СПОСОБ БИОИНДИКАЦИИ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОЗДУШНОЙ СРЕДЫ Российский патент 1998 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/14 C12Q1/02 

Изобретение относится к методам биологического контроля качества окружающей среды и может быть использовано для выявления и оценки техногенного загрязнения атмосферного воздуха.

До настоящего времени при оценке побочных реакций, связанных с воздействием ксенобиотиков, основное внимание уделялось токсическим поражениям организма, повышающим показатели общей заболеваемости населения по отдельным нозологическим формам [1].

Известен способ биоиндикации загрязнения окружающей среды путем изучения структуры и динамики заболеваемости (смертности) в населенных пунктах и на территориях, подверженных действию экологически неблагоприятных факторов [2] .

Однако, известный способ основан на учете поздних нарушений в организме человека (заболеваний и смертности), в то время как основной задачей биоиндикации является обнаружение наиболее ранних, донозологических, предпатологических изменений, позволяющих сделать заключение об экологическом неблагополучии окружающей среды и принять меры по предотвращению или устранению действия экологически неблагоприятных факторов на здоровье человека.

Известны также способы биоиндикации загрязнения окружающей среды путем определения показателя бактерицидной активности кожи [3], обсемененности кожных покровов эпидермальным стафилококком [4].

Недостатком данных способов является то, что в первом случае [3] этот показатель варьирует у индивидуумов и имеет значительный разброс в течение суток; второй [4] неточен, так как состав микрофлоры меняется в зависимости от целого ряда причин, не связанных с собственно загрязнением окружающей среды.

Наиболее близким к заявляемому способу по совокупности существенных признаков является способ биоиндикации воздушной среды, заключающийся в том, что проводят обследование детей младшего школьного возраста на наличие резидентной микрофлоры золотистого стафилококка, находящегося на слизистой оболочке носоглотки, определяют значение соотношения величины резидентного стафилококкового бактерионосительства в обследуемой зоне (РВх) к подобной величине в фоновой зоне (РВк) и при значении данного соотношения больше 3 воздушную среду считают загрязненной [5].

Однако известный способ имеет ряд недостатков:
1. Обследование детей на стафилококковое бактерионосительство проводится двукратно с 1-1,5-месячным интервалом, что удлиняет сроки получения результатов, и требует большого числа манипуляций и значительного расхода питательных сред.

2. Учитывается бактерионосительство только золотистых стафилококков. Это существенно снижает достоверность получаемых результатов, так как известна способность эпидермальных стафилококков вызывать ряд заболеваний [6,7].

3. Способ разработан для определения границ санитарно-контрольных зон и степени профессиональной вредности работающих в газовой промышленности и рассчитан на индикацию только двух загрязнителей: сероводорода и двуокиси серы.

4. Способ позволяет сделать заключение об экологическом неблагополучии воздушной среды только при одновременном обследовании детского контингента в обследуемой и фоновой зонах.

Заявляемый способ решает задачу повышения достоверности и эффективности биоиндикации загрязнения воздушной среды.

Для решения указанной задачи в заявляемом способе биоиндикации воздушной среды, заключающемся в том, что определяют резидентное стафилококковое бактерионосительство у детей младшего школьного возраста, находят значение соотношения величины резидентного стафилококкового бактерионосительства в обследуемой зоне к подобной величине в фоновой зоне и при значении данного соотношения больше 3 воздушную среду считают загрязненной, о резидентном стафилококковом бактерионосительстве судят по наличию персистентных характеристик у штаммов золотистых и эпидермальных стафилококков, выделенных со слизистой оболочки переднего отдела носа, а в качестве фонового показателя принимают уровень резидентного стафилококкового бактерионосительства, равный 8,1.

Новым в способе биоиндикации загрязнения воздушной среды является то, что о резидентном стафилококковом бактерионосительстве судят по наличию персистентных характеристик у штаммов золотистых и эпидермальных стафилококков, выделенных со слизистой оболочки переднего отдела носа, а в качестве фонового показателя принимают уровень резидентного стафилококкового бактерионосительства, равный 8,1%.

