ВЕЩЕСТВО ДЛЯ ПРЕОДОЛЕНИЯ МУЛЬТИЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ Российский патент 1998 года по МПК A61K31/35 

Изобретение относится к производным фталазинона, обладающим противоаритмическим и анальгетическим действием.

Известно производное фталазинона-азеластин, успешно применяемое для лечения и профилактики бронхиальной астмы и аллергических и сезонных ринитов, синтез которого описан в патенте ФРГ DE 2164058.

В европейском патенте EP 222191 описано получение производного азеластина-флезеластина (D-18024-гидрохлорид) в виде рацемической смеси.

Найдены производные фталазинона общей формулы 1

где A - фенил (незамещенный, одно- или многократно замещенный галоидом), H или C_1-3-алкил, 2-фурил или 2-тиенил и R представляет собой

при Y = H или C_1-6-алкил, причем алкильный радикал может быть замещен возможно фенильным кольцом, гидроксильной или алкоксикарбонильной группой,
их физиологические приемлемые соли - продукты кислотного присоединения,
так же как оптические изомеры азеластина и оптические изомеры флезеластина обладают антиаритмической активностью.

Предположительно их можно объединить в класс III-соединения, обладающие антиаритмической активностью.

Кроме того, соединения обладают анальгетическим действием.

Представляемые изобретением соединения обладают также противорвотным действием. Противорвотное действие установлено в результате торможения рвоты, вызванной циспатином, у бодрствующих домашних свиней после орального или внутреннего применения последнего.

Результаты представляют собой количество случаев (приступов) рвоты за период наблюдения. Данные следует рассматривать как средние значения 5 различных экспериментов (см. табл. 1).

Получение соединений формулы I происходит в соответствии с пат. ФРГ DE 2164058, соединения формулы II получают по аналогии с методикой, изложенной в DE 2164058, пример 10.

Соединение формулы III получают аналогично данным примера 2 в EP 174464. Соединение формулы IV синтезируют в соответствии с методикой, представленной в EP 0222191 (пример 36).

Оптические изомеры азеластина и флезеластина получают с применением метода фракционной кристаллизации. Абсолютную структуру азеластина определяют с помощью рентгеноструктурного анализа.

Испытание противоаритмической активности проводят в соответствии со следующими рекомендациями:
Отбирают двадцать молодых кроликов смешанной породы обоего пола весом 1475±75 г (среднее значение ± S.E.). Животных забивают ударом по голове, извлекают сердце и полосы передней свободной стенки правого желудочка, а также вскрывают одну из сосочковых (папиллярных) мышц правого желудочка и закрепляют ее на дне термической ванны для органов ("нетоксичная резина"), заполненной раствором Лока. Раствор имеет следующий состав: Na⁺ - 140, K⁺ - 5,63, Ca²⁺ - 2,17, глюкоза - 11, HCO₃ - 25, Cl - 125, всего 309 моль/л, pH 7,4. Путем пропускания смеси 95% O₂ и 5% CO₂ раствор постоянно перемешивают и заряжают кислородом. Температуру в ванне поддерживают на уровне 32^oC. Выделенное левое предсердие, папиллярную мышцу и полосы передней свободной стенки правого желудочка раздражают электрическим путем с помощью прямоугольных импульсов 1 мс (продолжительность), сдвоенной пороговой интенсивности и частотой 100/мин. В ходе эксперимента определяют следующие электрофизиологические параметры: электрическое пороговое значение, эффективный рефракторный период и электропроводность. Эффективный рефракторный период, т. е. минимальный интервал между двумя следующими одна за одной электромеханическими реакциями, измеряют с помощью трехкратного порогового раздражения (1 мс прямоугольные волны) с применением DISA Mulitstim на различных временных отрезках по стимулу поступательного раздражения. Проводимость измеряют с применением осциллоскопа (Тектронис 2230) как разницу во времени между подачей поступательного стимула и появлением поверхностного потенциала, регистрируемого с помощью биполярного платинового электрода. Измеряется также возрастающая по силе способность к сокращению (максимальная сократительная способность) (сосочковая мышца, левое предсердие).

