СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 1998 года по МПК C12M1/36 

Изобретение относится к способу получения биомассы, а также к устройству для осуществления этого способа.

В настоящее время в биотехнологической промышленности при использовании ферментеров, как правило, применяют периодические способы приготовления ферментационных растворов, производства биомассы и получения продуктов обмена веществ (например, патент США N 4176450). Эти способы обычно включают засевание питательной среды желательной культурой, культивирование в течение определенного промежутка времени при точно определенных условиях и сбор урожая микроорганизмов и/или получение желательного продукта обмена веществ.

Эти периодические способы, однако, обладают рядом недостатков. Так, стерилизация сред i.d.R. при используемой концентрации осуществляется при заполненном ферментационном резервуаре. В случае установок с емкостями более чем 1000 л рабочего объема при термической стерилизации сред должны устанавливаться высокие издержки на нагрев и охлаждение. Кроме того, из-за длительных времен пребывания среды при температурах выше 80^oC зачастую приходят к потере качества среды.

Затрата времени на стерилизацию составляет в общем несколько часов, что создает неблагоприятное соотношение между временем подготовки и рабочим временем. Соотношение тем неблагоприятнее, чем короче подлинное время ферментации, и при кратковременных ферментациях достигается соотношение 1:1.

Изобретение направлено на решение задачи разработки способа, при котором возможно, как при непрерывном, так и также в полунепрерывном и периодическом производстве, оптимальное приспосабливание условий культивирования к фазе роста культивируемого микроорганизма, оптимальное регулирование производства клеточной массы и/или образования катаболитов, и оптимально используется питательная среда для соответствующей цели.

Эта задача решается с помощью способа описанного вначале вида, согласно которому на начальном этапе проводят культивирование биомассы при исходной концентрации питательной среды, после чего концентрацию питательной среды повышают до необходимого уровня при полном заполнении ферментационной установки питательной средой, а на этапе непрерывного культивирования биомассы питательную среду заменяют, отделяют продукты обмена веществ и периодически собирают биомассу при рециркуляции клеток в стерильных условиях.

Предлагаемый в изобретении способ можно применять для культивирования бактерий и грибов самого различного рода. Особенно пригоден он для культивирования бактерий, как аэробных, так и также неаэробных, как грамположительных, так и также грамотрицательных. Особенно нужно назвать различные кокки, в особенности микрококки, планококки, дейнококки, стафилококки, стоматококки, стрептококки, Leuconostoc, педиококки, аэрококки, Gemella, пептококки, пептострептококки, руминококки, купрококки, а также семейство Sarcina. Далее, бактерии семейств Bacillus, Sporolactobacillus, Clostidium, Desulfotomaculum, Sporosarcina, Planococcus, Lactobacillus и Korthia.

Далее, пригодны бифидобактерии, бревибактерии, бактерии семейств Zumomonas, Acetobacter, Cluconobacter, Pseudomonad, Vibrio и Aeromonas. Далее, нужно назвать грамотрицательные анаэробные бактерии семейств Escherichia, Shigella, Edwazdsiella, Citrobacter, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia, Edwinia, Obesumbacterium, Kluyvera, Cedecea, Tatumella, Xenorhabdus и Rahnella. Грамотрицательные палочки и кокки, которые пригодны для предлагаемого в изобретении способа, представляют собой таковые семейств Pseudomonadaceae, Azotobacteraceae, Rhizobiaceae, Methylococcaceae, Halobacteriaceae, Acetobacterceae, Legionellaceae и Neisseriaceae.

