СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОНКОЛОГИЧЕСКОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/49 G01N21/35 

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике онкозаболеваний, и позволяет по 0,05 мл крови, взятой из вены пациента, установить наличие онкологического заболевания, путем выявления изменений в спектре многократного нарушенного полного внутреннего отражения (МНПВО) в инфракрасной области в сравнении с МНПВО ИК-спектром крови здорового человека (донора).

Известны способы диагностики онкологических заболеваний с использованием различных физико-химических методов анализа, в том числе методов молекулярного анализа, например, спектроскопических [1 - 3].

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ применения одного из методов молекулярного анализа - резонансной спектроскопии рамановского комбинационного рассеяния света для обнаружения злокачественной болезни. В этом случает отбирают пробу плазмы крови пациента в пробирку порядка 2 - 3 мл и измеряют интенсивность рамановского рассеяния от плазмы в частотном интервале от 1000 - 1600 см^-1. Существенные отличия этой интенсивности рамановского рассеяния на сравнимых частотах от плазмы крови здорового человека указывают на развитие злокачественной болезни пациента [4].

Указанный способ имеет ряд существенных недостатков. К ним можно отнести:
- высокую аппаратурную сложность метода;
- использование низких частот, в области которых лежат деформационные колебания атомов в группах и связях. Последние характеризуются трудностью точного отнесения и низкой интенсивностью полос поглощения по сравнению с валентными колебаниями;
- относительно низкую чувствительность, связанную с использованием однолучевой схемы, когда измерение интенсивностей рассеянных линий спектра производится последовательно для крови пациента с онкологическим заболеванием и крови здорового человека, что может вносить существенную ошибку;
-весьма низкая разрешающая способность спектров комбинационного (рамановского) рассеяния, не позволяющая производить анализ на определенной полосе поглощения и вынуждающая брать интервал частот, как, например, 1100 - 1600 см^-1 в рассматриваемом способе; особенно затруднено выявление полос поглощения, связанных с онкологическим заболеванием, находящихся на склонах более интенсивных полос поглощения от молекул протеинов;
- недостаточное разрешение не позволяет проводить анализ сложных молекул или молекул, имеющих большие моменты инерции, а следовательно, значения вращательных постоянных;
- высокое паразитное релеевское рассеяние, не позволяющее произвести точную оценку интенсивности полос поглощения, а также флуоресценция образцов;
-относительно большое используемое количество плазмы 2 - 3 мл, не позволяющее данный способ отнести к микроанализу и не позволяющее, в частности, использовать его для диагностики онкозаболеваний новорожденных;
- использование в качестве источников света мощных лазеров, излучение которых может приводить к разрушению исследуемых образцов и тем самым вносить искажения в результаты анализа.

От указанных недостатков свободен метод анализа, базирующийся на использовании другого метода молекулярного анализа, а именно инфракрасной спектроскопии. Так же, как и в рассмотренном выше методе, инфракрасный спектр крови или плазмы здорового человека сравнивается с инфракрасным спектром пациента с онкологическим заболеванием. При этом отличия в спектре вызваны изменениями в молекулярной структуре крови, появлением новых групп или химических связей вследствие онкологического заболевания.

Естественно, что метод ИК-спектроскопии, имеющий гораздо более простое аппаратурное оформление, более высокую разрушающую способность и чувствительность [5] , предпочтителен. К тому же метод ИК-спектроскопии позволяет использовать для анализа область частот спектра, в котором лежат валентные колебания атомов, групп и связей, которые имеют интенсивность и легко позволяют проводить отнесение колебаний к определенным связям.

Однако прямое использование ИК-спектроскопии на просвет (трансмиссионный метод) не приводит к нужному результату, т.к. недостаточно чувствительности. Именно по этой причине широкоизвестный метод ИК-спектроскопии, применяемый в биохимии для анализа состава и строения белков и др. [6] (известные полосы амида I, амида II и т.д.), не получил распространения при диагностике различных, в т.ч. онкологических заболеваний.

Целью изобретения является увеличение чувствительности и разрешающей способности молекулярного анализа крови или плазмы крови, позволяющее на ранней стадии проводить диагностику онкологических заболеваний.

Согласно изобретению цель достигнута использованием метода многократного нарушенного полного внутреннего отражения в инфракрасной области спектра.

В этом случае на поверхность призмы МНПВО (из сульфида кадмия, кремния, германия и др.) наносится тонкий слой крови и производится регистрация ИК-спектра МНПВО с помощью приставки к стандартному спектрофотометру (см. фиг. 1) и анализируется в диапазоне частот 1500 - 3000 см^-1.

Наличие тонкой пленки на поверхности призмы резко снижает фон от молекул воды и тем самым существенно увеличивает возможность разрешения отдельных полос поглощения. В то же время достаточно большое количество отражений в призме, а также резонансный характер МНПВО существенно увеличивает чувствительность метода.

Следует также отметить, что призмы МНПВО из сульфида кадмия, кремния, германия и др. прозрачны в ИК-области в диапазоне частот 1500 - 3000 см^-1, где лежат полосы поглощения валентных колебаний групп и связей, что позволяет проводить идентификацию полос. Последнее разрешают не только диагностировать злокачественные заболевания, но и следить за эффективностью лечения, а также фиксировать ремиссионные процессы.

Пример 1. У здорового человека (донора) из вены шприцем берут 0,05 мл крови и наносят на поверхность призмы МНПВО. Призму помещают в приставку МНПВЛОО, которая расположена в кюветном отделении ИК-спектрофотометра, и затем регистрируют спектр МНПВО. В полученном спектре (фиг. 2) обнаружены интенсивные, с высоким разрешением, полосы поглощения, принадлежащие крови.

