СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ КРОВИ РЫБ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/50 A01K61/00 

Изобретение относится к области токсикологии и позволяет установить токсичность жидких сред организма рыб.

Известен способ выявления токсичности жидких сред организма рыб путем определения содержания гистамина в рыбопродуктах, в основе которого лежит измерение интенсивной флюоресценции производного, полученного при взаимодействии гистамина с о-фталевым альдегидом [1].

Недостатком этого способа является его техническая сложность использования (требуется длительное время для подготовки образца, высококвалифицированный персонал, сложная аппаратура и остродефицитные реактивы).

Известен способ определения содержания в сыворотке крови рыб общего белка, белковых фракций, которые разделяют методом электрофореза на бумаге. Изменение соотношения альбуминов и глобулинов и их содержания в сыворотке крови свидетельствуют об отравлении рыб [2].

Недостатком этого способа является техническая сложность исполнения (требуется длительное время для разделения белков на фракции, а также остродефицитные реактивы).

Кристаллографический метод нашел применение в биологии и медицине, в частности для судебно-химического анализа, качественного определения лекарственных препаратов, диагностики степени, злокачественности опухолевого процесса, нарушения мозгового кровообращения и т.п.

Задачей изобретения является разработка способа определения токсичности крови рыб путем обеспечения более высокой чувствительности определения. Указанный результат достигается тем, что проводят инкубацию сыворотки крови с кристаллообразующим веществом с последующей кристаллизацией смеси, включающий использование раствора альфа-аминоуксусной кислоты и при появлении центров кристаллизации различной формы, объема и длины а также образований в форме налета определяют токсичность крови рыб.

Способ осуществляют следующим образом. К 5 мл профильтрованного водного раствора альфа-аминоуксусной кислоты /глицина/ добавляют 0,2 мл сыворотки крови рыб, тщательно перемешивают и смесь переносят в чашки Петри, которые помещают в термостат при 37^oC или оставляют на воздухе до полного высыхания содержимого чашки. После инкубации в течение 5 - 6 ч проводят кристаллографическое обследование полученных изменений, контролем служит кристаллография чистого глицина и при появлении центров кристаллизации различной формы и объема, и длины, а также образований в форме налета определяют токсичность крови рыб.

Примеры выполнения способа. Для сравнения на фиг. 1 представлена кристаллография чистого глицина (масштаб 1:1). Она состоит из мягких полиэдрических монокристаллов размерами 4 - 6 мм, различаемых визуально, также встречаются единичные кристаллы типа параллелепипеда длиной до 30 мм. На фиг.2 представлена кристаллография, полученная из сыворотки крови сазана, выловленного 25.05.94 г. в Чардарьинском водохранилище. К 0,2 мл сыворотки крови рыбы добавляют 5 мл раствора альфа-аминоуксусной кислоты, после чего проводят инкубацию на воздухе до кристаллизации смеси. На кристаллографической картине отчетливо видны три поля, состоящие: первая часть состоит из кристаллических образований; вторая часть представляет собой как бы песок; третья часть имеет вид налета, представляющего собой узорчатую решетку размером до 40 мм.

В первой части имеется 4 - 5 центров кристаллизации, имеющих форму листика с прожилками, делящие на две части эти образования и отходящими от них в стороны прожилками. Характерным является присутствие монокристаллов полиэдрической формы размерами 4 - 5 мм и кристаллические образования длиной до 20 мм, а также группы кристаллов в форме копья или качелей и наличие образований в виде веток.

На фиг.3 представлена кристаллография, полученная из сыворотки крови сазана, выловленного 24.09.94 г. весом 1450 г в Чардарьинском водохранилище. К 0,2 мл сыворотки крови добавляют 5 мл раствора альфа-аминоуксусной кислоты, после чего проводят инкубацию на воздухе до кристаллизации смеси. На кристаллографической картине наблюдаются три участка. На первом участке отчетливо видно образование кристаллов различной формы, на втором - образование как бы из песка; на третьем - налет в виде узорчатой решетки длиной до 65 мм. На первом участке наблюдаются 2 - 3 центра кристаллизации, имеющих форму полурадиалий, длиной до 5 - 6 мм, кристаллообразования, имеющие форму качелей или копья до 8 - 10 мм. Монокристаллы имеют размеры 4 - 6 мм в форме параллелепипеда длиной 8 - 10 мм. Видно много образований аморфной формы.