После 60 мин выдерживания в контрольном растворе для уравнения препараты извлекают и 60 мин подвергают действию 10 мкМ опытного раствора. За исключением воздействия на эффективные рефракторные периоды, измеряемого только на 30 и 60-ой мин, анализируют все параметры через 15 мин, т.е. четыре раза, при наличии указанной выше концентрации состава.

Данные, приведенные в табл. 1, представляют собой средние значения ± S. E. Влияние составов на различные параметры оценивают статистические с помощью T-текста. P-значения более 0,05 считают показательными.

Периферическое анальгетическое действие определяют по модели Writhing - теста, а также по модели Randall-Selitto - теста на боль при воспалительном процессе.

Результаты изложены в табл. 3.

При лечении цитостатическими средствами установлено, что после первых успехов в лечении новообразований происходит явление сопротивления лечению. Не приносит успехов и лечение другим цитостатическим средством.

Это явление называют мультиустойчивостью к лекарствам (МУЛ).(Vendrik, Bergers, de Jong, Steerenberg "Устойчивость к цитостатическим лекарствам на клеточном уровне". Cancer Chemother, Pharmacol. (1992), c.29, 413-429).

Представляемые изобретением соединения могут быть использованы также для получения лекарственных средств, позволяющих воздействовать на это явление.

Пригодность соединений для получения лекарственных средств, способных преодолеть это явление, определяют в ходе описанного ниже эксперимента.

Острая миелоидная лейкемия Brown Norway (МЛБН) напоминает острую миелоклеточную лейкемию у человека в отношении способности роста и химиотерапевтических реакций (для нового обзора по миелоидной лейкемии (МЛБН) см. Martlus и сотр. , Leukemia, с.4. 241-257. 1990). Для разработки клинически приемлемой устойчивой к лекарствам модели лейкемии выбирают одну из снятых с МЛБН клеточных линий, именуемую LT12. Преимущество этой линии состоит в том, что она может расти как in vivo, так и in vitro.

При введении (in vitro) человеческого гена mdre в геном ДНК путем переноса LT12-клетки становятся устойчивыми в отношении веществ. Для такого переноса, осуществляемого под контролем используемого ранее ускорителя для CMV-промотора, следуя сигналам HBY-полиаденилации, применяют вектор экспрессии pFRCMV mdrl 1.6, содержащий весь набор с ДНК mdrl I - гена человека. Трансфицированные отрезки ДНК отбирают с помощью митоксантрона и выдерживают с 200 нм митоксантрона при разделении веществ. Указанный метод дает возможность получить устойчивую к веществам LT12-линию клеток, именуемую LT12/mdr.

Конечная точка поточной цитометрии (количественное изучение клеток)
С помощью поточной цитометрии можно идентифицировать клетки на основании горизонтального (параметр величины) и вертикального (параметр структуры) рассеивания света. Для каждой клетки измеряют три величины активности, возбуждая ее лазерным лучом (0,6 Вт, 488 нм): вертикальное рассеивание, горизонтальное рассеивание (через ленточный фильтр 488 нм) и флуоресценция паунорубицина (через фильтр с длинной лентой 550 нм). Соединив полученные значения рассеивания с данными флуоресценции, можно исследовать содержание дауномицина в популяции клеток. При t=0 в суспензию клеток добавляют даунорубицин (конечная концентрация 2 мкм) и опытное соединение (конечная концентрация 1.0 мкМ. 3.0 мкМ или 10 мкМ). (2•10⁵ клеток/мл в RPMI-1640-среде без фенола красного). Клетки выдерживают в течение 90 мин при 37^oC. С помощью поточного цитометра путем измерения светлой флуоресценции при возбуждении 488-нм лазерным лучом определяют внутриклеточную концентрацию даунорубицина.

RPMI-1640 - среда без фенола красного выполняет роль отрицательного контроля. При каждом эксперименте применяют циклоспорин A (0.3, 1 и 3 мкМ) в качестве активного вещества. Мертвые клетки идентифицируют с применением невитального красителя Хехст АГ 33258 (по изменению окрашивания, возбуждение производят <0.2 Вт/УФ-лазерным лучом через длиннопроходной фильтр 405 нм). Мертвые клетки и детрит при анализе всегда исключают.

