СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОЖОГОВОЙ ТОКСЕМИИ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано в комбустиологии для диагностики ожоговой токсемии.

В последние годы исследованию синдрома эндогенной интоксикации отводится важная роль. Показано, что эндотоксемия развивается при всех патологических состояниях, связанных с повышенным катаболизмом или блокадой детоксикационных систем организма. Субстратом, ответственным за возникновение местных патологических эффектов эндогенной интоксикации при почечной недостаточности, считают белковые токсины - среднемолекулярные пептиды. К числу последних относили эндогенные компоненты с молекулярной массой 500-2000 Да, образующиеся в процессе протеолиза в поврежденных тканях, а также в самой плазме при выходе в кровь протеолитических ферментов. Для многих видов патологии характерно нарушение функционирования протеазной и антипротеазной систем, причем в результате активации протеолиза происходит накопление большого количества продуктов деградации белков с молекулярной массой 300-5000 Да. В отечественной литературе класс среднемолекулярных продуктов протеолиза именуют как молекулы средней массы (МСМ). Химический состав МСМ весьма неоднороден и объединяет пептиды, гликопептиды, нуклеопептиды, эндорфины, аминосахара, полиамины, многоатомные спирты, некоторые гуморальные регуляторы (инсулин, глюкагон, некоторые витамины, нуклеотиды, олигосахариды, производные глюкуроновых кислот и другие).

Исследование патогенеза и клинической картины ожоговой болезни позволило показать, что ведущая роль в их формировании также принадлежит эндогенной интоксикации. Поэтому верификация ее наличия и степени тяжести необходима для выбора тактики ведения данного контингента пациентов.

За прототип предлагаемого изобретения выбран известный способ диагностики ожоговой токсемии, включающий исследование сыворотки крови (Малахова М.Я. Метод регистрации эндогенной интоксикации. Пособие для врачей. СПб., 1995. - С.7-8).

Известный способ осуществляют следующим образом. Производят забор венозной крови у больного и получают из нее плазму. Пробу фотометрируют при длинах волн от 238 до 300 нм. Анализируют полученные спектрограммы и определяют уровень токсичных продуктов, образующихся при нормальном и нарушенном метаболизме.

Однако данный способ обладает следующими недостатками. Способ позволяет получить лишь фрагментарные сведения о состоянии организма и поэтому требуется проведение комплекса дополнительных исследований. Это обстоятельство удлиняет сроки обследования больного и существенно снижает его диагностическую значимость. Кроме того, он трудоемкий и требует для выполнения дорогостоящего оборудования.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение точности диагностики, обеспечение возможности проведения экспресс-диагностики, сокращение времени исследования и упрощение способа.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе диагностики ожоговой токсемии, включающем исследование сыворотки крови, сыворотку крови больного в объеме 100-200 мкл наносят на предметное стекло и проводят дегидратацию препарата в потоке теплого воздуха при температуре 40-50°С и влажности 20-30% в течение 15-20 минут в горизонтальном положении, сравнивают полученную кристаллоскопическую фацию с паттерном ожоговой токсемии по показателям: индекс структурности, кристаллизуемость, тип взаимодействия кристаллических и аморфных структур, степень деструкции фации, равномерность распределения кристаллических и аморфных элементов фации, степень выраженности ячеистости фации, выраженность отдельных зон кристаллизации, выраженность краевой белковой зоны и рельефность текстуры и при совпадении не менее шести из девяти критериев с паттерном диагностируют ожоговую токсемию.

Предлагаемое изобретение отвечает критериям «новизна» и «изобретательский уровень», так как проведенные патентно-информационные исследования не выявили источников патентной и научно-технической литературы, которые бы порочили новизну предлагаемого способа, равно как и известных способов с существенными признаками предлагаемого технического решения.

Авторами предлагаемого изобретения проведена научно-исследовательская работа, касающаяся оценки информативности биокристаллизации. Для решения поставленных задач проведено исследование особенностей свободного кристаллообразования сыворотки крови у 35 пациентов, имевших ожоговую токсемию, наличие которой подтверждено классическими методами (уровень молекул средней массы, общего белка и его фракций, креатинина и мочевины крови, билирубина, миоглобина), в том числе «золотым стандартом» - путем определения уровня молекул средней массы в крови. Оценка результатов кристаллогенеза биосубстратов осуществлялась с применением системы критериев, описанной ниже. На основании этих исследований был сформирован кристаллоскопический паттерн (табл.1), для которого утверждается диагностическое значение.

