СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ СТЕПЕНИ ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ОРГАНИЗМА У БОЛЬНЫХ РАСПРОСТРАНЕННЫМИ ХРОНИЧЕСКИМИ ДЕРМАТОЗАМИ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/68 G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматовенерологии, и может применяться для прогнозирования степени эндогенной интоксикации организма у больных распространенными хроническими дерматозами (псориазом, обыкновенной пузырчаткой, атопическим дерматитом).

Клинико-лабораторными исследованиями установлено, что тяжесть течения хронических дерматозов значительно усугубляется развитием эндогенной интоксикации (ЭИ), выраженность которой коррелирует с клиническими проявлениями и степенью метаболических нарушений в организме больного (Переслегина И.А. и соавт., 1996; Химкина Л.Н., 2001; Гараева З.Ш., 2004). В связи с этим лабораторная диагностика ЭИ имеет большое значение для прогнозирования тяжести течения распространенных хронических дерматозов и назначения адекватных методов лечения.

В качестве прототипа изобретения (Жилина Н.М. и соавт., 1999) выбран способ оценки ЭИ организма путем вычисления прогностического индекса интоксикации (ПИИ) по формуле

ПИИ=(МСМпл/МСМэр+ОПпл/ОПэр)/РСА,

где МСМпл - содержание молекул средней массы (МСМ) в плазме крови;

МСМэр - содержание МСМ в эритроцитах;

ОПпл - количество олигопептидов в составе МСМ из плазмы крови;

ОПэр - количество олигопептидов в составе МСМ из эритроцитов;

РСА - резервная связывающая способность альбумина плазмы крови.

При этом ПИИ от 0,5 до 1,5 означает отсутствие ЭИ; ПИИ от 1,55 до 3,84 - компенсаторное состояние ЭИ; ПИИ от 3,85 до 6, 24 - критическое состояние для развития тяжелой ЭИ. Для расчета ПИИ производят определение суммарного количества МСМ и олигопептидов в составе МСМ в плазме и эритроцитах крови, а также РСА.

Однако данный способ обладает рядом существенных недостатков. Для определения ПИИ требуется иметь в лаборатории набор дорогостоящего оборудования: спектрофотометр не хуже СФ-26, флуоресцентный анализатор с набором калибровочных зондов и диагностические наборы. Кроме того, для вычисления ПИИ требуется определять 5 показателей одновременно, что усложняет проведение анализа и увеличивает время его проведения в расчете на одного больного.

Задача изобретения заключается в упрощении способа прогнозирования степени ЭИ и сокращении времени проведения анализа.

Поставленная задача решается тем, что дополнительно в плазме крови определяют концентрацию альфа₂-макроглобулина, вычисляют отношение концентрации олигопептидов к концентрации альфа₂-макроглобулина и при его значении меньше 5,0 прогнозируют отсутствие ЭИ, при значении 5,1-9,0 - среднюю степень ЭИ, а при значении больше 9,1 - высокую степень ЭИ организма у больного хроническим дерматозом.

Способ осуществляется следующим образом.

У больного после поступления в стационар утром натощак берут из локтевой вены 3,0 мл крови и помещают в пробирку с гепарином. Для получения плазмы кровь центрифугируют в течение 15 мин при 1500 об/мин. К 1,0 мл плазмы прибавляют 0,5 мл 15,0% раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения крупномолекулярных белков. Смесь центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об/мин. В полученном супернатанте находятся молекулы средней массы.

Метод определения олигопептидов.

Метод проводится с использованием набора реактивов для определения белка по методу Лоури фирмы «Синтакон» (СПб, Россия).

В состав набора входит следующее.

1. Реактив Фолина-Чокальтеу (2N) - 20 мл.

(смесь фосфорно-молибденовой и фосфорно-вольфрамовой кислот).

2. Сульфат меди - 0,1 г (4-10 М).

3. Цитрат натрия - 0,2 г (6,8-10 М).

4. Карбонат натрия - 10,0 г (0,094 М).