Способ пригоден как для размножения и получения культивируемых в нем микроорганизмов, которые могут выделяться из способа и затем использоваться в другом месте, или, однако, для получения производимых микроорганизмами продуктов обмена веществ. При этом простым образом он позволяет оптимизировать выход микроорганизма или, однако, продукта обмена веществ, т.е. установить рабочий режим, при котором используется максимальная скорость размножения микроорганизма, или, однако, оптимальное превращение субстрата. Способ позволяет осуществлять установление рабочих режимов с незначительной долей получаемого обмена веществ на использование субстрата, что важно при производстве клеточной массы, или, однако, с высокой долей получаемого обмена веществ и незначительным производством клеток, что имеет значение при получении продуктов обмена веществ. Далее, способ позволяет достигать самого значительного использования соответствующей питательной среды и одновременно непрерывного вывода продуктов обмена веществ, благодаря чему избегают ингибирования субстрата.

Способ можно разделить на 5 стадий, которые протекают циклически после пуска установки и которые можно подразделить на следующие виды технологических задач.

1. Подготовка и стерилизация ферментационной установки и компонентов питательной среды.

2. Первый рабочий цикл установки при загрузочнообразном (периодическом) способе работы с более низкой концентрацией среды и частичным заполнением.

3. После достижения специфической концентрации среды переход к регулируемой дозировке среды вплоть до достижения конечного объема ферментации.

4. Переход к непрерывному осуществлению способа с обменом питательной среды и постоянной рециркуляцией клеток или с частичным отделением клеток.

5. Прекращение непрерывного осуществления ферментации и сбор урожая всей биомассы в стерильных условиях.

6. В случае необходимости новая загрузка питательной среды в стерильную установку и повторение процесса согласно стадиям 1 - 5 при экономии всего времени стерилизации и энергии.

Устройство для осуществления предлагаемого в изобретении способа со стерилизуемым ферментационным котлом, по крайней мере одним резервуаром для приема и термической стерилизации нестерильно отфильтровываемого компонента среды и/или по крайней мере одним запасным резервуаром для приема стерильно отфильтрованной компоненты среды со стерильным фильтром для непрерывного производства стерильной компоненты среды, а также со связанным с котлом для ферментации, стерилизуемым циклом с приспособлениями для отделения использованной питательной среды и продуктов обмена веществ, в случае которого стерилизуемый цикл имеет центрифугу для отделения и получения клеточной массы и с использованной (отработавшей) питательной среды.

Предпочтительные варианты осуществления этого устройства являются предметом зависимых пунктов формулы изобретения.

Предлагаемое в изобретении устройство и его функционирование описываются ниже при ссылке на чертеж.

Ферментер 1 через стерильную фильтрацию продувается воздухом и через со стерилизацией паром цикл соединяется с центрифугой 2. Насос 3 возвращает обратно в ферментер 1 отделенный в центрифуге 2 концентрат. Ферментер 1 загружается по выбору через резервуар 4 и/или через стерильную фильтрацию 5 с помощью стерильно отфильтрованной среды или непосредственно через резервуар 4 с помощью термически стерилизованной среды. Одновременно сборники среды 6 и 7 могут загружаться стерильно отфильтрованной средой. Сборник среды 6 дополнительно можно загружать через стерильную фильтрацию 8 с помощью стерильно отфильтрованной среды. Измерение, управление и регулирование всей установкой осуществляют через интегрированную систему управления процессом, которая запрограммирована специфически для процесса через программное обеспечение.

Пример реализации способа.

Осуществление типичной для способа ферментации на организме Lactobacillus curvatus штамм 2DSM N 4264.

Осуществление способа можно расчленить на 5 стадий, которые протекают циклически после запуска установки.

Стадия 1. Подготовка и стерилизация установки для ферментации и компонентов питательной среды.

Пред началом осуществления способа всю установку испытывают на герметичность и затем находят пусковые условия для подвода среды через места соответствующих вентилей. После этого ферментер подготовлен. Питательные среды уравновешивают и заполняют ими емкости и резервуары. Установку стерилизуют.

Стадия 2. Пуск ферментации через затравливание ферментера затравочной культурой, пуск системы управления процессом и первый рабочий цикл установки в периодическом режиме работы с более низкой концентрацией среды и частичным заполнением.

