавать фосфо-рибозные прекурсоры для синтеза ДНК и РНК. Таким образом, для Mhp необходимы внешние источники гуанина, аденина, цитидина, урацила и тимидина, а также внешний источник или L-аскорбата, или рибозы.

Mhp обладает полными путями для потребления глюкозы; и глюкоза, по-видимому, является предпочтительным источником углерода. Глюкоза вступает в гликолитический путь для получения пирувата; а пируват вступает или в ацетатный путь для получения ацетата в качестве конечного продукта, или в лактатный путь для получения лактата в качестве конечного продукта. Как гликолитический, так ацетатный пути образуют АТФ, а лактатный путь регенерирует НАД, который необходим для синтеза АТФ. Анализ CCU основан на превращении глюкозы в молочную кислоту, что приводит к изменению рН и как следствие к изменению цвета фенолового красного в средах. Таким образом, для Mhp в среде необходима глюкоза, хотя альтернативные источники углерода: маннит, фруктоза, глицерин, манноза, L-аскорбат, также возможны, поскольку Mhp обладает транспортерами для всех этих источников углерода в мембране. Один источник глюкозы может представлять собой сыворотку, которая содержит 1-2 мМ глюкозы. Однако, Mhp не имеет функционального цикла ТКК, и таким образом она не имеет необходимости в высоком уровне глюкозы как Е. coli вследствие отсутствия цикла ТКК и других путей с интенсивным потреблением глюкозы.

Среди всех видов Mycoplasma, охарактеризованных таким образом, только Mhp, по-видимому, содержит мио-инозитный катаболический путь. Таким образом, у Mhp мио-инозит может служит в качестве источника углерода и прекурсора для КоА. Транспортер для мио-инозита также имеется в мембране Mhp.

Среди кофакторов, необходимых для правильной метаболической активности, Mhp, по-видимому, не может синтезировать, а поэтому нуждается во внешних источниках тетрагидрофолата, 4-фосфопантотена, рибофлавина, пиридоксаль-5-фосфата и тиамина пирофосфата. Подобным образом, Mhp, по-видимому, не может синтезировать, а таким образом нуждается во внешних источниках полиаминов спермина и путресцина, хотя мембрана-интегрированные транспортеры для этих молекул присутствуют в Mhp. Другие возможные потребности в питательных веществах включают L-цистеин и метионин.

На основании сопоставленной информации, полученной из анализа путей, разработана добавка, названная добавка для роста Mycoplasma (MGS). Ингредиенты и их концентрации в этой добавке описаны в Таблице 1. Сопоставленную информацию о путях также можно применять для выбора основной среды и других ингредиентов, что экспериментально исследовано в следующих Примерах.

ПРИМЕР 4

Целью этого исследования является оценить рост GL713 Mhp в зависимости от следующих переменных с использованием укороченного анализа CCU:

1. Основная среда: бульон Vegetone (без животных ингредиентов; Sigma, кат. №41960), AF Фриза (без животных ингредиентов; экспериментальный состав Becton Dickinson, №партии CRD17082), AF PPLO (без животных ингредиентов; экспериментальный состав Becton Dickinson, №партии CRD 17079), Acutone (без животных ингредиентов, Neogen/Acumedia, кат.№7742А), среда Фриза (содержит бычью сердечно-мозговую вытяжку; Teknova, кат.№F0485), свиная сердечно-мозговая вытяжка (свиная BHI; Becton Dickinson, кат.№BD256120) и среда Фрея (содержит панкреатический гидролизат; Becton Dickinson, кат.№212346). Эти среды выбраны, чтобы обеспечивать основные питательные потребности Mhp на основании информации, полученной из анализа путей. Основные среды без животных компонентов включены для облегчения международной регистрации продукта-вакцины.

2. Источник сыворотки: свинья и лошадь. Хотя другие источники сыворотки, такие как курица, индейка и кролик, ранее применяли для роста Mycoplasma, стоимость анализа указывает на то, что эти источники сыворотки будут повышать стоимость среды для роста и поэтому не исследовались. Сыворотка лошади (Sigma, кат.№HI 138-500 мл) по стоимости сравнима с сывороткой свиньи.

