СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТРОМБОЦИТАРНОЙ КАТИОННО-БЕЛКОВОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 1998 года по МПК C12Q1/02 C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в исследовательской работе НИИ и практической работе бактериологических лабораторий клинических учреждений, определяющих персистентные характеристики микроорганизмов для установления их этиологической значимости при патологических процессах.

В настоящее время характер течения большинства инфекций изменился в сторону увеличения доли затяжных и хронических форм [1].

Длительное переживание бактерий в организме хозяина (бактерионосительство), а также переход инфекционного процесса в хроническую форму обеспечивают факторы персистенции микроорганизмов, инактивирующие ряд факторов естественной противоинфекционной резистентности: лизоцим, комплемент, интерферон и др. [2].

Известны способы определения антилизоцимной [3], антиинтерфероновой [4], антииммуноглобулиновой [5], антикомплементарной [6] активностей микроорганизмов.

Одним из факторов естественной противоинфекционной резистентности макроорганизма является тромбоцитарный катионный белок (ТБК), играющий ключевую роль в уничтожении грампозитивных микроорганизмов [7].

Актуальность разработки способа определения антитромбоцитарной катионно-белковой активности микроорганизмов определяется возможностью повышения точности диагностики и прогнозирования заболеваний микробной этиологии, а также выбора рациональной антибактериальной терапии для борьбы с бактерионосительством.

Задачей заявляемого технического решения является создание способа определения антитромбоцитарной катионно-белковой активности (антиТКБ активность) микроорганизмов.

Для решения указанной задачи в заявляемом способе исследуемую культуру микроорганизмов выращивают в жидкой питательной среде, обрабатывают хлороформом, отделяют супернатант и инкубируют последний с тромбоцитарным катионным белком, параллельно готовят две контрольные пробы, в опытную и контрольные пробы добавляют тест-культуру B.subtilis ГИСК N010011, инкубируют, засевают на мясо-пептонный агар, посевы вновь инкубируют и определяют антитромбоцитарную катионно-белковую активность микроорганизмов по количеству выросших колоний тест-культуры в опыте и контроле.

Аналогов изобретения в патентной и научно-технической литературе не обнаружено.

Авторами экспериментально установлено, что микроорганизмы, независимо от их видового происхождения, способны инактивировать бактерицидное действие ТКБ. При изучении резистентности микроорганизмов к бактерицидному действию экстракта тромбоцитов крови авторами была обнаружена устойчивость некоторых грамположительных микроорганизмов к термоинактивированному экстракту тромбоцитов крови, бактерицидный эффект которого осуществляется за счет ТКБ. В результате этих исследований было сделано предположение о наличии у бактерий определенных механизмов защиты от влияния ТКБ. Данное предположение было подтверждено проведенными исследованиями. Культуры S.aureus 209p, M.luteus 2665, E. coli О-111 выращивали на плотной питательной среде при Т 37^oC в течение 24 ч, готовили их взвеси в концентрации 1 млрд/мл. Затем в равных объемах смешивали взвесь и раствор, содержащий 32 мкг (суббактериостатическая концентрация) ТКБ, смесь инкубировали в течение 10 мин, центрифугировали при 9000 об/мин в течение 20 мин, получали бесклеточный супернатант, в котором с помощью фотоэлектроколориметра определяли остаток ТКБ. Оказалось, что культура S.aureus 209p инактивировала 82,4±7,6% препарата, M.luteus 2665 - 69,5±11,2%, E.coli О-111 -56,7±14,4% ТКБ.

Обоснованием для создания настоящего способа послужили исследования по выбору индикаторной культуры, позволяющей тестировать наличие или отсутствие в среде тромбоцитарного катионного белка, поскольку для осуществления способа необходим высокочувствительный к ТКБ штамм микроорганизма.

Авторами с помощью определения минимальной бактерицидной концентрации (МБК) тромбоцитарного катионного белка для различных групп микроорганизмов экспериментально отобрана тест-культура. Для этого в жидких питательных средах создавались определенные концентрации ТКБ (от 17 до 1300 нг/мл). Затем к 0,9 мл раствора ТКБ добавляли по 0,1 мл взвеси исследуемых микроорганизмов. Смеси инкубировали в течение часа при Т 37^oC и высевали на питательный агар. Процент выживших бактерий (сформировавшихся колоний) подсчитывали после 18-24-часовой инкубации при Т 37^oC. Минимальную бактерицидную концентрацию определяли по 50% подавлению роста бактерий относительно контроля без ТКБ. Изучено 240 клинических и музейных штаммов грамотрицательных и грамположительных бактерий (табл. 1). Обнаружено, что к действию ТКБ наиболее чувствительны 3 культуры: B.subtilis 6633 (МБК 1/15000), B.cereus (МБК 1/12000) и B.pseudoanthrax (МБК 1/10000).