Достигаемый при осуществлении изобретения технический результат состоит в том, что новый способ биоиндикации загрязнения воздушной среды, за счет совместного определения двух факторов персистенции (антилизоцимной и "антиинтерфероновой" активностей) у штаммов золотистых и эпидермальных стафилококков оптимально отражает уровень резидентного стафилококкового бактерионосительства (РСБ) и вследствие этого обеспечивает повышение достоверности биоиндикации, а также ее эффективности, так как появляется возможность определения экологического неблагополучия воздушной среды разных регионов с различными техногенными загрязнителями. Также предлагаемый способ позволяет ускорить биоиндикацию загрязнения воздушной среды за счет использования постоянного фонового показателя.

Известно определение резидентного стафилококкового бактерионосительства по наличию персистентных характеристик у золотистых и эпидермальных стафилококков, выделенных со слизистой оболочки переднего отдела носа: антилизоцимной активности [8], антииммуноглобулиновой активности [9].

Экспериментально установлена информативность совместного определения факторов персистенции: антилизоцимной (АЛА) и "антиинтерфероновой" (АИА) активностей золотистых и эпидермальных стафилококков при оценке стафилококкового носительства как показателя экологического состояния воздушной среды.

Для этого группу детей 8-11 лет в количестве 480 человек трехкратно обследовали на стафилококковое бактерионосительство. Исследуемый материал (клетки эпителия слизистой оболочки переднего отдела носа) стерильным ватным тампоном наносили на поверхность желточно-солевого агара и после 24-часовой инкубации при З7^oC проводили выделение чистых культур. У выделенных штаммов определяли видовую принадлежность, изучали биологические свойства и персистентные характеристики, штаммы золотистых стафилококков подвергали фаготипированию.

Дифференциация резидентного и транзиторного типов бактерионосительства проводилась по Г.Н.Чистовичу и включала сопоставление видовых и фаготиповых характеристик штаммов золотистых стафилококков [10], идентичность штаммов эпидермальных стафилококков доказывалась с помощью антибиотикограмм и определения биологических свойств микротестами фирмы "LACHEMA". У штаммов стафилококков были изучены следующие факторы вирулентности: продукция плазмокоагулазы, фибринолизина, лецитовителлазы, гемолизина, ферментация маннита в анаэробных условиях. Достоверных существенных различий по разным признакам, за исключением фибринолизина, выявлено не было (табл. 1). Наиболее часто этот признак обнаруживался у штаммов S.aureus - 88,5% культур (p<0,05) и S. epidermidis - 52,9% (p>0,05), выделенных от бактерионосителей резидентного типа.

Признаки антагоностической активности также неодинаково часто встречались среди штаммов стафилококков, выделенных от бактерионосителей разного типа. Штаммы, обладающие лизоцимной активностью, в 1,7-3,0 раза чаще выделялись от бактерионосителей транзиторного типа, в то время как у штаммов стафилококков, выделенных от бактерионосителей резидентного типа, в 90,1 и 76,2% случаев обнаруживалась бактериоциногения, а также в 2,6-3,0 раза чаще встречался антагонизм к музейному штамму Corynebacterium xerosis. Однако, данные различия между группами штаммов, выделенных от резидентных и транзиторных бактерионосителей, статистически недостоверны (p>0,05)
На следующем этапе работы у всех выделенных штаммов изучались антилизоцимная и "антиинтерфероновая" активности. Наличие указанных свойств, их сочетание, количественные показатели и средние значения имели отличительные особенности у разных видов стафилококков, выделенных от бактерионосителей резидентного и транзиторного типа. Распределение показателей и средние значения персистентных характеристик золотистых и эпидермальных стафилококков представлены в табл. 2. При изучении антилизоцимной активности у штаммов золотистых стафилококков, выделенных от резидентных бактерионосителей, выявлено, что признак встречался в 100% случаев с наиболее частым показателем 1мкг/мл (77,1%). Штаммы, выделенные от бактерионосителей транзиторного типа АЛА не обладали. "Антиинтерфероновой" активностью обладали все штаммы как золотистых, так и эпидермальных стафилококков, выделенных от бактерионосителей резидентного типа, причем наиболее часто (84,4% и 79,4%) регистрировался показатель 2 усл.ед. АИА среди штаммов стафилококков, выделенных у транзиторных бактерионосителей, обнаруживалась в 84,4 и 55,6% случаев соответственно c преобладанием значения 1 усл. ед.