3. Уровень сыворотки свиньи: 1, 5 и 10%. В наиболее используемом на данный момент составе среды, основной среде для микоплазмы Фриза (Teknova) используется 10% свиной сыворотки для роста. Если Mhp не растет в отсутствие свиной сыворотки, снижение уровня свиной сыворотки в среде может облегчать последующее удаление загрязняющих антител в антигенных препаратах Mhp.

4. Добавка для роста микоплазмы (MGS): 1X и 2,5Х. (Таблица 1).

5. Мио-инозит: 1X, 2Х и 10Х (SigmaAldrich). Анализ метаболических путей показывает, что Mhp содержит полный путь для катаболизма мио-инозита, свидетельствуя о том, что мио-инозит может служить как источник энергии для роста Mhp.

6. Select Phytone: На основании анализа путей Mhp не может синтезировать аминокислоты и содержит гены, кодирующие мембранные транспортеры для аминокислот и пептидов. Поскольку DIFCO SELECT PHYTONE UF (Becton Dickinson, кат.№210931) не содержит компонентов животного происхождения и является богатым источником аминокислот и пептидов, добавление этого питательного компонента может усиливать рост Mhp.

7. Экстракт из дрожжей: Экстракт из дрожжей (BD Biosciences) представляет собой богатый источник пептидов и аминокислот, который безусловно необходим Mhp для роста.

8. рН: 7,6 и 8,0. В Wodke et al. {Molecular Systems Biology 9: 653, 2013) авторы показали, что Mhp потребляла больше глюкозы и накапливала больше белка при рН 8,0 по сравнению с рН 7,5.

9. Экстракт яичного желтка: Яичный желток представляет собой богатый источник холестерина, жирных кислот и аминокислот. Ранее экстракт яичного желтка (SigmaAldrich) успешно применяли для выращивания Mycoplasma (Sasaki et al., Microbiol Immunol. 29(6): 499-507, 1985).

10. Глюкоза: 1, 2, 3 и 4 г/л. В общем, сыворотка содержит около 4 г/л глюкозы и на основании информации, полученной из анализа путей, глюкоза, по-видимому, является ключевым источником углерода для Mhp.Следовательно, исследовали влияние глюкозы на рост Mhp, особенно когда сыворотку не включали в состав среды.

11. Глицерин: Mhp содержит пути метаболизма глицерина, которые могут служить в качестве как источника углерода, так и прекурсора для биосинтеза липидов. Исследовали влияние глицерина на рост Mhp.

Для приготовления инокулята для этих экспериментов (Примеры 4 и 5), 100 мл среды Фриза, содержащей 10% свиной сыворотки, инокулируют в колбе с дефлектором вместимостью 500 мл с помощью 2×1 мл замороженного исходного материала Х+2. Mhp дают расти в течение трех дней, а потом рост оценивают с использованием упрощенного анализа CCU, поскольку полный анализ CCU является очень трудоемким и для его реализации необходимо большое пространство. Вкратце, тестируемый образец последовательно разбавляют в 10 раз, перемешивают и инкубируют в течение 3 дней при 37°С. Как минимум 2 неинокулированные пробирки включены в качестве отрицательного контроля. На рост указывает сдвиг рН, приводящий к изменению цвета фенолового красного от красного до желтого в средах. Рост Mhp коррелирует с накоплением молочной кислоты, которая вызывает сдвиг рН. На титр конечной точки указывает наибольшее разбавление (последнее), указывающее на рост Mhp.

Выполняют девять циклов тестирования составов сред с различными переменными. Результаты анализа CCU получают через 3 дня после приготовления; следовательно, в некоторых случаях следующий эксперимент ставят до того, как будут известны результаты предыдущего эксперимента. Культуры также подвергали исследованию на стерильность (т.е. загрязнение) на кровяном агаре в конце 3 дня культивирования.

