СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОНКОЛОГИЧЕСКОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ У КОШЕК И СОБАК Российский патент 2013 года по МПК G01N33/48 

Область применения

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к способам диагностики онкологических заболеваний у животных, в частности для диагностики ранней стадии онкологических заболеваний, и послеоперационного сопровождения животных для выявления признаков рецидива.

Предшествующий уровень техники

Большинство известных методов диагностики онкозаболеваний у людей и животных направлено на выявление опухоли только одной этиологии. До настоящего времени существует проблема создания универсального способа диагностики злокачественных опухолей, позволяющего выявлять наличие злокачественного опухолевого роста любой этиологии.

Ряд исследователей считает, что наиболее перспективными в этом направлении являются методы, основанные на определении опухолевых маркеров в биологических жидкостях организма, в частности в крови. Известен способ диагностики злокачественных опухолей человека, основанный на выявлении в крови обследуемого белковых фракций, специфичных для злокачественного роста (Короткоручко В.П. Осадочная реакция на рак при диагностике опухолевой болезни. Киев, "Наукова думка". 1967). Выявление этой белковой фракции осуществляли путем выдерживания сыворотки крови в растворе соляной кислоты с последующим осаждением белка азотной кислотой и дальнейшим растворением его в дистиллированной воде. Образующийся осадок белков сыворотки крови онкологических больных в отличие от здоровых людей не растворялся. Результат реакции, получившей название осадочной реакции на рак (ОРР), учитывали по визуальному определению белкового осадка. Этот известный способ является универсальным и позволяет выявить различные формы и локализации злокачественных новообразований. Недостаток способа заключается в его трудоемкости, сложности и низкой чувствительности и специфичности.

Известен способ диагностики онкологического заболевания [1] у людей, включающий забор пробы крови у пациента и ее спектральный анализ с последующей идентификацией заболевания путем сравнения спектров крови пациента и здорового человека, отличающийся тем, что спектральный анализ крови осуществляют в условиях многократного нарушенного полного внутреннего отражения в инфракрасной области спектра, а заболевание идентифицируют по появлению в спектре полос поглощения в диапазоне частот 1500-3000 см^-1, при появлении в спектре полосы поглощения на частоте 1625 см^-1 идентифицируют рак крови, при появлении в спектре полосы поглощения на частоте 1735 см^-1 идентифицируют рак молочной железы, при появлении в спектре полосы поглощения на частоте 1580 см^-1 идентифицируют рак печени, при появлении в спектре полосы поглощения на частоте 2864 см^-1 идентифицируют лимфогранулематоз. Недостаток способа заключается в его трудоемкости и сложности.

Известен также способ отбора лиц для выявления злокачественных новообразований [2], который используется в медицине, а именно при плановом диспансерном профилактичеком обследовании людей с целью оперативного обнаружения онкологических больных на ранних стадиях развития опухолей. Способ включает взятие у обследуемых проб биологического материала, выделение из него культур эшерихиа и стрептококка с последующей инкубацией в присутствии клеток опухоли L929, приготовление мазка и его окрашивание, а также микроскопическое исследование с расчетом диагностического индекса целых клеток /ИЦК/. При ИЦК 50-60% больных отбирают в группу риска, а при ИЦК равном 49% и ниже в группу больных злокачественными новообразованиями. Недостаток способа также заключается в его трудоемкости и сложности, что отражается на точности показателей.

Известен способ дифференциальной диагностики облигатных форм предрака и злокачественных новообразований [3], который основан на определении в плазме человека наличия частиц с гидродинамическими радиусами 5-30 нм, в соотношении 35-55% у обследуемого диагностируют облигатную форму предрака. При определении 55% и выше этих частиц диагностируют злокачественные новообразования. При определении других соотношений этих же частиц делают вывод об отсутствии данных заболеваний. Способ позволяет выявить и оценить изменения в системе гомеостаза.

Недостатками способа [3] является низкая информативность, которая связана с тем, что биологические макромолекулы сыворотки крови: липопротеины, липиды, белки в сыворотке крови нестабильны и сами по себе могут образовывать комплексы во время получения и приготовления образца, использование физиологического раствора без стабилизации его кислотности при проведении измерений. Особенности забора образца, время, затраченное на получение сыворотки или плазмы крови, температура в помещении во время проведения исследования - все это оказывает влияние на формирование и диссоциацию образцов и приводит к тому, что указанный способ дает много ложноположительных результатов. А отсутствие стабилизации кислотности физиологического раствора только усиливает нестабильность исследуемого образца.