При изучении средних значений указанных признаков было установлено, что АЛА в группе штаммов S.aureus, выделенных от резидентных бактерионосителей, составила 1,3 мкг/мл, от транзиторных 0 мкг/мл, средние значения АИА составили 2,8 и 1,7 усл.ед. соответственно.

Среднее значение АЛА в группе штаммов эпидермальных стафилококков, выделенных от бактерионосителей резидентного типа, составило 4,1 мкг/мл, от транзиторных- 1,2 мкг/мл. Средняя величина "антиинтерферонового" признака составила 2,4 и 1,2 усл.ед. соответственно.

Таким образом, проведенный анализ позволил выявить два ведущих признака, характеризующих резидентные штаммы золотистых и эпидермальных стафилококков и обладающих наибольшей информативностью при дифференциации их от транзиторных культур: антилизоцимная и "антиинтерфероновая" активности. При наличии у штаммов золотистых стафилококков обоих признаков (АЛА+, АИА больше 2 усл. ед. ), а у штаммов эпидермальных стафилококков при значении АЛА больше 4 мкг/мл и АИА больше 2 усл.ед., их относят к резидентным культурам, а детей, от которых выделяют подобные культуры, считают бактерионосителями резидентного типа.

Антилизоцимную и "антиинтерфероновую" активности у микроорганизмов определяют по известным методикам [11,12].

Обнаружение у исследуемого штамма совокупности антилизоцимной и "антиинтерфероновой" активностей с указанными выше количественными характеристиками, позволяет с вероятностью не менее 95% отнести его к разряду резидентных, а их отсутствие с вероятностью 95% - к числу транзиторных культур. В тоже время, при обнаружении только АЛА или АИА ошибка дифференциации оказывается достаточно велика (12,4-19,0%), что оставляет высокий процент штаммов в зоне диагностической неопределенности и вызывает необходимость использования в этом случае дополнительных дифференцирующих признаков.

Экспериментально установлено усиление персистентных свойств штаммов золотистых и эпидермальных стафилококков под воздействием различных техногенных факторов (табл. 3).

Таким образом, техногенные факторы внешней среды, существенно ухудшающие ее экологическое состояние, могут усиливать персистентные свойства микроорганизмов.

Установлено, что уровень распространения резидентных стафилококковых бактерионосителей, определенный по персистентным характеристикам выделенных штаммов, можно использовать как показатель экологического состояния воздушной среды.

При сравнении результатов обследования детского контингента с величинами загрязнения воздушной среды различными техногенными факторами выявлена стойкая тенденция к росту уровня резидентного стафилококкового бактерионосительства по мере нарастания интенсивности загрязнения воздушной среды различными техногенными факторами.

Как видно из табл. 4, уровень содержания практически всех ингредиентов в атмосферном воздухе городов Медногорска, Новотроицка, Кувандыка достаточно близок, но более высокие цифры характерны для Медногорска и Новотроицка. Можно констатировать в данных населенных пунктах достаточно высокий уровень загрязнения диоксидом серы, диоксидом азота, взвешенными веществами. В атмосферном воздухе г. Кувандыка регистрировались высокие концентрации фтористого водорода (2ПДК), г. Медногорска - диоксида серы (4ПДК), г. Новотроицка - фенола (2ПДК). Основными источниками техногенного воздействия на атмосферный воздух являются Медногорский медно-серный металлургический комбинат, Южно-Уральский криолитовый завод (г. Кувандык), Орско-Халиловский металлургический комбинат (г. Новотроицк), завод хромовых соединений (г. Новотроицк). Уровень резидентного стафилококкового бактерионосительства составил в г. Кувандыке 31,7%, г. Медногорске 32,8%, г. Новотроицке 41,2%.