Выводы, которые можно сделать из этого цикла тестирования переменных, заключаются в том, что регулирование рН сред до 8,0 не усиливает рост Mhp по сравнению с рН 7,6; бульон Vegetone и Select Phytone не поддерживают рост Mhp; сыворотка лошади, по-видимому, является заменителем свиной сыворотки; и MGS усиливает рост Mhp.

Выводы, которые можно сделать из этого цикла исследования переменных, заключаются в том, что мио-инозит, по-видимому, не усиливает рост Mhp, a Acutone (без животных ингредиентов) со свиной сывороткой поддерживает более высокий рост по сравнению с контролем. Результаты этого цикла также подтверждают то, что сыворотка лошади может заменять свиную сыворотку и что MGS усиливает рост Mhp.

Выводы, которые можно сделать из этого цикла исследования переменных, заключаются в том, что добавление глюкозы, по-видимому, не усиливает рост Mhp, и что, хотя MGS усиливает рост с основной средой Фриза, она не усиливает рост с основной средой Acutone.

Вывод, который можно сделать из этого цикла исследования переменных, заключается в том, что увеличение концентраций мио-инозита, по-видимому, не усиливает рост Mhp. Хотя Mhp растет лучше в Acutone со свиной сывороткой чем в контрольной среде, в отсутствие сыворотки или в присутствии сыворотки лошади Acutone не поддерживает рост Mhp.

Выводы, которые можно сделать из этого цикла исследования переменных, заключаются в том, что MGS усиливает рост с основной средой Фриза, но не с основной средой Acutone, и что Acutone не поддерживает рост Mhp в отсутствие свиной сыворотки.

Вывод, который можно сделать из этого цикла исследования переменных, заключается в том, что свиная BHI с сывороткой свиньи или сывороткой лошади ведет себя подобно среде Фриза в поддержании роста Mhp.

Вывод, который можно сделать из этого цикла исследования переменных, заключается в том, что снижение процентного содержания свиной сыворотки до 1% может задерживать рост Mhp, особенно с Acutone и свиной BHI. Другой вывод, который можно сделать из этого цикла исследования переменных, заключается в том, что снижение процентного содержания свиной сыворотки до 5% дает поведение, очень схожее с контролем с основной средой Фриза для поддержания роста Mhp, но 5% свиной сыворотки не поддерживает рост Mhp с Acutone и свиной BHI. Следует отметить, что этот цикл выполняли с MGS, который замораживали и оттаивали несколько раз, что объясняет неэффективное влияние MGS на рост Mhp.

Вывод, который можно сделать из этого цикла исследования переменных, заключается в том, что среда AF Фриза поддерживает рост Mhp подобно контрольной среде в присутствии свиной сыворотки, но в отличие от обычной среды Фриза среды AF Фриза и AF PPLO не поддерживают рост Mhp с сывороткой лошади и/или MGS.

Вывод, который можно сделать из этого цикла исследования переменных, заключается в том, что среда AF Фриза поддерживает рост Mhp подобно контрольной среде в присутствии свиной сыворотки, но в отличие от обычной среды Фриза среда AF Фриза не поддерживает рост Mhp с сывороткой лошади, MGS и/или экстрактом дрожжей.

ПРИМЕР 5.

Целью этого исследования является подтвердить потенциальные составы сред, идентифицированные в Примере 4, с помощью полномасштабного анализа CCU в трех независимых экспериментах.

Для приготовления инокулята для этих экспериментов, 100 мл среды Фриза, содержащей 10% свиной сыворотки, инокулируют в колбе с дефлектором вместимостью 500 мл с помощью 2×1 мл замороженного исходного материала. Для каждого экспериментального состава сред 25 мл культур (конечный объем) засевают 20% (т.е. 5 мл) 3-дневной старой культуры. Mhp дают расти в течение трех дней, а потом рост оценивают с использованием полномасштабного анализа CCU с тремя независимыми повторениями эксперимента. Полномасштабный анализ CCU проводят тем же способом, что и упрощенный анализ (Пример 4) за исключением того, что при полномасштабном анализе Mhp в образце разбавлениям дают расти в течение 14-15 дней при 37°С. Культуры также подвергают исследованию на стерильность (т.е. загрязнение) на кровяном агаре в конце 3 дня культивирования.