На фиг.4 представлена кристаллография, полученная из сыворотки крови карася, выловленного 28.05.94 г. в Чардарьинском водохранилище. К 0,2 мл сыворотки крови рыбы добавляют 5 мл раствора альфа-аминоуксусной кислоты, после чего проводят инкубацию на воздухе до появления кристаллов. В поле зрения видно большое количество монокристаллов полиэдрической формы 4 - 6 мм, а также монокристаллы типа параллелепипеда длиной до 40 мм. Высота отдельных монокристаллов достигает 2 - 3 мм, отдельный участок до 50 мм представляет собой решетку, построенную из кристаллов, перекрещивающихся под разными углами. В то же время отчетливо видны центры кристаллизации в форме налета, представляющие собой образование в виде "изморози". Отчетливо видны центры кристаллизации, построенные из кристаллов в форме "глыбки" или полурадиальных. Отдельные кристаллические образования имеют форму "копья" и "качелей". Отмечается высокая степень "структурирования" кристаллической картины.

На основании сопоставления кристаллической картины альфа-аминоуксусной кислоты, использованной в качестве контроля, можно сделать заключение о токсичности исследованных проб крови рыб.

Для доказательства выявленных токсических изменений кристаллической картины жидких сред организма рыб было проведено изучение содержания среднемолекулярных пептидов (СМ) крови рыб. Известно, что при эндогенной интоксикации организма человека и животных выявляется широкий спектр метаболитов, оказывающих токсическое действие. Интегральным показателем эндогенной интоксикации считают уровень соединений групп средних молекул (СМ) [3].

В качестве условной нормы принято содержания СМ в крови карпа, выловленного из водоема Чиликского прудхоза 22.03.1994 г. Содержание См в крови 5 исследованных взрослых рыб весом 950 ± 109 г составило 0,051 ± 0,003 У.Е. (см. таблицу). В отличие от контроля содержание среднемолекулярных пептидов в крови сазана /взрослые рыбы весом 1510 ± 129 г/, отловленного весной, составляет в среднем 0,14 ± 0,02 У.Е. Уровень СМ пептидов у сазана (взрослые рыбы весом 1846 ± 140,0 г), обследованного осенью (24.09.94 г.) составляет 0,283 ± 0,032 У.Е. В крови карася (средний вес - 517 ± 13,5 г), отловленного 28.05.94 г., величина СМ пептидов составила 0,143 ± 0,037 У.Е.

Видно, что содержание СМ пептидов в крови рыб увеличивается осенью (уровень воды в водоеме резко падает) и зависит от уровня загрязнения водоема токсическими веществами, которые аккумулируются в органах и тканях рыб и вызывают эндогенную интоксикацию организма рыб. При сопоставлении с условной нормой содержание СМ пептидов видно, что их уровень возрастает в 3 раза при обследовании рыб весной, а осенью увеличивается почти в 6 раз. На основании сопоставления кристаллограмм сыворотки крови обследованных рыб с выявленным уровнем эндогенной интоксикации, определяемой по содержанию СМ пептидов, можно заключить, что представляемый способ определения токсичности выявляет эндогенную интоксикацию организма рыб, проявляющуюся в выявляемой токсичности крови по кристаллограмме.

Способ был опробирован в лаборатории болезней рыб Казахского научно-исследовательского института рыбного хозяйства Академии сельхознаук Республики Казахстан на 113 экземплярах рыб.

Способ определения токсичности крови рыб является высокочувствительным, быстрым (2 - 5 ч), показательным и информативным, может быть использован в целях охраны окружающей среды.

Источники:
1. Временные гигиенические нормативы и метод определения содержания гистамина в рыбопродуктах. Министерство здравоохранения, М. 1986.

2. Метелев В. В. , Канаев А.И., Дзасохова Н.Г. Водная токсикология М.: Колос, 1971, с. 72.

3. Николайчик В. В., Бычко Г.Н., Пилотович В.С. и др. Об использовании метода гель-фильтрации для определения тяжести интоксикации и эффективности детоксикационных процедур. Метод. письмо - Минск, 1983.

Способ предназначен для установления токсичности жидких сред организма рыб и может использован в токсикологии в целях охраны окружающей среды. Сыворотку крови рыб смешивают с раствором альфа-аминоуксусной кислоты и выдерживают. После этого проводят кристаллографическое обследование полученных изменений. При появлении центров кристаллизации различной формы, объема и длины, а также образований в форме налета диагностируют токсичность крови. Способ быстр, высокочувствителен, показателен и информативен. 4 ил., 1 табл.

Способ определения токсичности крови рыб путем анализа сыворотки крови рыб, отличающийся тем, что при анализе крови сыворотку смешивают с раствором альфа-аминоуксусной кислоты и о наличии токсичности крови судят по появлению центров кристаллизации различной формы, объема и длины, а также образований в форме налета.