По результатам исследований в качестве тест-культуры был выбран штамм B. subtilis 6633, проявляющий наибольшую чувствительность к бактерицидному действию тромбоцитарного катионного белка (подавлялся ТКБ в максимальном разведении, равном 1/15000). Штамм депонирован в ГИСК им. Л.А. Тарасевича под регистрационным номером 010011 [8].

Предлагаемый штамм B.subtilis 6633 растет на простых питательных средах в виде белых шероховатых колоний диаметром 1-3 мм, грамположительный, образует термоустойчивые споры, строгий аэроб, образует кислоту из арабинозы, ксилозы и маннита, не продуцирует гемолизины. В то же время отобранный штамм резистентен к лизоциму, интерферону, комплементу, используемым в качестве бактерицидных веществ при тестировании антилизоцимной, "антиинтерфероновой", антикомплементарной активностей.

Таким образом, выбор в качестве тест-культуры B.subtilis 6633 обусловлен высоким уровнем его чувствительности к бактерицидному действию тромбоцитарного катионного белка.

Для осуществления способа используется тромбоцитарный катионный белок, характеризующийся свойствами, указанными в табл. 2 и получаемый известным способом [9, 10].

Способ осуществляется следующим образом.

1) Исследуемые культуры микроорганизмов выращиваются в 2-3 мл питательного мясо-пептонного бульона при 37^oC в течение 24 ч.

2) Выросшие культуры обрабатывают хлороформом в течение часа (0,1 мл на каждую пробу).

3) Бульонные культуры центрифугируют (3000 об/мин в течение 15 мин), супернатант отделяется от бактериальных клеток.

4) В опытные пробирки разливают по 0,6 мл супернатанта и добавляют 0,3 мл тромбоцитарного катионного белка в разведении 1/3 титра активности (за титр активности принимается то разведение ТКБ, при котором наблюдается 50% подавление тест-штамма B.subtilis). Параллельно готовят два контроля: а) контроль 1. К 0,3 мл ТКБ в указанном выше разведении добавляют 0,6 мл мясо-пептонного бульона, обработанного хлороформом; б) контроль 2. К 0,3 мл физиологического раствора добавляют 0,6 мл мясо-пептонного бульона, обработанного хлороформом.

5) Полученные смеси инкубируют в течение 1 ч при Т 37^oC.

6) Во все пробирки добавляют по 0,1 мл взвеси B.subtilis (способ приготовления взвеси: 16-18-часовую агаровую культуру B.subtilis смывают физиологическим раствором и готовят микробную взвесь, густота которой соответствует оптической плотности 0,27 при 650 нм на СФ-46. Полученную взвесь разводят физиологическим раствором в 1000 раз и используют).

7) Полученные смеси инкубируют в течение часа при 37^oC.

8) Из каждой пробирки 0,2 мл засевают на чашки Петри с 5 мл мясо-пептонного агара.

9) Посевы инкубируют 24 ч при 37^oC.

10) Подсчитывают количество выросших колоний B.subtilis на опытных и контрольных чашках и рассчитывают антитромбоцитарную катионно-белковую активность (антиТКБ активность) микроорганизмов по формуле:

где
N₀ - количество колоний в опыте,
- количество колоний в контроле 1,
- количество колоний в контроле 2.

АнтиТКБ активность выражается в % инактивации ТКБ в опыте по сравнению с контролем.

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. У больного хронической формой гайморита Е. из гнойного отделяемого был выделен в монокультуре S.epidermidis. Однако, отсутствие гемолитической активности, а также антилизоцимной и "антиинтерфероновой" активностей поставило под сомнение этиологическую роль выделенного микроорганизма в развитии воспалительного процесса. Для решения вопроса об этиологической роли выделенного микроорганизма у культуры эпидермального стафилококка была определена способность к инактивации ТКБ - важнейшего звена противоинфекционной защиты. Наличие подобного свойства, даже в отсутствие иных факторов вирулентности, определяет возможность этиологического агента инициировать и поддерживать воспалительный процесс.