Проведенный анализ экологической ситуации аэротехногенного загрязнения воздушной среды в г. Соль-Илецке показал отсутствие в воздушной среде взвешенных веществ, диоксида серы, сероводорода, фтористого водорода, фенола, содержание диоксида азота и окиси углерода составило 0.003 мг/м³ данное значение в 13 и 1000 раз меньше ПДК, что можно объяснить отсутствием в городе крупных промышленных предприятий. Уровень резидентного стафилококкового бактерионосительства составил 7,9%.

Таким образом, установлена положительная корреляционная связь (r=0,92) между загрязнением окружающей среды и уровнем резидентного стафилококкового бактерионосительства.

Экспериментально установлен уровень резидентного стафилококкового бактерионосительства, используемый в качестве фонового показателя.

Для этого, на протяжении 3 лет было обследовано 7800 детей, проживающих на территории 13 районов и 4 городов Оренбургской области и 9 населенных пунктах Астраханской области.

Средние данные по распространению резидентных стафилококковых бактерионосителей среди детей и выбросами загрязняющих веществ в атмосферу представлены в табл. 5.

Анализ показателей техногенного загрязнения воздушной среды позволил выделить три группы районов с различными уровнями выбросов загрязняющих веществ в атмосферу. В группе районов с высоким уровнем выбросов загрязняющих веществ в атмосферу (от 7,3 до 167,9 тыс. т. в год) уровень резидентного стафилококкового бактерионосительства колебался от 24,5 до 41,2%; в группе районов со средним уровнем выбросов загрязняющих веществ в атмосферу (от 4 до 4,8 тыс. т в год) уровень РСБ составил 16,1-19,3%; в группе районов с низким уровнем выбросов загрязняющих веществ в атмосферу (0,1-3,0 тыс.т в год) уровень резидентного стафилококкового бактерионосительства колебался от 2,1 до 12,5%.

Для определения фонового показателя РСБ, характеризующего экологически чистые районы, были отобраны территории с низким уровнем загрязнения, в которых средняя частота встречаемости среди детей резидентных стафилококковых бактерионосителей составила 8,1%.

Учитывая, что уровень распространения резидентных стафилококковых бактерионосителей, определенный по персистентным характеристикам выделенных штаммов, можно использовать как показатель экологического состояния воздушной среды, провели сравнительный анализ заявляемого способа биоиндикации загрязнения воздушной среды и способа-прототипа (табл.6).

Как видно из табл. 6, предлагаемый способ позволяет повысить эффективность определения загрязнения окружающей среды по сравнению с прототипом в 2 раза. Способ-прототип рассчитан на индикацию загрязнения воздушной среды районов добычи и транспортировки газа, заявляемый же способ позволяет за счет повышения эффективности определения уровня резидентного стафилококкового бактерионосительства определять экологическое состояние воздушной среды в различных районах с широким спектром загрязнителей. Способ осуществляется следующим образом. В каждом исследуемом населенном пункте обследуют не менее 100-200 детей, у которых тампоном со слизистой оболочки носовых ходов отбирается слизь и спущенные эпителиальные клетки. Отобранный материал высевается на элективные питательные среды для стафилококков (желточно-солевой агар, молочно-солевой агар и т.д.). Выросшие колонии пересевают на скошенный агар, идентифицируют при помощи тест-систем (стафилотесты фирмы "Lachema"). О резидентном стафилококковом бактерионосительстве судят по наличию персистентных характеристик (АЛА, АИА) у золотистых и эпидермальных стафилококков. При наличии у штаммов золотистых стафилококков обоих признаков (АЛА+, АИА больше 2 усл.ед.), а у штаммов эпидермальных стафилококков при значении АЛА больше 4 мкг/мл и АИА больше 2 усл.ед., их относят к резидентным культурам, а детей, от которых выделяют подобные культуры, относят к бактерионосителям резидентного типа.

