СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГОСПИТАЛЬНОГО ШТАММА СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ PSEUDOMONAS AERUGINOSA Российский патент 1998 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/70 C12Q1/04 C12R1/385 

Изобретение относится к области медицины, в частности к эпидемиологии, и может быть использовано при диагностике госпитального штамма Ps aeruginosa.

Проблема внутрибольничных инфекций, вызываемых госпитальными штаммами микроорганизмов, в последние годы приобрела исключительно большое значение для клиник всего мира. Укрупнение лечебных учреждений, создание новых видов медицинского оборудования, внедрение новых сложных операций, применение новейших препаратов, обладающих иммунодепрессивными свойствами, искусственное подавление иммунитета при пересадке органов и тканей - все это усиливает угрозу распространения госпитальных инфекций среди больных и персонала лечебных учреждений. Поэтому вполне понятно возрастание роли лабораторного контроля стационаров с целью выявления госпитального штамма микроорганизма в организме больного или персонала, а также на объектах окружающей среды, что позволит обосновать этиологическую значимость микроорганизма в возникновении заболевания или вспышки инфекции, а также установить принадлежность выделенного возбудителя к госпитальному штамму.

В настоящее время возрос удельный вес госпитальных инфекций. Среди госпитальных инфекций синегнойная инфекция занимает особое место из-за тяжести течения заболеваний, вызываемых ею, а также высокой устойчивости ее к лекарственным препаратам.

Поэтому диагностика штамма синегнойной палочки как госпитального является очень важной задачей.

Для такой диагностики используют изучение биологических и серологических свойств штамма Ps aeruginosa.

Известны способы диагностики госпитального штамма Ps aeruginosa путем определения ограниченного количества биологических и серологических свойств, таких как: чувствительность к антибиотикам, устойчивость к дезинфицирующим средствам, серо- или фаготип, плазмидный профиль, адгезивную способность к эпителиальным клеткам (1 - 6).

Однако эти способы, основанные на определении и изучении только одного или двух свойств штамма, не позволяет диагностировать штамм как госпитальный с достаточной точностью.

Известен способ диагностики госпитального штамма Ps aeruginosa, включающий определение его серотипа и чувствительности к антибиотикам [3], который позволяет повысить точность диагностики.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ диагностики госпитального штамма Ps aeruginosa, который авторами выбран в качестве прототипа.

Известный способ основан на определении таких свойств штамма, как его чувствительность к антибиотикам и бактериофагам, и заключается в следующем: выделенную культуру от различных источников, которая соответствует Ps aeruginosa по следующим тестам: образование сине-зеленого пигмента (пиоцианина); наличие специфического запаха; подвижность в среде; рост при температуре 42^oC; ферментация нитратов до азота; положительный O/F тест; цитохромоксидаза положительная; дигидролиз аргинина.

Засевают культуру на питательную среду, накладывают на него 15 дисков, пропитанных различными антибиотиками, такими как стрептомицин, эритримицин, полимиксин, ампициллин, неомицин, ристомицин, фузидин, карбенициллин, оксациллин, цефалексин, линкомицин, олеандомицин, рифампицин. Воздействие осуществляют в течение 24 ч при температуре 37^oC, после чего анализируют полученные результаты. Затем на газон воздействуют различными жидкими бактериофагами в течение 24 ч при температуре 37^oC и регистрируют зону лизиса бактерий специфичным бактериофагом [4].

Диагностируют госпитальный штамм Ps aeruginosa при отсутствии чувствительности штамма к не менее 9-и антибиотикам и одинаковом фаготипе.

Точность диагностики Ps aeruginosa госпитального штамма при этом является невысокой, поскольку чувствительность к антибиотикам даже не госпитального штамма Ps aeruginosa велика.