Исследуют восемнадцать различных составов сред:

Состав 1: Фриз+10% сыворотки свиньи+MGS

Состав 2: модифицированная свиная BHI+10% сыворотки свиньи+MGS

Состав 3: Фриз+10% сыворотки свиньи

Состав 4: модифицированная свиная BHI+10% сыворотки свиньи

Состав 5: Фриз+10% сыворотки лошади+MGS

Состав 6: Фриз+10% сыворотки лошади

Состав 7: Фрей+10% сыворотки лошади+MGS

Состав 8: модифицированная свиная BHI+10% сыворотки лошади

Состав 9: Фриз+MGS

Состав 10: Фрей+MGS

Состав 11: модифицированная свиная BHI+10% сыворотки лошади+MGS

Состав 12: Фрей+10% сыворотки свиньи

Состав 13: модифицированная свиная BHI+MGS

Состав 14: Фрей+10% сыворотки лошади

Состав 15: Acutone+10% сыворотки свиньи+MGS

Состав 16: Фриз

Состав 17: Acutone+10% сыворотки лошади+MGS Состав 18: Acutone+MGS

В этих экспериментах свиную сердечно-мозговую вытяжку (свиная BHI) модифицируют относительно инструкций производителя (Becton Dickinson, кат.№BD256120), как показано в Таблице 11.

Как показано на Фиг. 1, за исключением состава 17 (Acutone+10% сыворотки лошади+MGS) и состава 18 (Acutone+MGS), составы поддерживали рост Mhp, который сравним с контрольным составом, средой Фриза плюс свиная сыворотка. Другие составы сред, протестированные, но не показанные на фигуре, содержат еще две основные среды без животных компонентов производства Becton Dickinson, AF Фриза и AF PPLO. Эти среды также не поддерживали рост Mhp в отсутствие свиной сыворотки. Интересно то, что среда Фриза без сыворотки или MGS довольно хорошо поддерживала рост Mhp; однако, среда Фриза содержит бычью мозговую вытяжку, что не приемлемо для международной регистрации продукта. На Фиг. 1 также не показано то, что Mhp плохо растет в m-BHI и среде Фрея без сыворотки или MGS.

Из 16 составов сред, которые поддерживали рост Mhp, пять составов сред: среда Фриза+10% свиной сыворотки (контроль, состав 3), m-P-BHI+10% лошадиной сыворотки+MGS (Состав 11), m-P-BHI+10% лошадиной сыворотки+MGS (добавляют каждый день), m-P-BHI+MGS (состав 13), среда Фрея+10% лошадиной сыворотки+MGS (состав 7) и среда Фрея+MGS (состав 10) - использовали для дальнейшей проверки в большом масштабе (в противоположность масштаба колбы) в системе биореактора.

ПРИМЕР 6

Целью этого исследования является сравнить составы сред, выбранные из исследований в колбах (Пример 5), в крупномасштабной системе биореактора (Ambr 250, Sartorius), которая больше соответствует условиям коммерческого производства. Переменные, выбранные в этих экспериментах, представляют собой:

1. Основная среда: Фриз (контроль), Фрей и модифицированная свиная сердечно-мозговая вытяжка (m-P-BHI);

2. Сыворотка: 10% свиной сыворотки (контроль), 10% лошадиной сыворотки или без сыворотки; и

3. MGS: добавляют раз в сутки или только в исходную культуру. Для приготовления инокулята для этого эксперимента 25 мл культуры инокулируют с помощью 0,5 мл рабочего исходного материала, который выращивают в течение трех дней. Двадцать мл этого «прединокулята» используют для инокуляции 200 мл среды Фриза+10% свиной сыворотки с антивспенивателем FoamAway (Gibco, 0,75 мл/л). Инокулят инкубируют при 37°С с перемешиванием при 100 об./мин на орбитальном встряхивателе в течение трех дней до применения для инокуляции биореакторов при скорости 1% (об./об.).

