СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИЛАКТОФЕРРИНОВОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2000 года по МПК C12Q1/02 C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в исследовательской работе НИИ и практической работе бактериологических лабораторий клинических учреждений, определяющих персистентные характеристики микроорганизмов для установления их этиологической значимости при патологических процессах.

В настоящее время характер течения большинства инфекций изменился в сторону увеличения доли затяжных и хронических форм [1].

Длительное переживание бактерий в организме хозяина (бактерионосительство), а также переход инфекционного процесса в хроническую форму обеспечивают механизмы персистенции микроорганизмов, инактивирующие ряд факторов естественной противоинфекционной резистентности: лизоцим, комплемент, интерферон [2], тромбоцитарный катионный белок [3] и др. В настоящее время все большее внимание уделяется изучению свойств патогенных микроорганизмов, направленных на инактивацию факторов естественной резистентности организма хозяина.

Известны способы определения антилизоцимной [4], "антиинтерфероновой" [5] , антииммуноглобулиновой [6] , антикомплементарной [7] и антитромбоцитарной катионно-белковой [3] активностей микроорганизмов.

В настоящее время установлено, что природный гликопротеин лактоферрин обладает рядом защитных свойств: бактериостатическим и бактерицидным действием [8] , принимает участие в процессах местной защиты слизистых оболочек [9] , в регуляции гуморальных и клеточных иммунологических реакций, в противовоспалительных процессах, воздействует на систему комплемента, регулирует гранулоцитопоэз [10], гемопоэз по принципу обратной связи [11].

Актуальность разработки способа определения антилактоферриновой активности микроорганизмов определяется открывающейся при этом возможностью повышения точности диагностики и прогнозирования заболеваний микробной этиологии, а также выбора рациональной антибактериальной терапии для борьбы с бактерионосительством.

Задачей заявляемого технического решения является создание способа определения антилактоферриновой активности (АЛфА) микроорганизмов.

Для решения указанной задачи в заявляемом способе исследуемую культуру микроорганизмов выращивают в жидкой питательной среде, выросшие культуры обрабатывают хлороформом, отделяют супернатант и смешивают его с лактоферрином, параллельно с опытной готовят две контрольные пробы, при этом в контроль 1 вместо супернатанта исследуемых культур микроорганизмов добавляют жидкую питательную среду, а контроль 2 готовят из забуференного физиологического раствора и жидкой питательной среды, опытную и контрольные пробы инкубируют, после инкубации добавляют тест-культуру M.luteus ГИСК N 211001 и проводят первое измерение оптической плотности в опыте и контролях непосредственно по достижении режима термостатирования (37^oC) и второе измерение через 18-24 часа инкубации, затем рассчитывают антилактоферриновую активность по формуле

где ΔOD - изменение оптической плотности в опыте между 1 и 2 измерениями;
ΔOD₁- изменение оптической плотности в контроле 1 между 1 и 2 измерениями;
ΔOD₂ - изменение оптической плотности в контроле 2 между 1 и 2 измерениями.

Аналогов изобретения в патентной и научно-технической литературе не обнаружено.

Авторами экспериментально установлено, что микроорганизмы независимо от их видового происхождения способны инактивировать бактерицидное действие лактоферрина. В результате проведенных исследований было сделано предположение о наличии у бактерий определенных механизмов защиты от влияния лактоферрина. Данное предположение было подтверждено проведенными экспериментами. Культуры E. coli, S.aureus, S.epidermidis выращивали на мясопептонном агаре при температуре 37^oC в течение 24 часов, готовили их взвесь в концентрации 1 млрд/мл. Далее в равных объемах смешивали взвесь и раствор, содержащий 2 мг/мл (суббактериостатическая концентрация) лактоферрина, смесь инкубировали в течение 30 минут, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут, получали бесклеточный супернатант, в котором с помощью микробиологического анализатора iEMS-MF (Labsystems, Финляндия) определяли остаток лактоферрина. Оказалось, что культура E.coli инактивировала (75.6 ± 5.3)% препарата, S. aureus - (68.8 ± 7.5)%, S.epidermidis - (54.6 ± 3.7)% лактоферрина.

При разработке настоящего способа авторами были проведены исследования по выбору индикаторной культуры, позволяющей тестировать наличие или отсутствие в среде лактоферрина, поскольку для осуществления способа необходим высокочувствительный к лактоферрину штамм микроорганизма.