На основании данных результатов получают величину резидентного стафилококкового бактерионосительства в обследуемой зоне.

Находят значение соотношения величины резидентного стафилококкового бактерионосительства в обследуемой зоне к подобной величине в фоновой зоне, равной 8,1% и при значении данного соотношения больше 3, делают заключение о загрязнении воздушной среды.

Пример 1. При проведении биоиндикации загрязнения воздушной среды в Оренбургской области было проведено сравнительное изучение уровня распространения резидентного стафилококкового бактерионосительства среди детей, проживающих в экологически контрастных районах. В каждом из населенных пунктов у 100 детей отбирались пробы слизи, которые засевались на желточно-солевой агар. Выросшие колонии выделяли в чистой культуре и идентифицировали при помощи тест-систем. Тип бактерионосительства определяли по персистентным характеристикам выделенных штаммов (АЛА+АИА). При наличии у штаммов золотистых стафилококков обоих признаков (АЛА+, АИА больше 2 усл.ед.), а у штаммов эпидермальных стафилококков при значении АЛА больше 4 мкг/мл и АИА больше 2 усл.ед., их относят к резидентным культурам, а детей, от которых выделяют подобные культуры, относят к бактерионосителям резидентного типа. Обследование проводили однократно. Результаты проведенных исследований представлены в табл. 7. Из таблицы видно, что в группе районов с низким уровнем бактерионосительства (от 2,1 до 10,0%) наблюдалась низкая степень загрязнения воздушной среды (от 0,1 до 2,6 тыс.т). Высокий процент резидентных бактерионосителей (от 30,3 до 41,2) отмечался в экологически контрастных районах, в которых уровень загрязнения воздушной среды колебался от 63,3 до 167,9 тыс т.

В дальнейшем проводили подсчет соотношений величин, полученных в обследуемых населенных пунктах, к подобной величине в фоновой зоне, равной 8,1%. Учитывая тот факт, что высоким значениям загрязнения атмосферного воздуха соответствуют величины данного соотношения больше 3, делается вывод о высоком уровне загрязнения воздушной среды в гг.Новотроицке, Медногорске, Оренбургском районе.

Пример 2. Биоиндикация загрязнения атмосферного воздуха в районе Астраханского газоперерабатывающего завода осуществлена согласно примеру 1. Выявленные значения уровней резидентного стафилококкового бактерионосительства и их согласование с результатами химического анализа атмосферного воздуха представлены на табл. 8. Установлено, что значение уровня резидентного стафилококкового бактерионосительства, равное 35,9% регистрируется в п. Сеитовка. Сопоставление полученных результатов с данными химического анализа атмосферного воздуха (превышение ПДК по H₂S и SO₂, CU, Zn, Hg) выявило высокую степень положительной корреляционной связи. В атмосферном воздухе п. Бузан содержатся Cu, Zn, Hg, превышающие предельно допустимые концентрации. Уровень резидентного стафилококкового бактерионосительства в этом населенном пункте составил 27,3%. В п. Камызяк, в котором не выявлено превышений ПДК ни по одному загрязнителю, уровень резидентного стафилококкового бактерионосительства составил 8,1%.

В дальнейшем проводили подсчет соотношений величин, полученных в обследуемых населенных пунктах, к подобной величине в фоновой зоне, равной 8,1%. При этом значения более 3 регистрировались в населенных пунктах, характеризующихся высоким уровнем загрязнения атмосферного воздуха (пп. Сеитовка, Бузан).

Таким образом, с помощью показателя резидентного стафилококкового бактерионосительства удается выявить и оценить уровень техногенного загрязнения окружающей среды, а также ранжировать населенные пункты по экологическому состоянию.