Исследуют шесть различных составов сред: Состав 1: Фриз+10% сыворотки свиньи (контроль); Состав 2: m-P-BHI+10% сыворотки лошади+MGS;

Состав 3: m-P-BHI+10% сыворотки лошади+MGS (добавляли каждый день); Состав 4: m-P-BHI+MGS;

Состав 5: Фрей+10% сыворотки лошади+MGS; и

Состав 6: Фрей+MGS. Mhp культивируют в течение четырех дней в каждом из шести составов. Полномасштабные анализы CCU выполняют каждый день. В конце 3 дня отбирают аликвоты и подвергают исследованию на стерильность (т.е. загрязнение) на кровяном агаре. В конце четвертого дня культивирования Mhp собирают для протеомического анализа, как описано в Примере 7.

Как показано на Фиг. 2, Mhp, которая выращена в среде Фрея+10% сыворотки лошади+MGS (Состав 5), m-P-BHI+10% сыворотки лошади+MGS (Состав 2) и m-P-BHI+10% сыворотки лошади+MGS (добавляли каждый день) (Состав 3), очень подобна той, которая получена в контрольном Составе 1, среда Фриза+10% сыворотки свиньи. Однако, рост Mhp в m-P-BHI+MGS и среде Фрея+MGS является плохим по сравнению с контрольной средой. Одно возможное объяснение этого отличия от исследований в масштабе колбы в Примере 5 заключается в том, что исследования в биореакторе выполняют при очень низком содержании инокулята 1%, чтобы различить предельное влияние выбранных составов сред на рост Mhp.

ПРИМЕР 7.

Целью этого исследования является определить, значительно ли влияет отсутствие сыворотки свиньи и/или ингредиентов животного происхождения в выбранных составах сред на общий белковый профиль Mhp, который может снижать антигенные свойства клеток и уменьшать иммуногенный эффект продукта-вакцины.

Собирают приблизительно 80 мл из культур биореактора, описанных в Примере 6, и центрифугируют при 10000 об./мин в течение 30 минут при 4°С. Клеточный осадок промывают однократно 1 мл ледяного ФСБ, а затем лизируют в 8М мочевине, 150 мМ NaCl, 50 мМ Трис-Cl, рН 8,0 в течение 1 часа. Клеточный лизат подвергают MSBioWorks (Ann Arbor, Мичиган, США) для протеомического анализа.

Профили экспрессии белка при росте Mhp в выбранных составах сред очень подобны тем, которые получены для роста Mhp в среде Фриза плюс свиная сыворотка (контроль). Эти данные свидетельствуют о том, что отсутствие свиной сыворотки в выбранных составах сред, по-видимому, не изменяет профиль экспрессии белков Mhp. Mhp, выращенная в выбранных составах сред, может сохранять иммуногенность, подобную той, которая получена идя Mhp, выращенной в среде Фриза плюс свиная сыворотка, но это необходимо экспериментально подтвердить. Композиции финальных составов сред, которые будут использоваться для выращивания Mhp для in vivo определения эффективности иммуногенности, описаны в Таблице 12.

ПРИМЕР 8.

Целью этого исследования является оценить эффективность фракций Mhp комбинированных вакцин против Mhp и цирковируса свиней типа 2 (PCV-2), когда Mhp (исходный Х+3) выращивают в конечных составах сред. Эксперимент по вакцинации-заражению представляет собой контролируемое, рандомизированное и односторонне слепое исследование.

Для получения экспериментальных вакцин частицы, подобные вирусу PCV2, получают с использованием бакуловирусной экспрессионной системы в клетках Sf9 MCS (клеточная линия насекомого). Супернатант, содержащий антиген PCV2, (конечная концентрация 50 мкг/мл) смешивают с разбавителем-контролем или инактивированным Mhp с последующим добавлением состава W/O/W при конечной концентрации 50%-50%.