Авторами с помощью анализа кривых роста различных видов микроорганизмов в среде с лактоферрином экспериментально отобрана тест-культура. Для этого взвесь суточных агаровых культур исследуемых микроорганизмов (10⁶ КОЕ/мл; 50 мкл) и раствор лактоферрина в 0,01 М фосфатном буфере (2 мг/мл, 50 мкл) инокулировали в питательный бульон (300 мкл). Контролем служили пробы без лактоферрина (50 мкл 0,01М фосфатного буфера). Параметры роста (OD) определяли с помощью автоматизированной фотометрии на микробиологическом анализаторе iEMS-MF (Labsystems, Финляндия). По окончании инкубации в термостатируемом блоке ридера (через 18 часов) оценивали изменение оптической плотности в опытной пробе по сравнению с контролем (таблица).

Таким образом, в результате проведенных исследований авторами в качестве тест-культуры был выбран штамм M.luteus, проявляющий наибольшую чувствительность к бактерицидному действию лактоферрина. Штамм депонирован в ГИСК им. Л.А.Тарасевича под регистрационным номером 211001 [12].

Предлагаемый штамм M.luteus растет на простых питательных средах, клетки сферические, 0,5-3,5 мкм в диаметре, неподвижный, грамположительный, аэроб, образует каталазу, не сбраживает глюкозу.

Для осуществления способа используется лактоферрин из коровьего молока, кристаллический, производства фирмы "Fluka" (Швейцария), степень чистоты препарата (по данным гель-электрофореза) более 75%, растворимость 10 мг/мл H₂O, номер по каталогу 61323 [13].

Способ осуществляется следующим образом.

1) Исследуемые культуры микроорганизмов выращиваются в 3 мл жидкой питательной среды (для каждого вида микроорганизмов используется соответствующий тип питательной среды) при 37^oC в течение 24-36 часов.

2) Во все пробы добавляют 0,1 мл хлороформа, перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 40-60 минут, периодически встряхивая.

3) Супернатант отделяют от бактериальных клеток центрифугированием в течение 20 минут при 3000 об/мин.

4) На забуференном физиологическом растворе (Sigma, P4417. Состав: 0.01М фосфатный буфер, 0.0027М KCl, 0.137М NaCl, pH 7,4 при 25^oC) готовят раствор лактоферрина с концентрацией 2,5 мг/мл.

5) Супернатант исследуемых культур микроорганизмов объемом 0,8 мл смешивают с 0,1 мл приготовленного раствора лактоферрина.

6) Параллельно с опытными готовят 2 контрольные пробы:
Контроль 1. К 0,1 мл лактоферрина добавляют 0,8 мл жидкой питательной среды. Контроль 2. К 0,1 мл забуференного физиологического раствора добавляют 0,8 мл жидкой питательной среды.

7) Инкубируют пробы в течение 2 часов при 37^oC.

8) После инкубации в опытные и контрольные пробы добавляют по 0,1 мл взвеси тест-культуры M.luteus ГИСК N 211001. Для этого 16-18-часовую агаровую культуру M.luteus смывают забуференным физиологическим раствором и готовят взвесь с оптической плотностью 0,160 при длине волны 450 нм. Полученную взвесь разводят в 10000 раз.

9) Далее по 100 мкл опытной и контрольной проб инокулируют в лунки полистиролового планшета с 200 мкл питательного бульона. Планшет помещают в термостатируемый блок микробиологического анализатора iEMS-MF (Labsystems, Финляндия) и проводят первое измерение оптической плотности в опыте и контролях непосредственно по достижении режима термостатирования (37^oC) и второе измерение через 18-24 часа инкубации (по достижении максимальной оптической плотности индикаторной культуры в соответствии с общепринятыми микробиологическими стандартами [14]), затем рассчитывают антилактоферриновую активность по формуле

где ΔOD - изменение оптической плотности в опыте между 1 и 2 измерениями;
ΔOD₁ - изменение оптической плотности в контроле 1 между 1 и 2 измерениями;
ΔOD₂ - изменение оптической плотности в контроле 2 между 1 и 2 измерениями.

Антилактоферриновая активность выражается в процентах (%) инактивации лактоферрина в опыте по сравнению с контролем.

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. У больной К. с диагнозом "острый мастит" был выделен в монокультуре Staphylococcus aureus. Однако отсутствие гемолитической активности, а также антилизоцимной, "антиинтерфероновой" и антикомплементарной активности поставило под сомнение этиологическую роль данного микроорганизма в развитии воспалительного процесса. Для решения вопроса об этиологической значимости выделенного микроорганизма у золотистого стафилококка была определена способность к инактивации лактоферрина. Наличие подобного свойства даже в отсутствие иных факторов персистенции определяет возможность этиологического агента длительно находиться в организме и инициировать воспалительный процесс.

