СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИЗИНА Российский патент 1998 года по МПК C12P13/08 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/15 

Изобретение относится к способу получения лизина.

Лизин является имеющей существенное значение аминокислотой и используется в большом объеме в качестве добавки к животному корму.

Получение некоторых аминокислот осуществляют, в общем, биосинтетическим путем и из уровня техники это уже давно известно. Используемые в качестве продуцентов штаммы бактерий отличаются способностью выделять эти аминокислоты в короткое время в высоких концентрациях в питательной среде. Во избежание высокой начальной концентрации субстрата, как правило, осуществляют периодический процесс культивирования.

Благодаря очень высокой мощности обмена вещества используемых штаммов-продуцентов решающее значение имеет проведение процесса ферментации так, чтобы максимальные значения в потребности кислорода и выделении тепла имели бы порядок величин, экономически выгодных.

Поэтому применяют различные приемы, которые регулируют метаболическую активность организмов таким образом, что, с одной стороны, обеспечивается снабжение кислородом и отвод тепла, с другой стороны, уравновешивается распределение образования биомассы и продукта.

Из патента Франции N 212558 известен способ с периодической "подкормкой", при котором метаболическая активность в фазе роста устанавливается через изменения pH, общее содержание биомассы через α -аминный азот.

В а.с. СССР N 1157059 описывается способ, предусматривающий выращивание культуры Corynebacterium glutamicum в жидкой питательной среде и последующее выделение лицина из культуральной жидкости. Данный способ осуществляется с периодической "подкормкой", при котором концентрация треонина служит в качестве критерия для подкормки, и содержание восстанавливающего соединения поддерживается при 3 - 5%.

Очень тонко осуществляемый способ известен из патента Франции N 8303487. В случае этого процесса имеются два непрерывно добавляемых питательных раствора: первый раствор фосфата лейцина, который добавляется так, чтобы через дополнительную добавку лимитировались как интенсивность обмена веществ, так и также образование биомассы. Второй питательный раствор, раствор сахара, добавляется так, чтобы действительная концентрация сахара поддерживалась в интервале 5 - 15 г/л. Из этого следует, что культура на основании ограничения за счет добавок фосфата/лейцина во время фазы "подкормки" в любой момент времени потребляет меньше сахара, чем имеется в распоряжении в питательной среде.

Этот вариант способа находится в соответствии с многократно документированным мнением, что нужно избегать как C-ограничения, так и также сильного C-избытка (например, патент ГДР N 269167). Например, в публикации Hadj Sassi и др., Biotechn. т. 10, N 8, с.583 - 586 (1988) предложили для этого даже 90 - 140 г/л глюкозы. Метаболическая активность, следовательно, всегда регулируется другой величиной, чем C-источник.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения лизина, который осуществляется при более высокой степени превращения используемого источника углерода (сахар), и при котором в свободной от биомассы сухой массе достигают более высокой концентрации лизина.

Предметом изобретения является способ получения лизина, предусматривающий выращивание культуры Corynebacterium glutamicum в жидкой питательной среде и последующее выделение лицина из культуральной жидкости, который характеризуется тем, что процесс выращивания ведут при поддержании концентрации ассимилируемого источника углерода на стадии ферментации менее 3 г/л. Ферментационную (питательную) среду составляют в остальном общеизвестным способом. Наряду с источниками углерода, такими как ассимилируемые сахара, сахароза, глюкоза, мелассы гидролизат крахмала, и ионами аммония в случае ауксотрофных продуцентов она содержит комплексные составные части в качестве источника для необходимых по причине одной или нескольких ауксотрофий органических добавок, например протеиновые гидролизаты в качестве источника α -амино-азота, витамины, а также неорганические соли. При сильном росте к началу ферментации речь идет в общем о логарифмической фазе роста. При необходимости ее можно сокращать за счет лимитирования добавок и/или источника углерода.

В связи с этим также имеется еще рост клеток. Однако его объем составляет только незначительную часть фазы, охарактеризованной как сильный рост.

Предпочтительно используют лейцин-ауксотрофные штаммы Corynebacterium glutamicum.