Экспериментальная вакцина Mhp, по-видимому, является эффективной, если: (1) снижение средней легочной консолидации в лечебной группе составляет>40% по сравнению с отрицательным контролем (группа 1), (2) сниженная доля среди вакцинированных составляет>0,35, и (3) более низкий 95%-й доверительный интервал сниженной доли составляет>0,2. У свиней возрастом 3-4 недели легочная консолидация после заражения среди животных, которые являются отрицательным контролем, прогнозируется на уровне 8-15% (средний ответ группы). Положительное влияние вакцины приравнивают к снижению среднего ответа группы вакцинированных животных по сравнению с контрольными. Снижение поражения легких у вакцинированных животных должно составлять по меньшей мере 40%. Набор данных тестируют настатистическую значимость (двухсторонний р<0,05) путем сравнения процента легочной консолидации, полученного у животных в вакцинированной группе, с процентом легочной консолидации, полученным у животных в невакцинированной (отрицательный контроль) группе после заражения вирулентной Mhp. Материал для заражения представляет собой GL713, выращенный в контрольных средах. Сниженную долю и связанный нижний 95%-й доверительный предел (LCB) для исследуемых вакцинированных групп (группы 1-5) по сравнению с контрольными группами (группа 7) оценивают относительно процента легочной консолидации. Группа 6 включена в качестве положительной контрольной группы.

Основной результат эксперимента представляет собой степень легочной консолидации у зараженных животных, которую оценивают при вскрытии и выражают как процент от общего размера легкого животного. Как показано на Фиг. 3, как и ожидалось, животные, вакцинированные только антигенами PCV-2, не защищены от инфицирования вирулентным Mhp.Когда Mhp выращивают в системе свиная BHI+HS+MGS, инактивированной путем добавления 2-бромэтиламина до конечной концентрации 4 мМ, и вводят в состав вакцины, антигены Mhp обеспечивают защиту от заражения вирулентным Mhp не зависимо от того, вакцину вводят внутрикожно или внутримышечно. Однако, антигены от Mhp, выращенной в основной среде Фрея+HS+MGS, являются эффективными только при введении внутримышечно. Три эффективные вакцины Mhp демонстрируют подобную или даже лучшую эффективность в сравнении с вакциной положительного контроля.

Данные каждодневного клинического осмотра оценивают и сообщают как вторичные результаты эксперимента. Таблица 15. Дополнительно, при вскрытии оценивают поражения в месте инъекции и качество мяса в местах иммунизации для различных экспериментальных вакцин, чтобы установить исходные данные для отмены забоя.

Конечная переменная исследования - определить, мешает ли антигенная фракция Mhp при выращивании в экспериментальных составах сред иммуногенности антигена PCV-2, когда антигены Mhp и PCV-2 объединены. Как показано на Фиг. 4, все экспериментальные вакцины способны вызвать появление антител к PCV2 при введении свиньям, хотя введенная внутрикожно Mhp (Фрей)+PCV2 снова действует недостаточно оптимально. Вакцинированные животные из групп 2-4 отвечают аналогично контрольной группе PCV2, группе 1.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID №: 1

Прямой праймер Mhyo-ПЦР-16S-pPHK 5' GTAGAAAGGAGGTGTTCCATCC 3'

SEQ ID №: 2

Обратный праймер Mhyo-ПЦР-16S-рРНК 5' ACGCTAGCTGTGTGCTTAAT 3'

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЭЛАНКО ЮэС ИНК.