Во время протекания процесса все рабочие параметры поддерживаются постоянными. В конце стадии 2 достигается точка переключения на стадию 3. Точка переключения представляет собой определенную концентрацию глюкозы в среде. Вплоть до достижения используемой в качестве порога переключения концентрации глюкозы примерно 1 г/л глюкозы с начала ферментации потребляется определенное количество натрового щелока. Если этот расход достигается, то переключают.

Стадия 3. Переход к регулируемой дозировке среды вплоть до достижения конечного ферментационного объема.

Среду регулируемо дозируют через вещество-носитель - натровый щелок. В примере осуществляется дозирование ступенчато, что в случае имеющегося микроорганизма индуцирует очень быстрый рост.

В случае других микроорганизмов необходимо постоянное дозирования для оптимального роста. Через систему управления процессом можно осуществлять любым образом функции дозирования.

Стадия 4. Переход к непрерывному режиму работы с обменом питательной среды и полной рециркуляцией клеток или с частичным отделением клеток.

В случае имеющегося организма имеющийся в начале стадии 4 объем ферментера уменьшается при полной рециркуляции клеток, и затем добавляется среда. При дальнейшем протекании способа имеет место дальнейшая рециркуляция клеток с частичным отделением клеток. После этого снова дозируют среду. Описанное протекание стадии 4 характерно для используемого организма. Другие организмы управляются с помощью измененных интервалов отделения и дозирования или с постоянным отделением и дозированием.

Стадия 5. Прекращение непрерывной стадии ферментации и сбор урожая всей биомассы в стерильных условиях.

После полного расхода питательной среды, очевидно по окончании расхода натрового щелока, начинается сбор урожая. Сбор урожая управляется с максимальной мощностью отделения центрифугой без рециркуляции клеток. Обусловленная используемым организмом мощность сепаратора по сравнению с таковой в случае других организмов мала. Маленькая отделительная мощность сводится к окружающей организм сахаридной оболочке, которая затрудняет седиментацию. Другие организмы без сахаридной оболочки позволяют иметь в 2 - 3 раза более высокие отделительные мощности сепаратора. Обработанный в примере организм на основании вышеуказанного образования сахаридной оболочки и обусловленного этим плохого поведения при седиментации предъявляет высокие требования к проведению способа, так как можно работать только с относительно маленькими обменными скоростями среды.

Стадия 6. Новая загрузка стерильной питательной среды в стерильную установку и повторение процесса согласно стадиям 1 - 5 при экономии общего времени на стерилизацию и энергии.

По окончании стадии 4 в резервуаре для среды оставляют необходимое для низкоконцентрированной новой загрузки количество среды. Непосредственно после стадии 5 стерильный концентрат среды и стерильную воду подают насосом в ферментер 1 и тотчас затем осуществляют инокуляцию смеси с помощью новой затравочной культуры. После этого во время стадии 2 способа в резервуаре-сборнике среды 4, в сборнике 6 и сборнике 7 подготавливают дозируемые среды для непрерывной загрузки.

