СПОСОБ ИНДИКАЦИИ ГОСПИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ ПО БИОРИТМАМ БАКТЕРИЙ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/48 C12Q1/04 

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологической лабораторной диагностике госпитальных инфекций.

Во многих странах отмечается рост внутрибольничных инфекций (ВБИ), вызываемых госпитальными штаммами, что связано с увеличением частоты оперативных и инвазивных лечебных и диагностических процедур, распространением в лечебных учреждениях штаммов микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью, изменением структуры популяции больных (Козлов Р.С. Нозокомиальные инфекции: эпидемиология, патогенез, профилактика, контроль. Клиническая микробиология, антимикробная химиотерапия. - 2000, №1. - С.16-30; Покровский В.И. Проблемы внутрибольничных инфекций. Эпидемиология и инфекционные болезни. - 1996. №2. - С.4-9).

Для диагностики госпитальных штаммов используют сложные методы идентификации микроорганизмов. Определяют род, вид, эковар, серовар, биовар, генотип, плазмидный профиль, коэффициент адгезии к эпителиальным клеткам, чувствительность к антибиотикам, устойчивость к дезинфицирующим веществам (Исхакова Х.И., Баженов Л.Г. Госпитальные штаммы ... в хирургической практике. «Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии». - 1991, №9. - С.27-29; Генералов И.И. Метод количественного определения гиалуронидазной активности стафилококков. «Клиническая лабораторная диагностика». - 1998, №3. - С.36-38; Шагинян И.А. «Роль и место молекулярно-генетических методов в ... анализе внутрибольничных инфекций». Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия». - 2000. - Т.2, №3. - С.82-93).

Лабораторные методы идентификации госпитальных штаммов требуют значительных материальных затрат на питательные среды и дорогостоящие реактивы. Длительность проведения исследований колеблется от 10 до 15 дней в зависимости от применяемых методик лабораторного исследования.

По данным литературы установлено, что изменение биоритмов бактерий связано с генотипами отдельных штаммов микроорганизмов. У пресноводных бактерий установлено наличие суточных биоритмов, обусловленных генотипом бактерий (Liu Y., Tsinoremas N.F., Johnson C.H. et al. Circadian orchestration of gene expression in cyanobacteria. Genes Dev. 1995. - Vol.9. - P.1469-1478; Liu Y., Tsinoremas N.F., Golden S.S. et al. Circadian expression of genes involved in the purine biosynthetic pathway of the cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7942. Mol. Microbiol. 1996. - Vol.20. - P.1071-1081; Ishiura M., Kutsuna S., Aoki T. et al. Expression of a gene cluster kaiABC as a circadian feedback process in Cyanobacteria. Science. - 1998. - Vol.281. - P.1519-1523; Kutsuna S., Kondo Т., Aoki S. et al. A period extender gene pex that extends the period of the circadian clock in the cyanobacterium Synecococcus. J. Bacteriol. 1998. - Vol.180. - P.2167-2174; Kondo Т., Ishiura M. The circadian clocks of plants and cyanobacteria. Trends PlantSci. 1999. - Vol.4. - P.171-176; Xu Y., Piston D, Johnson C.H. A biolumiscence resonance energy transfer (BRET) system-application to interacting circadian clock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol.95. - P.15-16).

Известен способ диагностики госпитальных штаммов (патент РФ на изобретение №2110579, опубл. 10.05.1998), выбранный в качестве прототипа. Способ включает диагностику госпитальных штаммов по резистентности к девяти и более антибиотикам, одинаковому фаго-серотипу, устойчивости к пяти дезинфицирующим веществам, плазмидному профилю и коэффициенту адгезии к эпителиальным клеткам 15±0,2.

Недостатками предложенного способа являются сложность его воспроизведения, необходимость приобретения дорогостоящих реактивов и длительность изучения выделенного штамма микроорганизма, что делает невозможным применение данного способа в микробиологических лабораториях практического здравоохранения.

Задачей настоящего изобретения является разработка нового, экономичного метода индикации госпитальных штаммов.

Технический результат - экономичный метод индикации госпитальных штаммов, основанный на свойствах генотипов госпитальных штаммов бактерий, обработанных гентамицином, сохранять свой суточный биоритм.