Таблица 1 Паттерн свободной кристаллизации сыворотки крови пациентов с эндотоксикозом Показатель Значение Индекс структурности 1-2 Кристаллизуемость 2-3 Тип взаимодействия кристаллов и аморфных тел 0 Степень деструкции фации 1-2 Равномерность распределения элементов образца 2-3 Выраженность ячеистости 3-4 Зонализация фации 0-1 Выраженность краевой зоны 1-2 Четкость текстуры образца 2-3

Для выполнения качественно-количественной оценки результатов собственной кристаллизации сыворотки крови применяют следующие критерии:

1. Индекс структурности. Оценивается по 4-балльной системе:

0 баллов - присутствие в микропрепарате только вещества аморфного строения;

1 балл - дискретная часть образца представлена аморфными телами и единичными кристаллами;

2 балла - наличие в фации, кроме вышеуказанных элементов, дендритного компонента;

3 балла - большая часть или все поле зрения образовано крупными дендритными структурами, аморфные тела и одиночные кристаллы немногочисленны.

2. Кристаллизуемость. Определяется по 4-баллой шкале:

0 баллов - нет центров кристаллизации;

1 балл - единичные мелкие кристаллы преимущественно одиночного ряда (не более 10 в поле зрения при суммарном увеличении микроскопа ×56);

2 балла - значительное количество центров кристаллизации (более 10 в поле зрения при суммарном увеличении микроскопа ×56);

3 балла - все поле зрения покрыто кристаллами одиночно-кристаллического или дендритного ряда.

3. Тип взаимодействия кристаллических и аморфных структур. Возможны два варианта реализации показателя:

а) налипание аморфных частиц на крупные кристаллические образования;

б) оттеснение элементов аморфного строения от кристаллических структур.

4. Степень деструкции фации. Выражается в четырех степенях:

0 степень - все элементы фации правильной конфигурации, не разрушены как в целом, так и на отдельных участках; признаки разрушения текстуры фации отсутствуют;

I степень - элементы фации имеют начальные признаки разрушения, деструктивные изменения текстуры не наблюдаются;

II степень - визуализируются многочисленные разрушенные или измененные структуры; есть локальные нарушения целостности текстуры;

III степень - все элементы фации разрушены, невозможно различить отдельные части фации и структуры, образец представляет собой бесформенную массу аморфного, зачастую окрашенного, материала; отмечаются четкие признаки разрушения текстуры.

5. Равномерность распределения кристаллических и аморфных элементов фации. Интерпретируется с использованием шестибалльной шкалы:

0 баллов - полная хаотичность фации, наличие разнородных элементов, пустот, мест скопления кристаллических структур, различная ориентация образований в поле зрения.

1 балл - умеренная сгруппированность кристаллов, намечаются единичные участки правильного их построения, занимающие менее 30% от общей площади поля зрения, направленность фигур еще хаотичная.

2 балла - наблюдаются четкие "островки" упорядоченности, занимающие от 30 до 50% поля зрения (изучается не менее трех), расстояния между элементами в группах приблизительно уравниваются, регистрируется некоторая закономерность направленности структурных образований фации.

3 балла - элементы фации в значительном числе (более 50% от общего количества) структурированы, "островки" равномерности переходят в участки сравнительно большой площади. Внутри этих зон наблюдаются правильное расположение и равномерность расстояний между отдельными образованиями. Закономерность направленности элементов и зональность просматриваются достаточно четко.

4 балла - элементы фации в большинстве своем структурированы (свыше 75% от общего количества), остальные распространяются "островками" по полю зрения, чаще в краевой (маргинальной) зоне. Расстояния между отдельными образованиями практически постоянны. Ориентация элементов подчиняется определенной закономерности почти по всему полю зрения.

5 баллов - все элементы тезиграфической фации четко структурированы на всем поле зрения, что подтверждается рассмотрением нескольких полей. Деление на центральную, промежуточную и краевую зоны четко просматривается. Границы последних можно установить даже без микроскопа. Расстояния между элементами картины постоянны, ориентация фигур правильная, закономерная на всей поверхности фации.

6. Степень выраженности ячеистости фации. Оценка производится по шестибалльной шкале:

0 баллов - полное отсутствие признаков появления ячеистости, однородность картины, нет выделения «островков» кристаллов. Фации представляют единый «пласт» кристаллических образований.

1 балл - наличие первых признаков неоднородности, «дробления» кристаллоскопической картины:

- начало обособления групп элементов (менее 30% от числа всех образований, занимающих менее 30% поля зрения);

- появление некоторой неоднородности картины;

- начало «дробления» единого «пласта» кристаллических фигур.

2 балла - отмечается достаточно просматриваемая тенденция к «дроблению» фации, образованию «островков» кристаллов:

- количество обособившихся элементов в «островках» - от 30 до 50% от числа всех структур, они занимают более 30% поля зрения фации;

- выраженная неоднородность, зональность картины;

- визуализируется процесс «разделения фации на участки, регистрируются формирующиеся пояса кристаллизации, служащие границами последних, в некоторых случаях не на всем протяжении, толщиной в 1 кристалл.