Для достижения поставленной цели исследуемую культуру выращивали в 2-3 мл питательного мясо-пептонного бульона при 37^oC в течение 24 ч. Выросшую культуру обрабатывали хлороформом в течение часа (0,1 мл на пробу). Бульонную культуру центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин, супернатант отделяли от бактериальных клеток. В опытную пробирку разливали 0,6 мл супернатанта и добавляли 0,3 мл ТКБ в разведении 1/3 титра активности (за титр активности принимается то разведение тромбоцитарного катионного белка, при котором наблюдается 50% подавление тест-штамма B.subtilis). Параллельно готовили два контроля: а) контроль 1. К 0,3 мл ТКБ в указанном выше разведении добавляли 0,6 мл мясо-пептонного бульона, обработанного хлороформом; б) контроль 2. К 0,3 мл физиологического раствора добавляют 0,6 мл мясо-пептонного бульона, обработанного хлороформом. Полученные смеси инкубировали в течение 1 ч при Т 37^oC. Во все пробирки добавляли по 0,1 мл взвеси B.subtilis (способ приготовления взвеси: 16-18-часовую агаровую культуру B.subtilis смывали физиологическим раствором и готовили микробную взвесь, густота которой соответствовала оптической плотности 0,27 при 650 нм на СФ-46. Полученную взвесь разводили физиологическим раствором в 1000 раз и использовали). Полученные смеси инкубировали в течение часа при 37^oC. Из каждой пробирки 0,2 мл засевали на чашки Петри с 5 мл мясо-пептонного агара. Посевы инкубировали 24 ч при 37^oC. Подсчитывали количество выросших колоний B.subtilis на опытных и контрольных чашках, затем рассчитывали антиТКБ активность S.epidermidis по формуле:

где
150 - количество колоний в опыте,
100 - количество колоний в контроле 1,
300 - количество колоний в контроле 2.

Данный штамм инактивировал 25% ТКБ. Таким образом, выявление у S.epidermidis способности инактивировать ТКБ позволило установить его этиологическую значимость, что было подтверждено повторными высевами в ходе воспалительного процесса идентичного стафилококка с антиТКБ активностью и отсутствием вирулентных свойств - гемолитической, антилизоцимной и "антиинтерфероновой" активностей.

Изучение спектра чувствительности к антибиотикам и проведение целенаправленной антибиотикотерапии привело к элиминации возбудителя и ликвидации воспалительного процесса, что также подтверждает этиологическую значимость выделенного штамма S.epidermidis.

Пример 2. У больного К. с диагнозом "хронический негонококковый уретрит" были выделены в чистой культуре и по совокупности признаков идентифицированы как Enterococcus faecalis и Staphylococcus hominis. Для подтверждения этиологической значимости у выделенных штаммов были изучены антилизоцимная, "антиинтерфероновая", антикомплементарная активности. У штаммов Е. faecalis и S. hominis данные факторы персистенции не были выявлены. В связи с этим, была сделана попытка оценить этиологическую значимость возбудителя по способности к инактивации ТКБ. Определение антитромбоцитарной катионно-белковой активности микроорганизмов осуществлено согласно примеру 1. Выявлено, что S. hominis инактивировал 0% ТКБ, а Е. faecalis инактивировал 50% ТКБ. У Е. faecalis методом диффузии в агар установлена чувствительность к гентамицину, бензилпенициллину, ампициллину, рифампицину, цефалексину. Курс антибиотикотерапии с использованием ампициллина по 1 млн.ЕД 2 раза в день в течение 7 дн не привел к элиминации возбудителя и не сопровождался положительной динамикой клинических симптомов. В связи с этим было изучено влияние субингибиторных концентраций названных антибиотиков на антитромбоцитарную катионно-белковую активность Е. faecalis. Установлено, что ампициллин и бензилпенициллин не оказывают на нее выраженного действия (что, очевидно, объясняет неэффективность использования ампициллина в данном случае), гентамицин и рифампицин снижают антиТКБ активность незначительно, а цефалексин оказывает выраженное ингибирующее влияние: штамм энтерококка, выращенный в контакте с суббактериостатической концентрацией цефалексина, утрачивал способность к инактивации ТКБ. Проведение курса антибиотикотерапии с использованием цефалексина как препарата, снижающего антитромбоцитарную катионно-белковую активность возбудителя, привело к клиническому выздоровлению.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет выявить и изучить новое свойство микроорганизмов (антитромбоцитарную катионно-белковую активность), а также повысить точность диагностики и прогнозирования заболеваний микробной этиологии, выбора рациональной антибактериальной терапии, изучения механизмов персистенции микроорганизмов и формирования бактерионосительства.