Пример 2. У пациента 48 лет из вены шприцем берут 0,05 мл крови и наносят на поверхность призмы МНПВО. Призму помещают в приставку МНПВО, которая расположена в кюветном отделении ИК-спектрофотометра, затем регистрируют спектр МНПВО. В полученном спектре (фиг. 3) обнаружена полоса поглощения на частоте 1625 см^-1, отсутствующая у здорового человека (донора) (см. фиг. 2) и указывающая на наличие у пациента онкологического заболевания - рака крови.

Пример 3. У пациента 39 лет из вены шприцем берут 0,05 мл крови и наносят на поверхность призмы МНПВО. Призму помещают в приставку МНПВО, которая расположена в кюветном отделении ИК-спектрофотометра, и затем регистрируют спектр МНПВО. В полученном спектре (фиг. 4) обнаружена полоса поглощения на частоте 1735 см^-1, отсутствующая у здорового человека (донора) (см. фиг. 2) и указывающая на наличие у пациента онкологического заболевания - рака молочной железы.

Пример 4. У пациента 55 лет из вены шприцем берут 0,05 мл крови и наносят на поверхность призмы МНПВО. Призму помещают в приставу МНПВО, которая расположена в клюветном отделении ИК-спектрофотометра, и затем регистрируют спектр МНПВО. В полученном спектре (фиг. 5) обнаружена полоса поглощения на частоте 2864 см^-1, отсутствующая у здорового человека (донора) (см. фиг. 2) и указывающая на наличие у пациента онкологического заболевания - рака печени.

Пример 5. У пациента 47 лет из вены шприцем берут 0,05 мл крови и наносят на поверхность призмы МНПВО. Призму помещают в приставку МНПВО, которая расположена в кюветном отделении ИК-спектрофотометра, и затем регистрируют спектр МНПВО. В полученном спектре (фиг. 6) обнаружена полоса поглощения на частоте 1580 см^-1, отсутствующая у здорового человека (донора) (см. фиг. 2) и указывающая на наличие у пациента онкологического заболевания - лимфогрануломатоз.

Приведенные примеры показывают высокую эффективность предлагаемого способа, который позволяет проводить раннюю диагностику, когда химические методы этого сделать еще не позволяют.

Технический эффект предлагаемого способа заключается в повышении чувствительности примерно в 230 раз, существенном увеличении разрешающей способности за счет использования анализа валентных колебаний, в простоте аппаратурного оформления, использование недорогих стандартных спектрофотометров, относительно малого количества анализируемой крови (0,05 мл), что позволяет проводить диагностику онкозаболеваний у детей, а также и у новорожденных.

Исследования проводились в онкологических отделениях Г. Москвы. При этом для получения ИК-спектра МНПВО крови здорового человека были исследованы 64 донора, при анализе рака крови исследованы 55 пациентов, при анализе рака молочной железы исследованы 50 пациентов, при анализе рака печени исследованы 32 пациента, при анализе онкозаболевания лимфогрануломатоза - 28 пациентов.

Литература:
1. Патент ЕПР (Ep), 891115, G 01 N 33/754, 33/85, N 46, 1990.

2. Патент Япония, 920212 G 01 N 33/50, N 6-1876, 1993.

3. Патент РСТ (WO) 920430, кл. G 01 N 33/574, 33/53, C 07 K 15/14, N 10, 1993.

4. Патент США, 4832483, G 01 N 33/48, т. 1102 N 4, 1990.

5. Харрик Н. Спектроскопия внутреннего отражения. Пер. с англ. М.: Мир, 1970.

6. В.Калоуз, З.Павличек. Биофизическая химия. - М.: Мир, 1985.

Использование: в медицине для диагностики онкологических заболеваний. Сущность: проба крови пациента в объеме 0,05 мл исследуется с помощью спектрального анализа в условии многократного нарушенного полного внутреннего отражения в инфракрасной области спектра, с последующей идентификацией заболевания путем сравнения спектров крови пациента и здорового человека. Заболевание идентифицируют по появлению в спектре полос поглощения в диапазоне частот 1500-3000 см^- 1. При появлении в спектре полосы поглощения на частоте 1625 см^- 1 идентифицируют рак крови, на частоте 1735 см^- 1 - рак молочной железы, на частоте 1580 см^- 1 - рак печени, на частоте 2864 см^- 1 идентифицируют лимфогрануломатоз. Способ позволяет повысить чувствительность анализа, малое количество анализируемой крови позволяет проводить диагностику онкологических заболеваний у детей, а также у новорожденных. 4 з.п. ф-лы, 6 ил.

1. Способ диагностики онкологического заболевания, включающий забор пробы крови у пациента и ее спектральный анализ с последующей идентификацией заболевания путем сравнения спектров крови пациента и здорового человека, отличающийся тем, что спектральный анализ крови осуществляют в условиях многократного нарушенного полного внутреннего отражения в инфракрасной области спектра, а заболевание идентифицируют по появлению в спектре полос поглощения в диапазоне частот 1500 - 3000 см^- 1. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при появлении в спектре полосы поглощения на частоте 1625 см^- 1 идентифицируют рак крови. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при появлении в спектре полосы поглощения на частоте 1735 см^- 1 идентифицируют рак молочной железы. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при появлении в спектре полосы поглощения на частоте 1580 см^- 1 идентифицируют рак печени. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что при появлении в спектре полосы поглощения на частоте 2864 см^- 1 идентифицируют лимфогрануломатоз.