3 балла - наблюдаются выраженные изменения в фации:

- элементы в «островках» составляют от 50 до 75% от общего числа, занимаемая ими поверхность - более 50% поля зрения (по нескольким полям);

- выраженная неоднородность, «зернистость» картины;

- четко просматривается процесс «расчленения» фации в нескольких полях зрения;

- пояса кристаллизации довольно четкие, образованы более чем одним рядом кристаллических структур.

4 балла - достоверно просматриваются признаки появления ячеистости:

- число сгруппированных в ячейки структур от 75 до 100% от общего количества;

- сгруппированные элементы занимают все поле зрения (при изучении не менее чем трех полей);

- очень четко выражены «дробность», «зернистость» картины;

- пояса кристаллизации образованы более чем одним рядом кристаллов, имеются на всей поверхности поля зрения, окружают «островки» полностью.

5 баллов - картина характеризуется следующими наиболее диагностически значимыми морфологическими признаками:

- число сгруппированных в ячейки структур от 75 до 100% от общего количества;

- сгруппированные элементы занимают все поле зрения (при изучении нескольких, не менее чем трех полей зрения);

- очень четко выражена "дробность", "зернистость" картины;

- пояса кристаллизации образованы более чем одним рядом кристаллов, имеются на всей поверхности поля зрения, окружают "островки" полностью;

- присутствуют "разломы" картины (кроме фаций сыворотки крови, для которых данный феномен является самостоятельным диагностическим признаком).

7. Выраженность отдельных зон кристаллизации. Выражается в баллах (от 0 до 3):

0 баллов - невозможность выделения зон кристаллоскопической фации;

1 балл - при малом увеличении светового микроскопа выделение зон неотчетливое, наблюдаются незначительные признаки зонализации;

2 балла - наличие зон фации четко определяется при малом увеличении микроскопа;

3 балла - четкая визуализация зон даже без микроскопа.

8. Выраженность краевой белковой зоны. Данный показатель оценивается по 4-балльной шкале:

0 баллов - полное отсутствие краевой зоны, невозможно выделение краевой зоны под «малым» (мельче ×56) увеличением микроскопа;

1 балл - краевая зона присутствует нечетко и/или не на всем протяжении фации;

2 балла - при микроскопии по всему периметру микропрепарата отмечается наличие выраженной краевой зоны;

3 балла - соотношение «ширина краевой зоны: радиус фации» превышает 1:3;

4 балла - выраженная краевая зона в сочетании с наличием «разломов»;

5 баллов - краевая зона визуализируется даже без использования микроскопа.

9. Рельефность текстуры. Оценивается по прямой 4-балльной схеме:

0 баллов - нет признаков наличия текстуры;

1 балл - едва заметные при микроскопии элементы (участки) текстуры;

2 балла - хорошо различимая при микроскопии текстура фации;

3 балла - визуализируемая без использования микроскопа текстура микропрепарата.

Данный способ не требует специализированного оборудования и дополнительных реактивов, кроме микроскопа с увеличением не более ×56 и предметных стекол, как для процедуры подготовки препаратов, так и для самого исследования, выполняется в течение 10-15 мин, прост в исполнении, экономичен.

Способ диагностики ожоговой токсемии осуществляют следующим образом.

На предварительно обезжиренное, промытое и просушенное предметное стекло наносят 3 образца сыворотки крови пациента объемом 100-200 мкл. В дальнейшем для получения фации биосубстрата производят дегидратацию микропрепарата в потоке теплого воздуха (температура 40-50°С, влажность 20-30%). При этом горизонтальное положение стекла и соответствующее направление потока обеспечивает дегидратацию проб в одинаковых условиях, не допуская их объединения. Длительность высушивания составляет 15-20 мин.

Далее с помощью цифровой фотокамеры высокого разрешения получают цифровое изображение препарата, которое переносят в память компьютера и изучают основные структурообразующие элементы фаций.

На основании подсчета показателей формируют паттерн их значений. При его соответствии паттерну ожоговой токсемии (табл.1) судят о ее наличии, для чего необходимыми признаками является совпадение не менее чем значений шести из девяти параметров. При подобной оценке чувствительность анализа составляет 86%, специфичность - 78% по отношению к «золотому стандарту» - методу определения среднемолекулярных пептидов (Малахова М.Я., 1995). Снижение количества совпадений до пяти не является диагностически значимым, т.к. в этом случае эндотоксикоз лабораторно подтверждается менее чем 25% случаев, что не позволяет признать этот уровень допустимым.

Клинический пример.