Однако способ [3] можно принять за наиболее близкий аналог к заявляемому изобретению.

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявляемое изобретение, является обеспечение достоверной диагностики онкологического заболевания, в том числе на ранней стадии заболевания, путем анализа преобразованной методом Фурье интенсивности светорассеяния излучения при проведении спектроскопии лазерного рассеяния нативной сыворотки крови в условиях контроля концентрации солей и кислотности раствора и снятия спектра интенсивности светорассеяния с контролем температуры образцов, кроме того, техническим результатом является доступность, простота, экономичность способа, а также высокая достоверность диагностики онкологического заболевания, а также возможного риска его возникновения.

Раскрытие изобретения

Технический результат достигается тем, что предложен способ диагностики онкологического заболевания у животных, в частности кошек и собак, включающий анализ преобразованной методом Фурье временного хода интенсивности светорассеяния при проведении спектроскопии лазерного рассеяния сыворотки крови животных при температуре 10-50°С, после нагрева сыворотки в буферном растворе до 70-90°С и последующего охлаждения до температуры 10-50°С.

Для диагностики онкологического заболевания у животного по предлагаемому способу из образца крови получают сыворотку, которую анализируют методом спектроскопии лазерного рассеяния. Временную зависимость интенсивности рассеянного лазерного излучения подвергают преобразованию Фурье, полученная в результате кривая представляет собой зависимость интенсивности рассеянного лазерного излучения от частоты. При проведении исследования сыворотки крови животных для выявления онкологического заболевания анализируют форму кривой, полученной в результате преобразования Фурье. Наблюдается характерная форма кривых в случае животных, больных онкологическим заболеванием и не больных онкологическим заболеванием. У животного, больного онкологическим заболеванием, отношение интенсивности рассеянного излучения на частоте 200 Гц к интенсивности сигнала на частоте 400 Гц меньше величины 1,65. У животных, не больных онкологическим заболеванием, отношение интенсивности рассеянного излучения на частоте 200 Гц к интенсивности сигнала на частоте 400 Гц превышает величину 1,8. Если отношение интенсивности рассеянного лазерного излучения на частоте 200 Гц к интенсивности сигнала на частоте 400 Гц лежит в пределах от 1,65 до 1,8, то диагностируют риск заболевания животного онкологическим заболеванием.

Точность диагностического метода была подтверждена многочисленными примерами спектров излучений, полученных при исследовании сывороток, которые были взяты у животных, не больных онкологическими заболеваниями, так и у животных, больных онкологическими заболеваниями, - пациентов, у которых диагноз онкологического заболевания подтвердился другими методами анализа.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.

Из вены обследуемого животного берут натощак кровь. Затем из крови получают сыворотку любым из общепринятых способов. Для этого пробирку с кровью выдерживают до образования сгустка, а затем отделяют образовавшийся тромб от стен пробирки круговым движением. Пробирку центрифугируют при 1500-2000 оборотах в минуту в течение 10-30 минут, и супернатант переносят в чистую пробирку, которую или замораживают, или передают оператору прибора для выполнения анализа. Аликвоту со 100 мкл сыворотки или плазмы крови помещают в кювету, содержащую гипоизотонический раствор: от 10 до 100% от изотоничности физиологического раствора или от 0.09 до 0.9 г соли хлорида натрия и фосфорной кислоты на 100 г воды, фосфатный водный буфер рН 7.0 - рН 7.8 при температуре 10-40°С. Общий объем образца в кювете составляет 1.0 мл. Затем данный образец нагревают до 70-90°С и постепенно охлаждают до 10-50°С. Проводят лазерную спектроскопию приготовленного образца. Измеряя отношение интенсивности сигнала на частоте 200 Гц и 400 Гц делают заключение о наличии риска онкологического заболевания, или о наличии онкологического заболевания, или об отсутствии онкологического заболевания. При наличии у животного онкологического заболевания отношение интенсивности рассеянного излучения на частоте 200 Гц к интенсивности сигнала на частоте 400 Гц меньше величины 1,65, у животных, не больных онкологическим заболеванием, отношение интенсивности рассеянного излучения на частоте 200 Гц к интенсивности сигнала на частоте 400 Гц превышает величину 1,8. Если отношение интенсивности рассеянного лазерного излучения на частоте 200 Гц к интенсивности сигнала на частоте 400 Гц лежит в пределах от 1,65 до 1,8, то диагностируют риск заболевания животного онкологическим заболеванием.