Технический результат способа индикации госпитальных штаммов по биоритмам бактерий, включающий выделение возбудителя инфекции, достигается тем, что согласно изобретению индикацию госпитальных штаммов проводят по совпадению биоритмов бактерий до и после обработки гентамицином, а биоритмы определяют по мезору, амплитудам репродуктивной активности и интегральному показателю хроноинфраструктуры бактерий, амплитуды репродуктивной активности бактерий определяют по формуле: A_nr=Aj·100%/M, где A_j - амплитуда определенной ультрадианной или циркадианной гармоники с периодами 8, 12 и 24 часа; М - мезор, а интегральный показатель хроноинфраструктуры бактерий определяют по средним показателям процентного отношения циркадианного ритма к ультрадианным гармоникам с периодами 12 и 8 часов по формуле: X_i=[∑(A_24r/A_12r+A_24r/A_8r)]/2, где X_i - интегральный показатель хроноинфраструктуры штамма; A_24r - процентное отношение амплитуды 24-ти часового ритма к мезору; А_12r - процентное отношение амплитуды 12-ти часового ритма к мезору; A_8r - процентное отношение амплитуды 8-ми часового ритма к мезору.

Негоспитальный штамм под влиянием гентамицина меняет биологические свойства, проявляющиеся в изменении хроноинфраструктуры биоритмов и снижении мезора. Использование гентамицина позволяет выявить у бактерий на генетическом уровне множественную лекарственную устойчивость к антимикробным препаратам.

Простой способ индикации госпитальных штаммов по биоритмам бактерий, для воспроизведения которого необходимо около 60 часов, простая питательная среда - питательный агар и использование несложных математических расчетов.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Проводим посев суточной культуры бактерий, выделенной от больного, в 8 пробирок со скошенным питательным агаром. Пробирки выдерживают в термостате при 37°С 12 часов, затем для прекращения размножения бактерий пробирки ставят в холодильник при +4°С. С помощью денситометра фирмы «Biomerie» готовят концентрацию микробной взвеси, равную 0,5 единицам по MF (Мак Фарланду), что соответствует 150 млн микробных клеток в 1 мл. Методом серийных разведений получают рабочую концентрацию микробной взвеси, соответствующую 3,75 тыс. КОЕ/мл (колонию образующая единица на 1 мл). Рабочую концентрацию микробной взвеси в количестве 0,1 мл вносят на поверхность питательного агара в 5 чашек Петри. Репродуктивную активность бактерий (общее число микробных клеток) определяют через каждые 3 часа в течение суток.

Для выявления влияния гентамицина на биоритмы бактерий в пробирку с рабочей концентрацией микробной взвеси вносят 2 бумажных диска с гентамицином (10 мкг в 1 мл) на 2 мин. Пробирку периодически встряхивают. Происходит растворение гентамицина в микробной взвеси. Затем микробную взвесь в количестве 0,1 мл вносят на поверхность питательного агара в 5 чашек Петри. Репродуктивную активность бактерий определяют через каждые 3 часа в течение суток по количеству выросших колоний.

По результатам определения количества выросших колоний на плотной питательной среде строят график и сравнивают исходные биоритмы бактерий с биоритмами после обработки бактерий гентамицином по мезору, амплитудам репродуктивной активности и интегральному показателю хроноинфраструктуры бактерий.

При совпадении биоритмов до и после обработки бактерий гентамицином выделенную культуру бактерии относят к госпитальному штамму.

Для анализа биоритмов бактерий использованы относительные параметры, не зависимые от значения мезора (М).

Расчет амплитуды проводят по формуле: A_nr=Aj·100%/M, где

A_j - амплитуда ультрадианной или циркадианной гармоники (j соответствует периоду 8, 12 и 24 часа);

М - мезор.

Анализ соотношения трех основных гармоник (особенности хроноинфраструктуры) проводят по средним показателям процентного отношения циркадианного ритма к ультрадианным гармоникам с периодом 12 и 8 часов по формуле: X_i=[∑(A_24r/A_12r+A_24r/A_8r)]/2, где

X_i - интегральный показатель хроноинфраструктуры штамма;

A_24r - процентное отношение амплитуды 24-ти часового ритма к мезору;

A_12r - процентное отношение амплитуды 12-ти часового ритма к мезору;

A_8r - процентное отношение амплитуды 8-ми часового ритма к мезору.

Исследования проводят в стандартных условиях получения временного ряда. Репродуктивную активность бактерий определяют через каждые 3 часа в течение суток. Получено 8 значений функций в равноудаленные моменты времени. В каждый момент времени получено 5 дискретных наблюдений, которые составляют 5 произвольных временных рядов. Для каждого из 5-ти временных рядов проведен расчет биоритмологических параметров.