Для достижения поставленной цели исследуемую культуру выращивали в мясопептонном бульоне при 37^oC в течение 24 часов. В пробирки с выросшей культурой добавляли по 0,1 мл хлороформа, перемешивали и выдерживали в течение 40 минут. Супернатант отделяли от бактериальных клеток центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 минут. На забуференном физиологическом растворе готовили раствор лактоферрина с концентрацией 2,5 мг/мл. Супернатант исследуемой культуры объемом 0,8 мл смешивали с 0,1 мл приготовленного раствора лактоферрина. Параллельно готовили 2 контрольные пробы: а) контроль 1. К 0,1 мл лактоферрина в указанной выше концентрации добавляли 0,8 мл жидкой питательной среды. б) контроль 2. К 0,1 мл забуференного физиологического раствора добавляли 0,8 мл жидкой питательной среды. Все пробы инкубировали в течение 2 часов при 37^oC. После инкубации в опытные и контрольные пробы добавляли по 0,1 мл взвеси тест-культуры M.luteus ГИСК N 211001. Для этого 16-18-часовую агаровую культуру M.luteus смывали забуференным физиологическим раствором и готовили взвесь с оптической плотностью 0,160 при длине волны 450 нм, полученную взвесь разводили в 10000 раз. Далее 100 мкл смеси инокулировали в лунки полистиролового планшета с 200 мкл питательного бульона. Планшет помещали в термостатируемый блок микробиологического анализатора iEMS-MF (Labsystems, Финляндия) и проводили первое измерение оптической плотности в опыте и контролях непосредственно по достижении режима термостатирования (37^oC) и второе измерение через 18 часов инкубации, затем рассчитывали антилактоферриновую активность по формуле:

где 0,038 - изменение оптической плотности в опыте между 1 и 2 измерениями;
0,02 - изменение оптической плотности в контроле 1 между 1 и 2 измерениями;
0,075 - изменение оптической плотности в контроле 2 между 1 и 2 измерениями.

Выявлено, что Staphylococcus aureus инактивировал 32,7% лактоферрина, т. е. его антилактоферриновая активность равна 32,7%.

У штамма Staphylococcus aureus методом индикаторных дисков установлена чувствительность к гентамицину, бензилпенициллину, эритромицину, мономицину, рифампицину. Курс антибиотикотерапи с использованием мономицина по 1 млн.ЕД 2 раза в день не привел к элиминации возбудителя и не сопровождался положительной динамикой клинических симптомов. В связи с этим было изучено влияние субингибиторных концентраций названных антибиотиков на антилактоферриновую активность S. aureus. Установлено, что мономицин и бензилпенициллин не оказывают на нее выраженного действия (что, очевидно, объясняет неэффективность использования мономицина в данном случае); эритромицин и рифампицин снижают антилактоферриновую активность незначительно, а гентамицин оказывает выраженное ингибирующее влияние: штамм стафилококка, выращенный в контакте с суббактериостатической концентрацией гентамицина, утрачивал способность к инактивации лактоферрина. Проведение курса антибиотикотерапии с использованием гентамицина как препарата, снижающего антилактоферриновую активность возбудителя, привело к клиническому выздоровлению.

Таким образом, выявление у S.aureus способности инактивировать лактоферрин позволило установить его этиологическую значимость, а изучение спектра чувствительности к антибиотикам и проведение целенаправленной антибиотикотерапии привело к элиминации возбудителя.

Пример 2. При обследовании 52 сотрудников родильного отделения медико-санитарной части АО "Оренбурггазпром" на стафилококковое бактерионосительство было выделено 52 штамма стафилококков. Поскольку основную опасность представляют бактерионосители резидентного типа, возникла необходимость в их дифференциации. Для этого у всех штаммов была определена способность к инактивации лактоферрина. Определение антилактоферриновой активности микроорганизмов осуществлено согласно примеру 1. В результате у 12 штаммов была выявлена антилактоферриновая активность в пределах от 1,8 до 25,4%, тогда как другие штаммы не имели этого признака. Двукратное повторное обследование данных пациентов с интервалом 10 дней и последующее фаготипирование подтвердило идентичность выделенных штаммов и позволило отнести их к резидентным, тогда как у остальных пациентов произошло замещение одного вида стафилококка на другой.