5. Раствор едкого натра (2N) - 25 мл.

6. Раствор бычьего сывороточного альбумина (250 мкг/мл) для построения калибровочного графика - 3 мл, 1 ампула.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАСТВОРОВ

Реактив А.

Цитрат натрия (3) количественно растворяют в 15 мл дистиллированной воды, к полученному раствору добавляют сульфат меди (2) и общий объем раствора доводят дистиллированной водой до 20 мл. Полученный реактив хранится в посуде из темного стекла в течение 2-4 недель в прохладном месте.

Реактив Б.

Карбонат натрия (4) количественно растворяют приблизительно в 100 мл воды, затем полученный раствор смешивают с предварительно разведенным в 200 мл воды раствором едкого натра (5) и доводят полученный раствор до 500 мл. Полученный реактив пригоден для использования в течение месяца при условии хранения в пластмассовой таре.

Реактив Фолина (1N)

Реактив Фолина-Чокальтеу (2N) из набора разводят дистиллированной водой в соотношении 1:1.

ПОСТРОЕНИЕ КАЛИБРОВОЧНОЙ КРИВОЙ И ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА В ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦАХ

1. Для построения калибровочной кривой следует приготовить раствор бычьего сывороточного альбумина в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1NNРаствор белка 250 мкг/мл, млДистиллированная вода или буфер, млСодержание белка в пробе (мкг)1.0,040,36102.0,080,32203.0,10,3254.0,160,24405.0,20,2506.0,280,12707.0,340,06858.0,4-1009.-0,40

Соответствующий буфер рекомендуется использовать в случае, если он содержится в исследуемых образцах белка.

2. Приготовление рабочего раствора В. К 50 мл реактива Б прибавить 1 мл реактива А. Раствор В всегда готовится непосредственно перед анализом.

3. В каждую пробирку, содержащую разведения белка для калибровочного графика, прибавить по 2 мл рабочего раствора В. Перемешать и дать постоять при комнатной температуре в течение 10 мин для образования биуретовых комплексов. Затем прибавить по 0,2 мл 1N реактива Фолина-Чокальтеу, перемешать и оставить для развития окраски на 30-40 мин.

4. Измерение оптической плотности рекомендуется проводить на спектрофотометре при длине волны 740-750 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см. В качестве раствора сравнения используют раствор из пробирки К (контрольная проба). Возможно использование фотоколориметра, однако, в этом случае необходимо использовать кюветы с меньшей толщиной слоя, чтобы объем пробы был достаточным.

5. Строится калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации белка, который должен быть линейным в диапазоне концентраций от 10 до 90-100 мкг белка в образце. При использовании одних и тех же реактивов калибровочный график может использоваться в течение их срока годности.

6. Определение концентрации белка в исследуемых образцах проводится после разведения образцов таким образом, чтобы концентрация белка в них находилась в пределах линейного диапазона калибровочного графика. Например, сыворотку крови необходимо развести в 300 раз. К 0,4 мл разведенного образца (содержащего от 10 до 100 мкг белка в этом объеме) прибавить 2 мл рабочего раствора В, перемешать и дать постоять при комнатной температуре 10 мин. Затем добавить в пробирку 0,2 мл реактива Фолина (1N) и после перемешивания подождать, пока разовьется окраска 30-40 мин. Измерения проводить против контрольного раствора, не содержащего белка, в тех же условиях, что и при построении калибровочного графика.

Если оптическая плотность в исследуемых образцах не соответствует значениям, полученным при построении калибровочного графика, необходимо внести поправку при разведении и повторить определение концентрации белка.

Метод определения уровня альфа₂-макроглобулина.

Определение уровня альфа₂-макроглобулина в той же плазме крови проводится иммунотурбидиметрическим методом с использованием диагностических наборов фирмы «SENTINEL» (Италия). Оно основано на специфическом взаимодействии между антителами к альфа₂-макроглобулину поликлональной антисыворотки и соответствующим антигеном при оптимальном рН в присутствии полиэтиленгликоля. Мутность раствора, возникающая в результате образования комплекса, прямо пропорциональна концентрации альфа₂-макроглобулина в пробе.