Источники информации
1. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Бактерионосительство (медико-экологический аспект).-Изд. УрО РАН.-Екатеринбург,1996, 208 с.

2. Бухарин О.В. Биомедицинские аспекты персистенции бактерий. // Микробиология, эпидемиология и иммунобиология, 1994, Приложение, с. 4-13.

3. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Малышкин А.П., Немцева Н.В. Методы определения антилизоцимной активности микроорганизмов.-ЖМЭИ, 1984, N 2, с. 27-29.

4. Авторское свидетельство N 1564191, кл. C 12 Q 1/02, 1990.

5. Михайлова Е.А., Луда А.П., Бигеев М.И. Антииммуноглобулиновая активность бактерий /Под ред. О.В.Бухарина.-Куйбышев, 1990, с. 107-111.

6. Патент N 2010860, кл. 5 C 12 Q 1/02, 1/04, 1994.

7. Бухарин О.В., Сулейманов К.Г. Роль тромбоцитарного катионного белка (ТБК) - бета-лизина в противоинфекционной защите. //Микробиология, эпидемиология и иммунобиология, 1997, N 1, с. 3-7.

8. Каталог штаммов Всесоюзного музея патогенных бактерий, вып. 1.-М., 1982.

9. Бухарин О.В., Сухих Г.Т. и др. "Бета-лизин из сыворотки крови человека //Тез. докл. IV Всесоюзн. биохим. съезда.-Лениград, 1979, т. 3, с. 143.

10. Сулейманов К. Г. Разработка метода очистки бета-лизина из тканей и некоторые его физико-химические свойства //Деп. ВИНИТИ, 1987, N 011860081, с. 11т

Изобретение относится к микробиологии. Способ осуществляется путем выращивания исследуемой культуры микроорганизмов в жидкой питательной среде, обработки хлорформом, отделения супернатанта, инкубирования его с тромбоцитарным катионным белком, приготовления параллельно двух контрольных проб и добавления в опытную и контрольные пробы тест-культуры Bacillus subtilis ГИСК N 010011. Полученные смеси инкубируют, засевают на мясопептонный агар, посевы вновь инкубируют и затем по количеству выросших колоний тест-культуры в опыте и контроле рассчитывают антитромбоцитарную катионно-белковую активность исследуемой культуры по формуле: где N_о - количество колоний в опыте, количество колоний в контроле 1, количество колоний в контроле 2. Данный способ позволяет выявить и изучить новое свойство бактериальных патогенов (антитромбоцитарную катионно-белковую активность) для повышения точности диагностики, прогнозирования заболеваний микробной этиологии и подбора оптимальной терапии. 2 табл.

Способ определения антитромбоцитарной катионно-белковой активности микроорганизмов, заключающийся в том, что исследуемую культуру микроорганизмов выращивают на мясо-пептонном бульоне, выросшие культуры обрабатывают хлороформом, отделяют супернатант от бактериальных клеток центрифугированием, к суспернатанту добавляют тромбоцитарный катионный белок, параллельно готовят две контрольные пробы, в контроль 1 также добавляют тромбоцитарный катионный белок и мясо-пептонный бульон, обработанный хлороформом, в контроль 2 вместо тромбоцитарного катионного белка добавляют физиологический раствор, инкубируют опытную и обе контрольные пробы, после инкубации во все пробы добавляют тест-культуру Bacillus subtilis ГИСК N 010011, инкубируют, засевают на мясо-пептонный агар, посевы вновь инкубируют, затем проводят подсчет количества выросших колоний в опыте и контролях и рассчитывают антитромбоцитарную катионно-белковую активность по формуле

где N₀ - количество колоний в опыте;
количество колоний в контроле 1;
количество колоний в контроле 2.