Ферментационная среда выбирается так, чтобы температура составляла 25 - 40^oC, предпочтительно 30 - 36^oC, pH-значение составляло 6 - 8, предпочтительно 7 - 7,5, и концентрация ионов аммония составляла 0,5 - 8 г/л. Бульон перемешивают и в достаточной степени обеспечивают кислородом.

При применении лейцин-ауксотрофного осадителя лизина соотношение сахар-лейцин в непрерывно добавляемой среде "подкормки" выбирается так, чтобы образование биомассы лимитировать через снабжение лейцином, одновременно, однако, дают только вес, часть сахара, которая могла бы вводиться во взаимодействие с указанной концентрацией лейцина.

Процесс выращивания ведут при поддержании концентрации ассимилируемого источника углерода на стадии ферментации менее 3 г/л.

Предпочтительно используют лейцин-ауксотрофные штаммы Corynebacterium glutamicum, и процесс ведут в условиях лимитирования лейцина до достижения концентрации менее 0,1 г/л после логарифмической фазы роста культуры.

В способе согласно изобретению предпочтительным является использование штамм-продуцента Corynebacterium glytamicum DSM 5715.

Осуществляемая согласно предлагаемому в изобретении способу ферментация обладает рядом решительных преимуществ по сравнению с вышеуказанными обычными процессами.

1. На металлическую активность и таким образом потребность кислорода, и теплообразование культуры можно влиять непосредственно и без замедления через скорость дозирования "подкормки" и приспосабливать к мощности ферментера.

2. Ферментационные бульоны отличаются более высоким содержанием продукта в общей сухой массе и таким образом большей чистотой.

Благодаря тому, что бактериальной культуре в течение всего периода времени "подкормки" предлагается меньше субстрата, чем она могла бы превратить, источник углерода таким образом представляет собой основное ограничение, предотвращается расход в направлении побочных продуктов.

3. Ферментации дают относительно процесса ферментаций с первичным лимитированием добавок более высокие выходы.

4. В случае мониторинга продукта ферментацию можно обрабатывать непосредственно и без последующего времени в оптимуме соответственно на плато, которое соответствует брутто-выходу в любой момент времени нетто-выхода.

5. В плане обработки, которая предусматривает прямое выпаривание ферментационного бульона, содержимое ферментера при технических нарушениях можно тотчас подавать на обработку, не затрагивая качества продукта за счет высокого содержания остаточного сахара.

Нижеследующие примеры показывают возможности осуществления способа согласно изобретению.

Пример 1 (сравнительный пример).

В ферментер с мешалкой и системой аэрации помещают 5,1 кг стерильного раствора, который содержит следующие компоненты, г:
Вода - 4540
Меласса - 26
Глюкоза - 125
Гидролизат кукурузной клейковины (сернокислый) - 35
Гидролизат продуцентной биомассы (сернокислый) - 320
Сульфат аммония - 45
Фосфорная кислота, 85%-ная - 7
Сульфат магния - 3,
другие минеральные соли, микроэлементы, а также биотин и тиамин, и с помощью раствора аммиака устанавливают pH-значение = 7,3. К раствору при 33 - 35^oC добавляют 0,6 л затравочной культуры Corynebacterium glutamicum DM 346-1, которая несет генетический маркер Ie^-, аминоэтил - резистентный и оксализин - резистентный. Затравочную культуру готовят путем инкубации в течение 15 ч при 33^oC и pH = 7 при перемешивании и аэрации в среде с 4,4% мас. добавки мелассы, 2% сахарозы и 14% гидролизата соевой муки (сернокислого) при добавке 3% сульфата аммония, 0,05% фосфорной кислоты и 0,02% сульфата магния, а также витаминов - биотина и тиамина.