Санация резидентных бактерионосителей масляным раствором витамина А, снижающим антилактоферриновую активность стафилококков, оказалась положительной в 95% случаев, что явилось подтверждением значимости данного признака в развитии и поддержании стафилококкового бактерионосительства.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет выявить новое свойство микроорганизмов - антилактоферриновую активность, а как следствие, повысить точность диагностики и прогнозирования заболеваний микробной этиологии. Также заявляемый способ способствует выбору рациональной антибактериальной терапии, изучению механизмов персистенции микроорганизмов и формирования бактерионосительства.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Бактерионосительство (медико-экологический аспект).- Екатеринбург; УрО РАН, 1996, - 208 с.

2. Бухарин О.В. Биомедицинские аспекты персистенции бактерий. // Журн. микробиол., 1994. - Приложение. - С. 4-13.

3. RU 2120999 C1, МПК 6 С 12 Q 1/02, 1/04, 27.10.98.

4. RU 2126051 С1, МПК 6 С 12 Q 1/02, 10.02.99.

5. Соколов В.Ю. Антиинтерфероновая активность микроорганизмов. // Персистенция бактерий. / Под ред. О.В. Бухарина. - Куйбышев. 1990. - С. 83-93.

6. Михайлова Е.А., Луда А.П., Бигеев М.И. Антииммуноглобулиновая активность бактерий. // Под ред. О.В.Бухарина. - Куйбышев, 1990, - 107 - 111 c.

7. RU 2010860 С1, МПК 6 С 12 Q 1/02, 1/04, 15.04.94.

8. Arnold R.R., Russell J.E., Champion W.I. et al. // Immunity. - 1982. - Vol. 35. - P. 792-799.

9. Дворецкий Л. И. , Дидковский Н.А., Чарлыев Г. Изучение содержания лактоферрина в бронхиальном содержимом у больных хроническим бронхитом. // Здравоохранение Туркменистана. - 1985. - N 10. - С. 15-18.

10. Broxmeyer H.E., De Sousa M., Smithyman A. // Blood. - 1980. - Vol. 55. - P. 324.

11. Bagby G., Bennett R. // Blood. - 1982. - Vol. 60. - P. 108-112.

12. Каталог штаммов Всесоюзного музея патогенных бактерий. Вып. 1. - М., 1982.

13. Каталог фирмы "Sigma" (chemical company): Biochemicals organic compounds and diagnostic reagents. - 1996. - С. 222.

14. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. /М.О.Биргер.-М., 1992. - С.114.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в лабораториях научно-исследовательских институтов и бактериологических лабораториях клинических учреждений, занимающихся вопросами определения персистентных характеристик микроорганизмов (в эксперименте), а также установления их этиологической значимости при патологических процессах (в клинике). Способ осуществляют выращиванием исследуемой культуры в жидкой питательной среде и получением супернатанта выросших культур с добавлением раствора лактоферрина. Параллельно готовят две контрольные пробы, инкубируют и добавляют в опытную и контрольные пробы тест-культуру M.luteus ГИСК N 211001. Затем замеряют их оптическую плотность и по изменению оптических плотностей в опыте и контролях рассчитывают антилактоферриновую активность исследуемой культуры. Способ позволяет выявить новое свойство микроорганизмов - антилактоферриновую активность, а как следствие, повысить точность диагностики и прогнозирования заболеваний микробной этиологии. Предлагаемый способ способствует выбору рациональной антибактериальной терапии, изучению механизмов персистенции микроорганизмов и формирования бактерионосительства. 1 табл.

Способ определения антилактоферриновой активности микроорганизмов, заключающийся в том, что исследуемую культуру микроорганизмов выращивают в жидкой питательной среде, выросшие культуры обрабатывают хлороформом, отделяют супернатант и смешивают его с лактоферрином, параллельно с опытной готовят две контрольные пробы, при этом в контроль 1 вместо супернатанта исследуемых культур микроорганизмов добавляют жидкую питательную среду, а контроль 2 готовят из забуференного физиологического раствора и жидкой питательной среды, опытную и контрольные пробы инкубируют, после инкубации добавляют тест-культуру M. luteus ГИСК N211001 и проводят первое измерение оптической плотности в опыте и контролях непосредственно по достижении режима термостатирования (37^oС) и второе измерение через 18 - 24 ч инкубации, затем рассчитывают антилактоферриновую активность по формуле

где ΔOD - изменение оптической плотности в опыте между 1 и 2 измерениями;
ΔOD₁ - изменение оптической плотности в контроле 1 между 1 и 2 измерениями;
ΔOD₂ - изменение оптической плотности в контроле 2 между 1 и 2 измерениями.