Больной З., 46 лет, поступил в отделение с диагнозом: ожог пламенем вольтовой дуги и пламенем от загоревшейся одежды I-II-IIIAB-IV степени лица, туловища, конечностей на площади 30% поверхности тела. Ожоговый шок. На момент взятия крови состояние больного тяжелое, ожоговая болезнь в стадии острой токсемии. Пациент вял, жалуется на общую слабость и тошноту. Отмечается гипертермия до 38°С. В общем анализе крови: лейкоцитоз до 22·10⁹/л, СОЭ до 20 мм/ч. В биохимический анализе: гипопротеинемия (50 г/л) за счет снижения всех белковых фракций (альбумин 30 г/л, глобулины 20 г/л), гипербилирубинемия (22 мкмоль/л), гиперкреатининемия (139,5 мкмоль/л), уровень мочевины 9,3 ммоль/л, СМП Е₂₅₄ - 0,45; E₂₈₀ - 0,54; титр миоглобина 1:64. Данные показатели свидетельствуют о наличии у больного эндотоксикоза средней степени тяжести. Больной получал курс антибиотиков, обезболивающих препаратов, проводилась инфузионно-трансфузионная терапия.

При проведении кристаллоскопического исследования (табл.2, фиг.2) фация сыворотки крови больного была охарактеризована следующим образом: индекс структурности - 1,5 балла; кристаллизуемость - 2,5 балла; тип взаимодействия кристаллов и аморфных тел - налипание; степень деструкции фации - 1,5 баллов; равномерность распределения кристаллических и аморфных элементов фации - 3 балла; степень выраженности ячеистости фации - 2 балла; выраженность отдельных зон кристаллизации - 1 балл; выраженность краевой белковой зоны - 1 балл; рельефность текстуры - 2 балла. По результатам кристаллоскопии 8 из 9 показателей находятся в пределах паттерна ожоговой эндотоксемии, что подтверждено другими верифицирующими методами.

Таблица 2 Результаты кристаллоскопии сыворотки крови больного З. Показатель СК больного З. «Паттерн» Совпадение Индекс структурности 1,5 1-2 + Кристаллизуемость 2,5 2-3 + Тип взаимодействия кристаллов и аморфных тел налипание налипание + Степень деструкции фации 1,5 1-2 + Равномерность распределения элементов образца 3 2-3 + Выраженность ячеистости 2 3-4 - Зонализация фации 1 0-1 + Выраженность краевой зоны 1 1-2 + Четкость текстуры образца 2 2-3 + Заключение: наличие 8 совпадений позволяет свидетельствовать о наличии ожогового эндотоксикоза

На фиг.1 изображена кристаллоскопическая картина сыворотки крови здорового человека. Видна широкая краевая зона (1), четкие регулярные центростремительные разломы (2), признаки умеренной кристаллизации в форме одиночных элементов (3). На фиг.2 представлена кристаллограмма сыворотки крови больного 3, на которой видны узкая краевая зона (1), нерегулярные, хаотично расположенные разломы (2) и выраженная деструкция кристаллических элементов фации (3).

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике. Сущность способа диагностики ожоговой токсемии заключается в том, что сыворотку крови больного в объеме 100-200 мкл наносят на предметное стекло и проводят дегидратацию препарата в потоке теплого воздуха при температуре 40-50°С и влажности 20-30% в течение 15-20 минут в горизонтальном положении. Фацию сравнивают с паттерном ожоговой токсемии по показателям: индекс структурности, кристаллизуемость, тип взаимодействия кристаллических и аморфных структур, степень деструкции фации, равномерность распределения кристаллических и аморфных элементов фации, степень выраженности ячеистости фации, выраженность отдельных зон кристаллизации, выраженность краевой белковой зоны и рельефность текстуры. При совпадении не менее шести из девяти значений критериев с паттерном сравнения диагностируют ожоговую токсемию. Использование заявленного способа позволяет повысить точность диагностики, сократить время исследования. 2 табл., 2 ил.

Способ диагностики ожоговой токсемии, заключающийся в исследовании сыворотки крови, отличающийся тем, что сыворотку крови больного в объеме 100-200 мкл наносят на предметное стекло и проводят дегидратацию препарата в потоке теплого воздуха при температуре 40-50°С и влажности 20-30% в течение 15-20 мин в горизонтальном положении, сравнивают полученную кристаллоскопическую фацию с паттерном ожоговой токсемии по показателям: индекс структурности, кристаллизуемость, тип взаимодействия кристаллических и аморфных структур, степень деструкции фации, равномерность распределения кристаллических и аморфных элементов фации, степень выраженности ячеистости фации, выраженность отдельных зон кристаллизации, выраженность краевой белковой зоны и рельефность текстуры и при совпадении не менее шести из девяти значений критериев с паттерном диагностируют ожоговую токсемию.