При достаточном перемешивании, аэрации и установлении pH при значении примерно 7,3 с помощью водного раствора аммиака после окончания логарифмической фазы роста в основной ферментер, в течение 32 ч обычным образом непрерывно добавляют следующую нейтрализованную водным раствором аммиака среду так, чтобы измеряемая в ферментационном бульоне концентрация сахара составляла 5 - 35 г/л (ферментативные определения на сахарозу и глюкозу), г:
Вода - 1250
Меласса - 94
Глюкоза - 1465
Гидролизат кукурузной клейковины (сернокислый) - 39
Гидролизат продуцентной биомассы (сернокислый) - 265
Сульфат аммония - 31
Фосфорная кислота, 85%-ная - 4
Сульфат магния - 2,
другие минеральные соли, микроэлементы, а также биотин и тиамин. В конечном продукте ферментации после того, как весь ассимилируемый сахар в ферментационной среде израсходован, степень конверсии сахара в лизин составляет 35% в расчете на Lys x HCl, содержание лизинового основания в не содержащем биомассы, выпаренном ферментационном растворе составляет 45%.

Пример 2.

Приготовление инокулята, среда, помещаемая в основной ферментер, а также условия культивирования соответствуют указанным в примере 1 условиям.

Также среда 2, вплоть до следующей модификации, состоит из следующих составных частей, г:
Вода - 1560
Меласса - 75
Глюкоза - 1170
В этом опыте подкармливающую среду добавляют с такой же скоростью дозировки, как и в примере 1. Текущие анализы на ассимилируемый сахар показывают соответственно заявляемому здесь согласно изобретению способу, что во время всей продолжительности "подкормки" измеряемая концентрация ассимилируемых сахаров поддерживается ниже 3 г/л, однако поддерживается почти исключительно ниже 1 г/л. Анализы на лейцин в ферментационном бульоне с помощью анализатора аминокислот показывают, что в течение "подкормки после израсходования помещенного в среду 1 количества лейцина ни в какой момент времени концентрация лейцина не составляла более чем 0,05 г/л.

По окончании ферментации степень конверсии сахара в лизин (в расчете на Lys x HCl) составляет 40%, содержание лизинового основания в не содержащем биомассы, выпаренном бульоне ферментации составляет 54%.

Пример 3.

В реактор емкостью 10 м³ помещают 3980 кг стерильной среды, которая имеет следующий состав:
Сахароза - 320 кг
Меласса - 20 кг
Гидролизат кукурузной клейковины - 230 кг
25%-ный водный сульфат аммония - 150 кг
Лимонная кислота H₂O - 2,3 кг
Фосфорная кислота (89%-ная) - 6,6 кг
MgSO₄•7H₂O - 2,8 кг
CaCl₂•2H₂O - 75 г
FeSO₄•H₂O - 113 г
MnSO₄•H₂O - 113 г
ZnSO₄•H₂O - 5,6 г
CuSO₄•5H₂O - 0,6 г
Биотин - 1,1 г
Тиамин HCl - 0,8 г
NH₄OH (2 - 3%) - 1010 кг
Вода - 2258 кг
pH - 7,0
Содержимое емкости перемешивают при 33^oC и в достаточной степени аэрируют. После переноса 250 л инокулята штамма DM 282-2, который несет генетический маркер - лейцин - ауксотрофный и аминоэтилцистеин - резистентный (после 16 ч инкубации в среде с 6% мелассы, 14% гидролизата соевой муки, 1% сульфата аммония и 0,1% фосфорной кислоты при pH 7 и при 30^oC), в реактор емкостью 10 м³ значение pH устанавливают равным 7,0 с помощью водного раствора аммиака, аэрация устанавливается так, чтобы растворенный кислород всегда присутствовал в количестве выше 15% насыщения.

После того, как культура вырастает до оптической плотности (535 нм) примерно 30, добавляют продуцирующую среду следующего состава и со скоростью дозировки 30 л/ч:
Сахароза - 940 кг
Меласса - 50 кг
Гидролизат кукурузной клейковины - 180 кг
25%-ный водный раствор сульфата аммония - 80 кг
Лимонная кислота H₂O - 1 кг
Фосфорная кислота (89%-ная) - 2,8 кг
MgSO₄•7H₂O - 1,2 г
FeSO₄•H₂O - 48 г
MnSO₄•H₂O - 48 г
ZnSO₄•7H₂O - 2,4 г
CuSO₄•5H₂O - 0,3 г
Биотин - 0,6 г
Тиамин HCl - 0,4 г
NH₄OH (25%-ный) - 80 кг
Вода - 740 кг
pH - 7,5
Во время фазы продуцирования значение pH поддерживается 7,3. После израсходования помещенного в среду роста сахара согласно заявляемому здесь изобретению во время фазы "подкормки" концентрация ассимилируемого сахара не превышает 1 г/л, измеряемая концентрация лейцина ниже 0,05 г/л.