Примеры

Пример 1.

Собака, сука, возраст 9 лет. Диагноз: рак молочной железы.

Кровь была взята из вены. Плазму центрифугировали при 1500-2000 оборотах в минуту в течение 30 минут. Аликвоту сыворотки помещают в кювету, содержащую изотонический фосфатный буфер рН 7.0 - рН 7.8 при температуре 10-50°С. Сначала образец нагревают до 70-90°С, а затем постепенно охлаждают до 10-50°С и проводят спектроскопию лазерного рассеяния приготовленного образца. После преобразования Фурье временной зависимости интенсивности рассеянного лазерного излучения сравнивают сигнал на частотах 200 Гц и 400 Гц, отношение интенсивностей составляет величину 1,3, что свидетельствует о наличии у животного онкологического заболевания.

Пример 2.

Собака, кобель 7 лет. Диагноз - плоскоклеточный рак кожи.

Образец сыворотки был заморожен при -20°С. После оттаивания образца, хранившегося в течение 10 дней при температуре -20°С, образец центрифугировали при 1500-2000 оборотах в минуту в течение 30 минут. Аликвоту сыворотки помещают в кювету, содержащую изотонический фосфатный буфер рН 7.0 - рН 7.8 при температуре 10-50°С. Сначала образец нагревают до 70-90°С, а затем постепенно охлаждают до 10-50°С и проводят спектроскопию лазерного рассеяния приготовленного образца. После преобразования Фурье временной зависимости интенсивности рассеянного лазерного излучения сравнивают сигнал на частотах 200 Гц и 400 Гц, отношение интенсивностей составляет величину - 1,1, что свидетельствует о наличии у животного онкологического заболевания.

Пример 3.

Кошка 7 лет. Диагноз рак молочной железы. Для этого берут кровь натощак из вены для получения сыворотки общепринятым методом: отстаивают до формирования сгустка, затем сформировавшийся сгусток отрывают круговым движением. Кровь центрифугировали при 1500-2000 оборотах в минуту в течение 30 минут и супернатант аккуратно собирают для анализа. Аликвоту (100 мкл) из этой сыворотки исследовали методом спектроскопии лазерного рассеяния. Аликвоту сыворотки помещают в кювету, содержащую изотонический фосфатный буфер рН 7.0 - рН 7.8 при температуре 10-40°С. Сначала образец нагревают до 70-90°С, а затем постепенно охлаждают до 10-50°С и проводят спектроскопию лазерного рассеяния приготовленного образца. После преобразования Фурье временной зависимости интенсивности рассеянного лазерного излучения сравнивают сигнал на частотах 200 Гц и 400 Гц, отношение интенсивностей составляет величину - 1,5, что свидетельствует о наличии у животного онкологического заболевания.

Пример 4.

Собака, кобель 4 года. Во время ветеринарного обследования, предшествующего сдаче крови, никаких патологий или заболеваний не выявлено. Кровь натощак из вены для получения сыворотки общепринятым методом: отстаивают до формирования сгустка, затем сформировавшийся сгусток отрывают круговым движением. Кровь центрифугировали при 1500-2000 оборотах в минуту в течение 30 минут, и супернатант аккуратно собирают для анализа. Аликвоту сыворотки помещают в кювету, содержащую изотонический фосфатный буфер рН 7.0 - рН 7.8 при температуре 10-50°С. Сначала образец нагревают до 70-90°С, а затем постепенно охлаждают до 10-50°С и проводят спектроскопию лазерного рассеяния приготовленного образца. После преобразования Фурье временной зависимости интенсивности рассеянного лазерного излучения сравнивают сигнал на частотах 200 Гц и 400 Гц отношение интенсивностей составляет величину - 2, что свидетельствует об отсутствии у животного онкологического заболевания.