СОСТАВ НАБОРА

1. Реагент А 2×50 мл

Фосфатный буфер, рН=7,520 ммоль/лПЭГ>=5%Хлорид натрия150 ммоль/лАзид натрия<0,1%

2. Реагент В 2×1 мл

Поликлональные антитела к альфаз-макроглобулину

Азид натрия<0,1% 50 ммоль/л

3. Реагент С

Буфер Гуддса, рН=7,550 ммоль/лХлорид натрия150 ммол/лАзид натрия0,1%

4. Пустой флакон на 20 мл для приготовления рабочего раствора ВС может быть использован для установки на некоторых типах автоанализаторов.

ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ

Реагент А готов к применению. В нераспечатанном флаконе реагент стабилен вплоть до указанной даты при хранении 2...8°С. После вскрытия реагент сохраняет стабильность в течение 120 дней при 2...8°С.

Раствор ВС: Смешайте 1 часть реагента В и 3 части реагента С. Тщательно перемешайте, не допуская вспенивания. Раствор стабилен в течение 60 дней при хранении 2...8°С.

ПРОБЫ

Сыворотка, плазма (ЭДТА).

Стабильность: 5 дней при температуре хранения 2...8°С.

Перед проведением анализа пробы пациентов и контрольные материалы разводятся физиологическим раствором в отношении 1:21 (1v+20v).

УСЛОВИЯ ИЗМЕРЕНИЯ

Длина волны340 (334-365) нмОптический путь1 смТемпература37°С

Измерение: по конечной точке (увеличение оптической плотности).

СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Перед проведением анализа реагенты следует прогреть до 37°С. Температура должна быть стабильной (+/-0,5°С) в течение всего определения (см. таблицу 2).

Таблица 2Добавить в кюветы (мкл)Холостая пробаКалибровочная пробаОпытная (контрольная проба)Физиологический раствор100--Калибратор-100-Разведенная проба/контроль--100Реагент А900900900Раствор ВС100100100

Осторожно перемешать, инкубировать 10 минут при 37°С. Измерить оптическую плотность калибратора, проб и контрольных материалов против холостой пробы. При отсутствии калибратора результат исследования выдается в усл. единицах оптической плотности = (оптическая плотность пробы × 10).

Пропорциональное изменение объемов реагентов и пробы не влияет на конечный результат.

КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА

Для проведения контроля качества рекомендуется использовать контрольные сыворотки с аттестованными для этого метода значениями альфа₂-макроглобулина.

После определения содержания олигопептидов и альфа₂-маркоглобулина вычисляют отношение их концентраций и при его значении меньше 5,0 прогнозируют отсутствие ЭИ, при значении 5,1-9,0 - среднюю степень ЭИ, а при значении больше 9,1 - высокую степень ЭИ организма у больного хроническим дерматозом.

Примеры конкретного исполнения.

Пример 1. Больная Г-ва Т.П., 56 лет. И/б №2327, госпитализирована в НИКВИ 15.12.04. с жалобами на многочисленные высыпания на туловище и конечностях, болями в межфаланговых суставах пальцев кистей и стоп, коленных суставах, их деформацию, отечность, утреннюю скованность. Диагноз: псориаз распространенный, инфильтративно-бляшечная форма, стационарная стадия. Псориатический полиартрит.

С целью прогнозирования степени эндогенной интоксикации организма у больного после поступления в стационар утром натощак в пробирку с гепарином взяли из локтевой вены 3,0 мл крови. Для получения плазмы кровь центрифугировали в течение 15 мин при 1500 об/мин. К 1,0 мл плазмы прибавили 0,5 мл 15,0% раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения крупномолекулярных белков. Смесь центрифугировали в течение 30 мин при 3000 об/мин. В полученном супернатанте находятся молекулы средней массы.