Осуществление способа позволяет провести экологическое картирование исследуемых областей и охарактеризовать загрязнение окружающей среды. В настоящее время предлагаемый способ используется для проведения экологического мониторинга Оренбургской области.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Винокур И. Л., Гильденкнольд Р.С., Ершова Т.Н., Садекова Г.П. и др. Методические подходы к изучению влияния комплекса факторов окружающей среды на здоровье населения. //Гигиена и санитария. 1989, N 5, с.4-6.

2. Ткаченко В.А., Полубелов А.А., Немирович Л.И. Модель мониторинга здоровья работников промышленного предприятия. //Проблемы мониторинга за здоровьем населения пром.городов. - Ангарск, 1989, ч.1, с.186-187.

3. Воробьева А.И., Стрельникова Л.А., Раткина В.Г. Влияние атмосферных загрязнителей на активность лизоцима и бактерицидность кожи у детей. //Вирусные и бактериальные препараты. Том.НИИ вакцин и сывороток. 1983, т. 31,с.210-243.

4. Шубик В. М. Проблемы экологии человеческой иммунологии. //М. , "Медицина", 1976, с.65-120.

5. Патент N 1793740, кл. C 12 Q 1/14. (прототип).

6. Белоусова З.Ф., Журавлева С.Л. Роль эпидермального стафилококка как возбудителя воспалительных заболеваний глаз и его придатков.//Актуальные вопросы клинической микробиологии в неинфекционной клинике: Тез.Докл. II Всесоюз.конф. - 21-22 июня 1988 г, М., 1988. ч.2, с.111.

7. Захарьевская Н. С., Усачева С.Ю., Миловидова О.В. Роль коагулазоотрицательных стафилококков при гнойно-воспалительной патологии новорожденных. //Актуальные вопросы клинической микробиологии в неинфекционной клинике: Тез.докл. II Всесоюз.конф.- 21-22 июня 1988, ч.2 с.84-85.

8. Чернова О.Л. Антилизоцимная активность стафилококков при бактерионосительстве. /Под ред. О.В.Бухарина. -Куйбышев, 1987, с.22-30.

9. Михайлова Е.А., Луда А.П., Бигеев М.И. Антииммуноглобулиновая активность бактерий. /Под ред. О.В.Бухарина. - Куйбышев, 1990, с.107-117.

10. Чистович Г.Н. Эпидемиология и профилактика стафилококковых инфекций. -Л., 1969.

11. Бухарин О. В., Усвяцов Б.Я. и др. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов. //Ж.микробиология, 1984, N 2, с.27-28.

12. Авторское свидетельство N 1564191, МПК 5 C 12 Q 1/02, 1990.

Изобретение относится к методам биологического контроля качества окружающей среды и может быть использовано для выявления и оценки техногенного загрязнения атмосферного воздуха. Способ биоиндикации загрязнения воздушной среды заключается в том, что определяют резидентное стафилококковое бактерионосительство у детей младшего школьного возраста. Находят значение соотношения величины резидентного стафилококкового бактерионосительства в обследуемой зоне к подобной величине в фоновой зоне и при значении данного соотношения больше 3 воздушную среду считают загрязненной. Причем о резидентном стафилококковом бактерионосительстве судят по наличию персистентных характеристик у штаммов золотистых и эпидермальных стафилококков, выделенных со слизистой оболочки переднего отдела носа, а в качестве фонового показателя принимают уровень резидентного стафилококкового бактерионосительства, равный 8,1%. 8 табл.

Способ биоиндикации загрязнения воздушной среды, предусматривающий определение резидентного стафилококкового бактерионосительства у детей младшего школьного возраста, нахождение значения соотношения величины резидентного стафилококкового бактерионосительства в обследуемой зоне к подобной величине в фоновой зоне и считывают воздушную среду загрязненной при значении данного соотношения больше 3, отличающийся тем, что определение резидентного стафилококкового бактерионосительства проводят по наличию персистентных характеристик у штаммов золотистых и эпидермальных стафилококков, выделенных со слизистой оболочки переднего отдела носа, а за величину резидентного стафилококкового бактерионосительства в фоновой зоне принимают постоянный фоновый показатель, равный 8,1%.