Таким образом, заявляемый способ диагностики онкологического заболевания позволяет выявить изменения в состоянии сыворотки крови, обеспечивая при этом высокую точность и информативность. Таким образом, достигнут желаемый технический результат, на достижение которого направлено данное изобретение, а именно предложен способ диагностики онкологического заболевания у животных, который обеспечивает достоверную диагностику онкологического заболевания, в том числе на ранней стадии заболевания. Отличительной чертой способа является то, что измерение спектра интенсивности рассеянного лазерного излучения проводится однократно, при температуре 10-50°С после нагрева до 70-90°С и постепенного охлаждения до 10-50°С. Заявляемый способ диагностики онкологического заболевания имеет также еще одно принципиальные отличие от известных способов диагностики, в которых проводят абсолютное измерение каких-либо параметров образца, например процент частиц определенного размера, в то время как в заявляемом способе диагностическим критерием служит численное отношение интенсивности рассеянного лазерного излучения на частотах 200 Гц и 400 Гц, что обусловлено отличием формы спектра интенсивности рассеянного лазерного излучения при спектроскопии сыворотки животных, больных онкологическим заболеванием, и здоровых животных.

Промышленная применимость

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к онкологии, и может быть использовано для диагностики онкологических заболеваний у животных, в частности для диагностики ранней стадии онкологических заболеваний у собак и кошек, и выявления развития рецидивов в послеоперационный период.

Способ достаточно прост, доступен, экономичен, так как не требует больших временных и финансовых затрат. С помощью данного способа можно выделить группы животных, нуждающихся в углубленном инструментальном исследовании с целью обнаружения опухолевого очага.

Источники информации

1. Патент РФ №2108577, Кл. G01N 33/49, G01N 33/52, Публ. 2003.12.20

2. Патент РФ №2042133, Кл. G01N 33/48, Публ. 1995.08.20

3. Патент РФ №2105306, Кл. G01N 33/48, Публ. 1998.02.20

Изобретение относится к области ветеринарии. Способ включает проведение спектроскопии лазерного рассеяния сыворотки крови. При этом исследование спектра интенсивности светорассеяния проводится после нагрева сыворотки до 70-90°С и медленного охлаждения до температуры 10-50°С. Временную зависимость интенсивности рассеянного лазерного излучения подвергают преобразованию Фурье, полученная в результате кривая представляет собой зависимость интенсивности рассеянного лазерного излучения от частоты. При наличии у животного онкологического заболевания отношение интенсивности рассеянного излучения на частоте 200 Гц к интенсивности сигнала на частоте 400 Гц меньше величины 1,65, у животных, не больных онкологическим заболеванием, отношение интенсивности рассеянного излучения на частоте 200 Гц к интенсивности сигнала на частоте 400 Гц превышает величину 1,8. Если отношение интенсивности рассеянного лазерного излучения на частоте 200 Гц к интенсивности сигнала на частоте 400 Гц лежит в пределах от 1,65 до 1,8, то диагностируют риск заболевания животного онкологическим заболеванием. Способ обеспечивает достоверную диагностику онкологического заболевания у животных, в том числе на ранней стадии заболевания. 4 пр.

Способ диагностики онкологического заболевания у животных, включающий проведение спектроскопии лазерного рассеяния сыворотки крови с определением отношения интенсивности спектра рассеянного излучения на частотах 200 Гц и 400 Гц, после преобразования Фурье исходного сигнала, получают спектр интенсивности светорассеяния образца нативной сыворотки крови при 10-50°С, после ее нагрева в буферном растворе до 70-90°С и последующего охлаждения, при развитии у животного онкологического заболевания отношение интенсивности рассеянного излучения на частоте 200 Гц к интенсивности сигнала на частоте 400 Гц меньше величины - 1,65, у животных не больных онкологическим заболеванием отношение интенсивности рассеянного излучения на частоте 200 Гц к интенсивности сигнала на частоте 400 Гц превышает величину 1,8, если отношение интенсивности рассеянного лазерного излучения на частоте 200 Гц к интенсивности сигнала на частоте 400 Гц лежит в пределах от 1,65 до 1,8, то диагностируют риск заболевания животного онкологическим заболеванием.