Определение количества олигопептидов в составе МСМ плазмы крови проводили с использованием набора реактивов для определения белка по методу Лоури фирмы «Синтакон» (СПб, Россия), уровень альфа-2 макроглобулина - иммунотурбидиметрическим методом с использованием диагностических наборов фирмы «SENTINEL» (Италия) и затем вычислили отношение концентрации олигопептидов к концентрации альфа₂-макроглобулина, чтобы получить значение индекса протеолитической активности (ИПА) у данной больной.

Содержание олигопептидов составило 46,0 мг/л (норма 18,7±1,14 мг/л), количество альфа₂-макроглобулина - 7,0 у.е. (в норме - 8,54±0,32 у.е.), ИПА - 6,57. Данный показатель отражает среднюю степень эндогенной интоксикации в организме и требует обязательного включения в комплекс терапии препаратов дезинтоксикационного воздействия. С этой целью, наряду с патогенетическими средствами лечения псориаза (метотрексат), больная получала энтеросорбент растительного происхождения - полифепан, физиопроцедуры, в связи с поражением суставов (электрофорез с гепарином на межфаланговые суставы кистей). В процессе лечения очаги псориаза стали менее выраженными, боли в суставах менее интенсивными. Выписана со значительным улучшением.

Пример 2. Больная Л-ва Т.Н., 53 лет. И/б №1773. Госпитализирована в НИКВИ 4.10.04. Диагноз: Псориаз распространенный, прогрессирующая стадия, экссудативная форма. Псориатический полиартрит.

С целью прогнозирования степени эндогенной интоксикации организма у больного после поступления в стационар утром натощак в пробирку с гепарином взяли из локтевой вены 3,0 мл крови. Для получения плазмы кровь центрифугировали в течение 15 мин при 1500 об/мин. К 1,0 мл плазмы прибавили 0,5 мл 15,0% раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения крупномолекулярных белков. Смесь центрифугировали в течение 30 мин при 3000 об/мин. В полученном супернатанте находятся молекулы средней массы.

Определение количества олигопептидов в составе МСМ плазмы крови проводили с использованием набора реактивов для определения белка по методу Лоури фирмы «Синтакон» (СПб, Россия), уровень альфа-2 макроглобулина - иммунотурбидиметрическим методом с использованием диагностических наборов фирмы «SENTINEL» (Италия) и затем вычислили отношение концентрации олигопептидов к концентрации альфа2-макроглобулина, чтобы получить значение индекса протеолитической активности (ИПА) у данной больной.

Содержание олигопептидов - 38,0 мг/л (норма 18,7±1,14 мг/л), уровень альфа₂-макроглобулина 3,7 у.е. (в норме - 8,54±0,32 у.е.). ИПА составил 10,2. Данный показатель отражает высокую степень эндогенной интоксикации в организме и требует обязательного включения в комплекс терапии препаратов дезинтоксикационного воздействия парентерального введения. Значительное клиническое улучшение было достигнуто применением наряду с патогенетическими средствами лечения псориаза (метотрексат), внутривенных капельных вливаний реополиглюкина №5.

Пример 3. Больная Л-ва М.П., 44 года. И/б 1763, госпитализирована в НИКВИ 29.09.04 с жалобами на обширные высыпания по всей поверхности верхней части груди, спины, голеней. Диагноз: псориаз распространенный, прогрессирующая стадия. Псориатический артрит.

С целью прогнозирования степени эндогенной интоксикации организма у больного после поступления в стационар утром натощак в пробирку с гепарином взяли из локтевой вены 3,0 мл крови. Для получения плазмы кровь центрифугировали в течение 15 мин при 1500 об/мин. К 1,0 мл плазмы прибавили 0,5 мл 15,0% раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения крупномолекулярных белков. Смесь центрифугировали в течение 30 мин при 3000 об/мин. В полученном супернатанте находятся молекулы средней массы.