Задачей предлагаемого способа является повышение точности диагностики госпитального штамма Ps aeruginosa.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе диагностики госпитального штамма Ps aeruginosa, включающем определение чувствительности штамма к антибиотикам и его фаготип, согласно изобретению, дополнительно определяет устойчивость штамма к дезинфицирующим средствам, его плазмидный профиль, серотип, адгезию к эпителиальным клеткам и диагностируют штаммы Ps aeruginosa как госпитальный при отсутствии чувствительности штамма к не менее 9-и антибиотикам, одинаковых фаго- и серотипе, устойчивости к не менее 5-и дезинфицирующим средствам, сходном плазмидном профиле и коэффициенте адгезии 15±0,2 и более.

Отличительными признаками является то, что дополнительное определяют устойчивость штамма к дезинфицирующим средствам, его плазмидный профиль, серотип, адгезию к эпителиальным клеткам и диагностируют штамм Ps aeruginosa как госпитальный, при отсутствии чувствительности штамма к не менее 9-и антибиотикам, одинаковых фаго- и серотипе, устойчивости штамма к не менее 5-и дезинфицирующим средствам, сходном плазмидном профиле и коэффициенте адгезии 15±0,2 и более.

Изучение таких свойств штамма Ps aeruginosa, как устойчивость к дезинфицирующим средствам, серотип, плазмидный профиль, адгезия к эпителиальным клеткам и оценка полученных результатов позволяет судить о штамме Ps aeruginosa как госпитальном большой точностью ≈100%, поскольку отсутствие чувствительности к не менее 9-ти антибиотикам, сходный плазмидный профиль, одинаковый серо- и фаготип, высокая устойчивость к не менее 5-и дезинфицирующим средствам, коэффициент адгезии 15±0,2 и более к эпителиальным клеткам появляются у штамма в результате селекции в больничных условиях.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Выделенную культуру от различных источников (из организма больного или персонала, а также окружающих предметов), которая соответствует по своим признакам штамму Ps aeruginosa, засевают газоном на питательную среду, накладывают 15 дисков, пропитанных различными антибиотиками, такими как стрептомицин, эритромицин, полимиксин, ампициллин, неомицин, ристомицин, фузидин, карбенициллин, левомицитин, гентамицин, оксациллин, цефалексин, линкомицин, олеандомицин, рифампицин. Воздействие осуществляют в течение 24 ч при температуре 37^oC, после чего оценивают полученные результаты. Затем на газон воздействуют различными бактериофагами в течение 24 ч при температуре 37^oC и регистрируют зону лизиса бактерий специфичным бактериофагом.

Изучение чувствительности выделенных культур Ps aeruginosa к дезинфектантам осуществляют путем воздействия нормированной экспозицией рабочих концентраций дезинфектанта на изучаемые штаммы. В качестве дезинфектантов применяют хлорную известь, хлорцин, монохлорамин, полисепт и перекись водорода в различных концентрациях. Готовят стандартную взвесь Ps aeruginosa, соответствующую 5 ед. стандарта мутности, и растворы дезинфектантов. После этого в стандартную взвесь вносят раствор дезинфектанта до концентрации рабочего разведения: хлорная известь 1% и 0,5%, хлорцин 1% и 0,5%, монохлорамин 1% и 0,5%, полисепт 1%, перекись водорода 3% и 6%. Высев производят на мясопептонный агар в чашки Петри и на среду обогащения (сахарный бульон) одномоментно, мерно, после 10, 15, 30 - минут воздействия дезинфектанта на стандартную взвесь. Учет результатов проводят через 24 ч по количеству выросших колоний на чашках Петри. Культуры считают чувствительными при отсутствии роста или при росте единичных колоний.

Для определения серотипа штамма на диагностируемый штамм воздействуют 13-ю групповыми и 27-ю факторными монорецепторными диагностическими "0" сыворотками в течение 30 мин при температуре 37^oC^o, после чего определяют серотип.