По окончании ферментации степень конверсии сахара в лизин (в виде Lys x HCl) составляет 32,3%, содержание лизинового основания в лишенном биомассы, выпаренном ферментационном бульоне составляет 54,7%.

Пример 4.

Приготовление инокулятя, параметры способа, а также среды в фазе роста и в продуцирующей фазе соответствуют указанным в примере 3 условиям. Впрочем, теперь подкармливают со скоростью дозировки примерно 100 л/ч. Благодаря этому после израсходования введенного в среду роста количества сахара измеряемые концентрации ассимилируемого сахара во время периода подкормки всегда отчетливо выше 5 г/л, однако измеряемая концентрация лейцина остается, как и прежде ниже 0,05 г/л. Степень конверсии сахара в лизин (в расчете на Lys x HCl) по окончании ферментации составляет 30,9%; содержание лизинового основания в лишенном биомассы бульоне ферментации составляет 43,5%.

Пример 5 (сравнительный пример).

Среда культивирования, роста и продуцирования соответствуют по своему составу средам примера 1, с тем различием, что глюкоза в среде роста заменена 25 г/л сахарозы, в продуцирующей среде глюкоза заменена 564 г/л сахарозы; параметры инкубации, включая приготовление инокулята, также идентичны.

В маленький ферментер с мешалкой и аэрацией помещают 0,82 кг (0,8 л) стерильной среды роста. К этому раствору при 33 - 35^oC добавляют 0,1 л затравки Corynebacterium glutamicum DSM 5715.

После достижения оптической плотности примерно 30 (535 нм) в течение 24 ч непрерывно добавляют 533 г (430 мл) продуцирующей среды. Во время подкормки измеряемое содержание сахара всегда выше 5 г/л в среде ферментации, содержание лейцина после израсходования помещенного в среду роста количества всегда ниже 0,05 г/л.

По окончании ферментации в среде определяют 74 г лизина в виде Lys • HCl, что соответствует степени конверсии 27% при использовании общего количества сахарозы 275 г. Содержание лизина во всей сухой массе составляет 30,5%.

Пример 6.

В опыте также со штаммом DSM 5715, в котором все параметры сред и инкубации идентичны условиям опыта 5, продуцирующую среду теперь добавляют в течение 39 ч непрерывно.

Согласно заявленному здесь способу в период "подкормки" после израсходования помещенного в среду роста источника углерода и лейцина действительная концентрация сахарозы ниже 1 г/л, концентрация лейцина ниже 0,05 г/л. По окончании ферментации в среде определено 89 г лизина (в виде лизин x HCl); степень конверсии составляет 32%. Содержание лизинового основания во всей сухой массе составляет 36,3%.

Способ получения лизина, предусматривающий выращивание культуры Corynebacterium glutamicum в жидкой питательной среде и последующее выделение лизина из культуральной жидкости. Способ характеризуется тем, что процесс выращивания ведут при поддержании концентрации ассимилируемого источника углерода на стадии ферментации менее 3 г/л. 2 з.п. ф-лы.

1. Способ получения лизина, предусматривающий выращивание культуры Corynebacterium glutamicum в жидкой питательной среде и последующее выделение лизина из культуральной жидкости, отличающийся тем, что процесс выращивания ведут при поддержании концентрации ассимилируемого источника углерода на стадии ферментации менее 3 г/л. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют лейцин-ауксотрофные штаммы Corynebacterium glutamicum и процесс ведут в условиях лимитирования лейцина до достижения концентрации менее 0,1 г/л после логарифмической фазы роста культуры. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют штамм-продуцент Corynebacterium glutamicum DSM 5715.