Периодическая поточная цитометрия
Периодическая поточная цитометрия представляет собой разновидность обычной поточной цитометрии, когда производят периодическое измерение пробы через интервал в несколько часов. Периодические предварительно определенные временные интервалы заложены в микрокомпьютер с указанием данных для 2000 клеток в так называемом List-Modt-Datei. Так как все необходимые параметры (например величина, структура, аккумуляция веществ и т.п.) для каждой клетки получены, можно провести последовательный обзорный анализ данных и повторные исследования.

Суспензию клеток хранят в реакционном сосуде с термостатической водной рубашкой, соединенной с кюветой цитометра, при 37^oC. Среду, содержащую клетки, сжимают, пропуская под давлением воздух через кювету. Другой вход в реакционный сосуд служит для добавления веществ, осуществляемый под наблюдением клеток. Поэтому метод периодической поточной цитометрии особенно пригоден для измерения (быстрых) кинетических изменений внутриклеточных концентраций веществ.

При таком эксперименте измерения начинают без даунорубицина в клеточной суспензии (2•10⁵ клеток/мл в RPMI-1640-среде без фенола красного). При t = 0 в клетки добавляют даунорубицин (конечная концентрация 2 мкМ). Нетто-поглощение даунорубицина клетками измеряют с интервалом в 60 мин, пока не будет достигнут равномерный уровень аккумуляции веществ. В этот момент в клеточную суспензию добавляют испытуемое вещество и снова в течение 60 мин измеряют аккумуляцию веществ. В суспензию клеток в качестве контрольного вещества (положительного) вводят циклоспорин А.

Результаты показывают пригодность представляемого изобретением вещества для данных целей. Необработанные LT 12/mdr-клетки показывают 23% флуоресценцию даунорубицина, неустойчивые клетки дают 100% флуоресценцию даунорубицина. Контрольное вещество цикло-А при концентрации 0,3 мкмоль дает 120% , при 1,0 мкмоль - 110% и при концентрации 3,0 мкмоль - соответственно 130% флуоресценцию даунорубицина.

Флезеластин при концентрации 0,1 мкмоль дает 60%, при 0,3 мкмоль - 110%, при 0,5 мкмоль - 130%, при 1,0 мкмоль - 130% и при 3,0 мкмоль - 140% флуоресценцию даунорубицина.

Азеластин при концентрации 0,1 мкмоль показывает 50% - , при 0,3 мкмоль 70% - , при 0,5 мкмоль 90% - , при 1,0 мкмоль 110% и при концентрации 3,0 мкмоль - 140%-ную флуоресценцию даунорубицина.

Изобретение относится к области медицины и касается вещества для преодоления мультилекарственной устойчивости. Сущность изобретения заключается в том, что в качестве вещества для преодоления мультилекарственной устойчивости используют производные фталазинона. 4 з.п.ф-лы, 3 табл.

1. Вещество для преодоления мультилекарственной устойчивости, отличающееся тем, что в качестве активного вещества оно содержит по меньшей мере одно производное фталазинона формулы I:

где А - незамещенный или одно- или многократно галоидозамещенный фенил, водород, С₁ - С₃-алкил, 2-фурил или 2-тионил;
R - означает остаток формул

где Y - водород или С₁ - С₆-алкил, причем алкильный остаток может быть замещен гидроксигруппой или алкоксикарбонильной группой,
или его оптический изомер, или физиологически переносимую кислотно-аддитивную соль этого фталазинонового производного или ее оптические изомеры в эффективном количестве. 2. Вещество по п.1, отличающееся тем, что в качестве производного фталазинона оно содержит соединение формулы II

3. Вещество по п.1, отличающееся тем, что в качестве производного фталазинона оно содержит соединение формулы III:

4. Вещество по п.1, отличающееся тем, что производным фталазинона является флезеластин или его оптический изомер. 5. Вещество по п.1, отличающееся тем, что производным фталазинона является соединение формулы IV
-