Примеры конкретного использования предлагаемого способа

Пример 1

Согласно изобретению получены биоритмы негоспитального штамма культуры стафилококка американской коллекции типовых культур микроорганизмов АТСС №25923 (фиг.1). На фоне введения гентамицина у негоспитального штамма произошло снижение показателя мезора и изменился биоритм бактерий (фиг.2). Средние значения удельного отношения суточного ритма к ультрадианным гармоникам у негоспитального штамма отражены в таблице 1. Установлено, что различия в значениях интегрального показателя хроноинфраструктуры штамма до и после обработки гентамицином существенны (р<0,05 при доверительном интервале 95%). Амплитуды репродуктивной активности штамма до (фиг.7) и после обработки гентамицином (фиг.8) существенно отличались по циркадианной и ультрадианным гармоникам. По биоритмам бактерий до и после обработки бактерий гентамицином установлено, что данный штамм бактерий - негоспитальный.

Пример 2

От больного, находящегося на лечении в областной клинической больнице (ОКБ) г. Тюмени, выделена культура стафилококка Staphylococcus aureus №1, идентифицированная в бактериологической лаборатории ОКБ г.Тюмени как госпитальный штамм.

Согласно изобретению получены биоритмологические параметры выделенной культуры бактерий. На фиг.3 представлена динамика суточной репродуктивной активности S.aureus №1, а на фиг.4 - репродуктивная активность этого же штамма после обработки гентамицином. Отмечено незначительное снижение мезора. Амплитуды репродуктивной активности штамма до (фиг.5) и после обработки гентамицином (фиг.6) не изменились. Различия в значениях интегрального показателя хроноинфраструктуры штамма до и после обработки гентамицином (таблица 1) несущественны (р>0,05 при доверительном интервале 95%).

Таким образом установлено, что гентамицин не оказывал влияния на биоритмы бактерий. Следовательно, данный штамм бактерий - госпитальный.

Итак, установлена возможность использования гентамицина для индикации госпитальных штаммов по биоритмам бактерий.

Выявлена генетически обусловленная стабильность биоритмов у госпитальных штаммов до и после обработки бактерий гентамицином.

Исследования проведены на базе бактериологической лаборатории ГОУ ВПО Тюменской государственной медицинской академии Минздрава России.

Результаты исследований легко воспроизводимы, не требуют больших материальных затрат, расчеты показателей биоритмов несложны, высоко специфичны и позволяют с высокой точностью выявлять госпитальные штаммы. Предложенный способ индикации госпитальных штаммов позволяет выявлять госпитальные штаммы с точностью 100%.

Таблица 1.
Вариабельность количества микробных клеток у штаммов S. aureus, выраженная в средних значениях показателя удельного отношения суточного ритма к ультрадианным гармоникам с периодами 12 и 8 часов до и после введения гентамицина.Штаммы микроорганизмовХ[∑(A₂₄%/A₁₂%+A₂₄%/A₈%)/2][95% дов. инт.]Негоспитальные до3.36[2.67; 4.15]штаммыпосле0.96[0.62; 1.30]^*Госпитальные до1.94[1.69; 2.19]штаммыпосле3.02[1.13; 5.91]^* Р<0.05 (различия между штаммами до и после введения гентамицина статистически достоверны)

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологической лабораторной диагностике госпитальных инфекций. Способ основан на свойствах генотипов госпитальных штаммов бактерий, обработанных гентамицином, сохранять свой суточный биоритм. Анализ биоритмов бактерий проводят по мезору, амплитудам репродуктивной активности и интегральному показателю хроноинфраструктуры бактерий. Способ обеспечивает простоту воспроизведения, точность диагностики. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 8 ил.

1. Способ индикации госпитальных штаммов по биоритмам бактерий, включающий выделение возбудителя инфекции, отличающийся тем, что индикацию госпитальных штаммов проводят по совпадению биоритмов бактерий до и после обработки гентамицином, а биоритмы определяют по мезору, амплитудам репродуктивной активности и интегральному показателю хроноинфраструктуры бактерий.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что амплитуды репродуктивной активности бактерий определяют по формуле

A_nr=A_j·100%/М,

где A_j - амплитуда определенной ультрадианной или циркадианной гармоники с периодами 8, 12 и 24 ч;

М - мезор.

X_i=[∑(A_24r/A_12r+A_24r/A_8r)]/2,

где X_i - интегральный показатель хроноинфраструктуры штамма;

А_24r - процентное отношение амплитуды 24-часового ритма к мезору;

A_12r - процентное отношение амплитуды 12-часового ритма к мезору;

A_8r - процентное отношение амплитуды 8-часового ритма к мезору.