Плазмидный профиль штамма определяют с помощью электрофоретического метода выделения плазмидной ДНК на слабе Bio-Rad. Для этого предварительно промытый трисборатным буфером штамм вводят в агарозный гель, размеры которого 140х120х3,2 мм с 10-ю и 11-ю ячейками, затем вводят гель в литическую смесь, содержащую 10 мкл лизоцима, и покрывающую смесь, содержащую 0,8-1% агарозы. Электрофорез осуществляют при температуре 20^oC в течение 30 мин при напряжении 20 В, 150 мин при напряжении 120 В и силе тока 30 мА.

После проведения электрофореза гель окрашивают бромистым этидием и фотографируют в ультрафиолетовом свете, подаваемом коротковолновым излучателем - ультрахимоскопом "Хроматоскоп-М" на фотоаппарате "Зенит-ТТЛ", фотографическая плена РФ-3, чувствительность 1500 ед, экспозиция 3 мин. Определение молекулярного веса плазмид проводят графически с использованием тесторных плазмид-реперов.

Определение адгезивной способности культуры штамма осуществляют следующим образом: смешивают в разных объемах, предварительно 3 раза отмытые в фосфатном буфере взвесь эпителиоцитов и штамм Ps aeruginosa, и полученную смесь помещают в термостат, где ее выдерживают в течение 30 мин при температуре 37^oC при постоянном встряхивании. Полученную взвесь отмывают от несвязавшихся клеток центрифугированием и из осадка готовят мазки с окраской по Романовскому. Затем рассчитывают индекс адгезии.

Полученные результаты анализируют и диагностируют штамм Ps aeruginosa как госпитальный: при отсутствии чувствительности штамма к не менее 9-и антибиотикам, одинаковых фаго- и серотипе, устойчивости к не менее 5-и дезинфицирующим средствам, сходным плазмидном профиле, коэффициента адгезии к эпителиальным клеткам 15-0,2 и более.

Примеры конкретного исполнения предлагаемого способа.

Предлагаемый способ был использован для диагностики штамма Ps aeruginosa как госпитального в Нижегородской специализированной кардиохирургической больнице.

Для этого выделяли культуру от различных источников в отделении приобретенных пороков, отделении реанимации, операционном блоке, отделении врожденных пороков, которая по тестам соответствует штамму Ps aeruginosa.

Выделенную культуру засевали газоном на питательную среду, накладывали 15 дисков, пропитанных различными антибиотиками, такими как стрептомицин, эритримицин, полимиксин, ампициллин, неомицин, ристомицин, фузидин, карбенициллин, левомицетин, гентамицин, оксациллин, цефалексин, ленкомицин, олеандомицин, рифампицин. Воздействие осуществляли в течение 24 ч при температуре 37^oC, после чего оценивали полученные результаты. Затем на газон воздействовали различными бактериофагами в течение 24 ч при температуре 37^oC и регистрировали зону лизиса бактерий специфическим бактериофагом.

Изучение чувствительности выделенных культур Ps aeruginosa к дезинфектантам осуществляли путем воздействия нормированной экспозицией рабочих концентраций дезинфектанта на изучаемые штаммы. В качестве дезинфектантов применяли хлорную известь, хлорцин, монохлорами, полисепт и перекись водорода в различных концентрациях. Готовили стандартную взвесь Ps aeruginosa, соответствующую 5 ед. стандарта мутности, и растворы дезинфектантов. После этого в стандартную взвесь вносили раствор дезинфектанта до концентрации рабочего разведения: хлорная известь 1% и 0,5%, хлорцин 1% и 0,5%, монохлорамин 1% и 0,5%, полисепт 1%, перекись водорода 3% и 5%. Высев производили на мясопептонный агар в чашки Петри и на среду обогащения (сахарный бульон) одномоментно, мерно, после 10, 15, 30 мин воздействия дезинфектанта на стандартную взвесь. Учет результатов проводили через 24 ч по количеству выросших колоний на чашках Петри. Культуры считали чувствительными при отсутствии роста или при росте единичных колоний.