<120> СОСТАВЫ СРЕД ДЛЯ МИКОПЛАЗМЫ

<130> P21680

<160> 2

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер Mhyo-ПЦР-16S-рРНК

<400> 1

gtagaaagga ggtgttccat cc 22

<210> 2

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер Mhyo-ПЦР-16S-rРНК

<400> 2

acgctagctg tgtgcttaat 20

<---

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены композиция - добавка для роста Mycoplasma hyopneumoniae, содержащая холинхлорид, ниацинамид, никотиновую кислоту, L-метионин, L-цистеин, путресцина дигидрохлорид, тиамина пирофосфат, L-аскорбат натрия, спермин, пиридоксаль-5’-фосфата моногидрат, тетрагидрофолиевую кислоту, 3’-дефосфокофермент и рибофлавин в заданном количестве; ее применение в производстве лекарственного препарата для профилактики, ослабления или улучшения состояния при заболеваниях человека или других животных, вызванных Mycoplasma hyopneumoniae; способ культивирования Mycoplasma hyopneumoniae в среде, содержащей основную питательную среду, выбранную из группы, состоящей из среды Фрея и среды со свиной сердечно-мозговой вытяжкой, сыворотку лошади и добавку для роста Mycoplasma hyopneumoniae; способ получения иммуногенной композиции, включающий культивирование Mycoplasma hyopneumoniae в среде, содержащей основную питательную среду, выбранную из группы, состоящей из среды Фрея и среды со свиной сердечно-мозговой вытяжкой, сывороткой лошади и добавкой для роста Mycoplasma hyopneumoniae, инкубацию Mycoplasma hyopneumoniae при 37°C; и инактивацию Mycoplasma hyopneumoniae. Изобретения обеспечивают рост Mycoplasma с сохранением иммуногенности. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 4 ил., 15 табл., 8 пр.

1. Композиция, содержащая холинхлорид, ниацинамид, никотиновую кислоту, L-метионин, L-цистеин, путресцина дигидрохлорид, тиамина пирофосфат, L-аскорбат натрия, спермин, пиридоксаль-5’-фосфата моногидрат, тетрагидрофолиевую кислоту, 3’-дефосфокофермент и рибофлавин;

причем композиция представляет собой добавку для роста Mycoplasma hyopneumoniae («Mhp») («MGS»), и где компоненты композиции присутствуют в конечных концентрациях:

0,5 мг/л холинхлорида;

0,025 мг/л ниацинамида;

0,025 мг/л никотиновой кислоты;

0,1 мМ L-метионина;

1,5 мМ L-цистеина;

0,1 мМ путресцина дигидрохлорида;

0,01 мг/л тиамина пирофосфата;

0,284 мМ L-аскорбата натрия;

0,1 мМ спермина;

0,025 мг/л пиридоксаль-5’-фосфата моногидрата;

0,05 мг/л тетрагидрофолевой кислоты;

0,025 мг/л 3’-дефосфокофермента A; и

0,01 мг/л рибофлавина.

2. Способ культивирования Mycoplasma hyopneumoniae, включающий помещение Mycoplasma hyopneumoniae в среду, содержащую:

основную питательную среду, выбранную из группы, состоящей из среды Фрея и среды со свиной сердечно-мозговой вытяжкой (p-BHI);

сыворотку лошади; и

добавку для роста Mycoplasma hyopneumoniae по п. 1.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что сыворотка лошади присутствует в количестве от 2,5 до 10% об./об.

4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что сыворотка лошади присутствует в количестве от 5 до 10% об./об.

5. Способ по п. 2, отличающийся тем, что сыворотка лошади присутствует в количестве 10% об./об.

6. Способ по п. 2, отличающийся тем, что Mycoplasma hyopneumoniae культивируют при 37°C в течение 3-15 дней.

7. Способ получения иммуногенной композиции, включающий:

культивирование Mycoplasma hyopneumoniae в среде, содержащей основную питательную среду, выбранную из группы, состоящей из среды Фрея и среды со свиной сердечно-мозговой вытяжкой (p-BHI); сыворотку лошади; и добавку для роста Mycoplasma hyopneumoniae по п. 1;

инкубацию Mycoplasma hyopneumoniae при 37°C; и

инактивацию Mycoplasma hyopneumoniae.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что инактивацию Mycoplasma hyopneumoniae осуществляют с помощью 2-бромэтиламина.

9. Применение MGS по п. 1 в производстве лекарственного препарата для профилактики, ослабления или улучшения состояния при заболеваниях человека или других животных, вызванных Mycoplasma hyopneumoniae.

10. Применение по п. 9, отличающееся тем, что лекарственный препарат предназначен для лечения свиней.