Назначение: изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения биомассы. Сущность изобретения: на начальном этапе культивирование биомассы проводят при исходной концентрации питательной среды и при частичном заполнении ферментационной установки питательной средой, после чего концентрацию питательной среды повышают до необходимого уровня при полном заполнении питательной средой ферментационной установки, а на этапе непрерывного культивирования биомассы питательную среду заменяют, отделяют продукты обмена веществ и периодически собирают биомассу при рециркуляции клеток в стерильных условиях. Устройство для осуществления способа содержит ферментационный котел, соединенный с ним стерилизуемый циркуляционный контур с устройствами отделения отработанной питательной среды и продуктов обмена веществ, не менее одного источника стерильной питательной среды и центрифугу для отделения биомассы и отработанной питательной среды. 2 с. и 21 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ получения биомассы, включающий введение в ферментационную установку исходного количества питательной среды, стерилизацию ферментационной установки, доведение количества питательной среды до необходимого уровня, введение затравочной культуры, проведение процесса ферментации, причем ферментационную смесь по крайней мере периодически направляют в циркуляционный контур, а продукты обмена веществ культивируемых клеток отделяют, отличающийся тем, что на начальном этапе культивирование биомассы проводят при исходной концентрации питательной среды и при частичном заполнении питательной средой ферментационной установки, после чего концентрацию питательной среды повышают до необходимого уровня при полном заполнении питательной средой ферментационной установки, а на этапе непрерывного культивирования биомассы питательную среду заменяют, отделяют продукты обмена веществ и периодически собирают биомассу при рециркуляции клеток в стерильных условиях. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что добавление питательной среды проводят в соответствии с ростом биомассы, причем при достижении максимального культивирования клеток концентрацию питательной среды поддерживают постоянной. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что добавление питательной среды проводят в соответствии с изменением постоянно определяемого параметра процесса. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве постоянно определяемого параметра используют значения pН, концентрацию диоксида углерода или кислорода. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что в ферментационной установке определяют значение рН и поддерживают его постоянным путем добавления основания определенной концентрации. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что добавляют эквивалентное израсходованному количеству основания количество питательной среды. 7. Способ по п.3, отличающийся тем, что питательную среду добавляют с учетом теоретической кривой, рассчитанной для выращиваемой культуры с учетом имеющейся массы клеток, скорости роста и условий культивирования. 8. Способ по пп. 1 7, отличающийся тем, что продукты обмена веществ и клеточную массу отделяют центрифугированием. 9. Способ по пп.1 8, отличающийся тем, что первоначально ферментационную установку загружают концентратом питательной среды. 10. Способ по пп.1 9, отличающийся тем, что исходную концентрацию питательной среды устанавливают посредством впрыска на холоду стерильной воды. 11. Способ по пп.1 10, отличающийся тем, что питательную среду добавляют в виде концентрата. 12. Способ по пп. 1 11, отличающийся тем, что при сборе биомассы ее частично рециркулируют. 13. Способ по пп.1 12, отличающийся тем, что при культивировании аэробных клеток культуру подают посредством обогащенного кислородом воздуха. 14. Способ по п.1, отличающийся тем, что операции полностью или частично повторяют в указанной последовательности. 15. Устройство для получения массы, содержащее ферментационный котел, соединенный с ферментационным котлом стерилизуемый циркуляционный контур с устройствами отделения отработанной питательной среды и продуктов обмена веществ и не менее одного источника стерильной питательной среды, соединенного с ферментационным котлом, отличающееся тем, что стерилизуемый циркуляционный контур содержит центрифугу для отделения биомассы и отработанной питательной среды. 16. Устройство по п.15, отличающееся тем, что источник стерильной питательной среды выполнен в виде резервуара для приема и термической стерилизации питательной среды. 17. Устройство по п.16, отличающееся тем, что источник стерильной питательной среды выполнен в виде емкости сборника для приема стерильно фильтруемой питательной среды со стерильным фильтром. 18. Устройство по п. 16, отличающееся тем, что центрифуга выполнена стерилизуемой паром и способной контролируемо удалять шлам. 19. Устройство по пп. 16 и 17, отличающееся тем, что ферментационный котел содержит зону для измерения параметров процесса. 20. Устройство по п. 19, отличающееся тем, что зонд предназначен для измерения величины pН, содержания глюкозы, кислорода и диоксида углерода. 21. Устройство по пп.16 20, отличающееся тем, что источник стерильной питательной среды содержит уровнемер и расходомер. 22. Устройство по пп.16 21, отличающееся тем, что между ферментационным котлом и центрифугой выполнен остановочный участок. 23. Устройство по п.22, отличающееся тем, что длина остановочного участка обеспечивает полное истощение питательной среды.