Для определения серотипа штамма на диагностируемый штамм воздействовали 13-ю групповыми и 27-ю факторными монорецепторными диагностическими "0" сыворотками в течение 30 мин при температуре 37^oC, после чего определяли серотип.

Плазмидный профиль штамма определяли с помощью электрофоретического метода выделения плазмидных ДНК на слабе Bio-Red модель 220. Для этого предварительно промытый трисборатным буфером штамм вводили в агарозный гель, размеры которого 140х120х3,2 мм с 10-ю и 11-ю ячейками, затем вводили в гель литическую смесь содержащую 10 мкл лизоцима и покрывающую смесь, содержащую 0,8-1.0% агарозы. Электрофорез осуществляли при температуре 20^oC в течение 30 мин при напряжении 20 В, 150 мин при напряжении 120 В и силе тока 30 мА.

После проведения электрофореза гель окрашивали бромистым этидием и фотографировали в ультрафиолетовом свете, подаваемом коротковолновым излучателем ультрахимоскопом "Хроматоскоп-М", на фотоаппарате "Зенит ТТЛ". Фотографическая пленка РФ-3, чувствительность 1500 ед., экспозиция 3 мин. Определение молекулярного веса плазмид проводили графически с использованием тесторных плазмид-реперов.

Определение адгезивной способности культуры штамма осуществляли следующим образом: смешивали в равных объемах, предварительно 3 раза отмытые в фосфатном буфере взвесь эпителиоцитов и штамм Ps aeruginosa и полученную смесь помещали в термостат, где ее выдерживали в течение 30 мин при температуре 37^oC при постоянном встряхивании. Полученную взвесь отмывали от несвязавшихся клеток центрифугированием и из осадка готовили мазки с окраской по Романовскому. Затем рассчитывали индекс адгезии.

Штамм Ps aeruginosa как госпитальный был диагностирован в отделении приобретенных пороков и отделении реанимации, поскольку в этих отделениях выделенная культура Ps aeruginosa была не чувствительна к 9-и антибиотикам, имела одинаковый фаго- и серотип, сходный плазмидный профиль и коэффициент адгезии к эпителиальным клеткам 15 - 0,2 и более, устойчива к 5-и дезинфицирующим средствам.

Полученные результаты хорошо согласуются с данными расследования вспышки заболеваний синегнойной инфекции в этих отделениях.

Как видно из полученных результатов, предлагаемый способ позволяет диагностировать госпитальный штамм Ps aeruginosa с точностью ≈ 100%.

Изобретение относится к области медицины, в частности к эпидемиологии, и может быть использовано при диагностике госпитального штамма синегнойной палочки. Способ включает определение чувствительности штамма к антибиотикам, его фаготипа и серотипа, устойчивости к дезинфицирующим веществам, плазмидный профиль, коэффициент адгезии к эпителиальным клеткам. Штамм Pseudomonas aeruginosa диагностируют как госпитальный при отсутствии его чувствительности к девяти и более антибиотикам, одинаковых фаго- и серотипа, устойчивости к пяти дезинфицирующим веществам, сходном плазмидном профиле и коэффициенте адгезии 15 ± 0,2 и более. Способ позволяет диагностировать штамм синегнойной палочки как госпитальный с точностью 100%.

Способ диагностики госпитального штамма синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa, включающий определение чувствительности штамма к антибиотикам и его фаготипа, отличающийся тем, что дополнительно определяют устойчивость штамма к дезинфицирующим веществам, его плазмидный профиль, серотип, адгезию к эпителиальным клеткам и диагностируют штамм синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa как госпитальный при отсутствии чувствительного штамма к не менее девяти антибиотикам, одинаковых фаго- и серотипа, устойчивости к не менее пяти дезинфицирующим веществам, сходном плазмидном профиле и коэффициенте адгезии 15 ± 0,2.