Определение количества олигопептидов в составе МСМ плазмы крови проводили с использованием набора реактивов для определения белка по методу Лоури фирмы «Синтакон» (СПб, Россия), уровень альфа-2 макроглобулина - иммунотурбидиметрическим методом с использованием диагностических наборов фирмы «SENTINEL» (Италия) и затем вычислили отношение концентрации олигопептидов к концентрации альфа2-макроглобулина, чтобы получить значение индекса протеолитической активности (ИПА) у данной больной.

Содержание олигопептидов в плазме крови данной больной составило 26,0 мг/л (норма 18,7±1,14 мг/л), количество альфа2-макроглобулина - 6,5 у.е. (в норме - 8,54±0,32 у.е.), ИПА - 4,0. Данный показатель отражает отсутствие эндогенной интоксикации на момент обследования и не требует обязательного включения в комплексную терапию препаратов с дезинтоксикационным воздействием. Больная выписана со значительным улучшением состояния кожного процесса.

Всего предлагаемым методом было обследовано 34 больных псориазом, 15 - атоническим дерматитом и 10 - обыкновенной пузырчаткой.

Таким образом, предлагаемый способ обладает следующими преимуществами перед наиболее совершенным из известных способов.

1. Используется менее дорогостоящее оборудование и реактивы. Для определения ИПА требуется только фотоэлектроколориметр и диагностические наборы.

2. Упрощается процедура оценки степени ЭИ без потери информативности и сокращается время определения в расчете на 1 больного за счет сокращения количества определяемых показателей.

Литература

1. Гараева З.И. Результаты мониторинга показателей эндогенной интоксикации и антиэндотоксинового иммунитета у больных псориазом в процессе их лечения / З.И.Гараева // Тезисы научных работ Всероссийской конференции дерматовенерологов. - Нижний Новгород, 2004. - С.8.

2. Жилина Н.М. Оптимизация диагностики эндогенной интоксикации / Н.М.Жилина. - Автореф. дисс. канд. биол. наук. - Тула, 1999. - 122 с.

3. Переслегина И.А. Роль детоксицирующих ферментов в регуляции иммунного статуса детей с атоническим дерматитом / И.А.Переслегина, М.Л.Юдина, И.В.Майянская // Эфферентная терапия. - 1996. - №2. - С.55-59.

4. Химкина Л.Н. Значение эндогенной интоксикации при хронических дерматозах. Методы коррекции / Л.Н.Химкина, Н.А.Добротина, Т.В.Копытова // Вестник дерматологии и венерологии. - 2001. - №5. - С.40-43.

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматовенерологии, и может применяться для прогнозирования степени эндогенной интоксикации у больных распространенными хроническими дерматозами (псориаз, обыкновенная пузырчатка, атонический дерматит). Для осуществления способа до начала лечения в плазме крови больного определяют концентрацию олигопептидов в составе молекул средней массы и дополнительно концентрацию альфа₂-макроглобулина. Затем вычисляют отношение концентрации олигопептидов к концентрации альфа2-макроглобулина, и при его значении меньше 5,0 прогнозируют отсутствие эндогенной интоксикации, при значении 5,1-9,0 - среднюю степень, а при значении больше 9,1 - высокую степень эндогенной интоксикации. Использование изобретения позволяет сократить время проведения анализа и упростить процедуру оценки степени эндогенной интоксикации без потери информативности. 2 табл.

Способ прогнозирования эндогенной интоксикации (ЭИ) организма у больных распространенными хроническими дерматозами (псориазом, обыкновенной пузырчаткой, атопическим дерматитом) путем определения до начала лечения концентрации олигопептидов в составе молекул средней массы из плазмы крови больного, отличающийся тем, что дополнительно в плазме крови определяют концентрацию альфа₂-макроглобулина, вычисляют отношение концентрации олигопептидов в составе молекул средней массы из плазмы крови к концентрации альфа₂-макроглобулина в плазме крови и при его значении меньше 5,0 прогнозируют отсутствие ЭИ, при значении 5,1-9,0 - среднюю степень ЭИ, а при значении больше 9,1 - высокую степень ЭИ организма у больного хроническим дерматозом.