СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГОСПИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/48 C12Q1/04 

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологической лабораторной диагностике госпитальных инфекций.

В Российской Федерации ежегодно регистрируется около 2,5 млн. больных с внутрибольничными инфекциями. В лечебных учреждениях создаются благоприятные условия для селекции госпитальных штаммов микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью к антибиотикам, химиотерапевтическим препаратам и антисептикам.

В микробиологической лабораторной диагностике госпитальных штаммов используют сложные методы по идентификации микроорганизмов до рода, вида и устанавливают внутривидовые отличия бактерий. Проводится определение эковара, серовара, биовара, генотипа госпитального штамма, плазмидного профиля, коэффициента адгезии к эпителиальным клеткам, чувствительности к антибиотикам, устойчивости к дезинфицирующим веществам (Исхакова Х.И., Баженов Л.Г. Госпитальные штаммы ... в хирургической практике. «Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии». - 1991, №9. - С.27-29; Генералов И.И. Метод количественного определения гиалуронидазной активности стафилококков. «Клиническая лабораторная диагностика». - 1998, №3. - С.36-38; Шагинян И.А. Роль и место молекулярно-генетических методов в... анализе внутрибольничных инфекций. «Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия». - 2000. - Т.2, №3. - С.82-93).

Лабораторные методы идентификации госпитальных штаммов требуют значительных материальных затрат и длительного времени (до 15 дней) на проведение лабораторных исследований.

В периодической литературе имеются сообщения о том, что биоритмы бактерий обусловлены генотипом отдельных штаммов микроорганизмов. Так, у штаммов пресноводных бактерий на генетическом уровне установлено наличие суточных биоритмов (Liu Y., Tsinoremas N.F., Johnson C.H. et al. Circadian orchestration of gene expression in cyanobacteria. Genes Dev. 1995. - Vol.9. - P.1469-1478; Liu Y., Tsinoremas N.F., Golden S.S. et al. Circadian expression of genes involved in the purine biosynthetic pathway of the cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7942. Mol. Microbiol. 1996. - Vol.20. - P.1071-1081; Ishiura M., Kutsuna S., Aoki T. et al. Expression of a gene cluster kaiABC as a circadian feedback process in Cyanobacteria. Science. - 1998. - Vol.281. - P.1519-1523; Kutsuna S., Kondo Т., Aoki S. et al. A period extender gene pex that extends the period of the circadian clock in the cyanobacterium Synecococcus. J. Bacteriol. 1998. - Vol.180. - P.2167-2174; Kondo Т., Ishiura M. The circadian clocks of plants and cyanobacteria. Trends Plant. Sci. 1999. - Vol.4. - P.171-176; Xu Y., Piston D., Johnson C.H. A biolumiscence resonance energy transfer (BRET) system-application to interacting circadian clock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol.95. - P.15-16).

Известен способ диагностики госпитальных штаммов (патент РФ на изобретение №2110579, опубл. 10.05.1998), выбранный в качестве прототипа. Способ включает диагностику госпитальных штаммов по резистентности к девяти и более антибиотикам, одинаковому фаго-серотипу, устойчивости к пяти дезинфицирующим веществам, плазмидному профилю и коэффициенту адгезии к эпителиальным клеткам 15±0,2 и более.

Недостатками предложенного способа является сложность его воспроизведения, необходимость приобретения дорогостоящих реактивов и длительность изучения выделенного штамма микроорганизма, что делает практически невозможным применение данного способа в микробиологических лабораториях практического здравоохранения.

Задачей настоящего изобретения является разработка нового, простого, не требующего больших материальных затрат метода диагностики госпитальных штаммов.

Технический результат - простой, не требующий больших материальных затрат способ, основанный на свойствах генотипов популяций бактерий обладать определенным суточным биоритмом.

Технический результат достигается тем, что в способе диагностики госпитальных штаммов, включающий выделение возбудителя инфекции, согласно изобретению госпитальный штамм диагностируют по отсутствию совпадения хроноинфраструктуры биоритмов с эталонными биоритмами бактерий по периоду репродуктивной активности, частоте ритма, мезору (статистическая срединная ритма полезного сигнала), амплитуде (величина наибольшего отклонения полезного сигнала от мезора) репродуктивной активности и акрофазе (момент времени, соответствующий регистрации максимального значения полезного сигнала), а определение хроноинфраструктуры штаммов проводят по средним показателям процентного отношения циркадианного ритма (биологический ритм с частотой 1 цикла в 24±4 часа) к ультрадианным гармоникам (биологические колебания с периодом короче 20 часов) с периодом 12 и 8 часов по формуле: X_i=[∑(A_24r/A_12r+A_24r/A_8r)]/2, где X_i - интегральный показатель хроноинфраструктуры штамма; A_24r - процентное отношение амплитуды 24-часового ритма к мезору; A_12r - процентное отношение амплитуды 12-часового ритма к мезору; A_8r - процентное отношение амплитуды 8-часового ритма к мезору; расчет амплитуды репродуктивной активности штаммов проводят по формуле: A_nr=A_j•100%/М, где A_j - амплитуда определенной ультрадианной или циркадианной гармоники; М - мезор.

Простой, экономичный способ, для воспроизведения которого необходимо около 60 часов, дешевая питательная среда - питательный агар и не сложные математические расчеты. Для определения концентрации микробной взвеси можно использовать стандарты мутности.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Проводим посев суточной культуры бактерий, выделенной от больного, в 8 пробирок со скошенным питательным агаром. Пробирки выдерживают в термостате при 37°С 12 часов, затем для прекращения размножения бактерий пробирки ставят в холодильник при +4°С. Репродуктивную активность бактерий (общее число микробных клеток) определяют через каждые 3 часа в течение суток. Для этого с помощью денситометра фирмы «Biomerie» готовят концентрацию микробной взвеси, равную 0,5 единиц по MF (Мак Фарланду), что соответствует 150 млн. микробных клеток в 1 мл. Методом серийных разведений готовят концентрацию бактерий, соответствующую 1,5 тыс. КОЕ/мл (колонию образующая единица на 1 мл), что соответствует рабочей дозе микробной взвеси. Рабочую дозу микробной взвеси в количестве 0,1 мл вносят на поверхность питательного агара в 5 чашек Петри и в течение 24 часов через каждые 3 часа проводят учет количества выросших колоний.

По результатам количественного определения микробов на плотной питательной среде строят график и сравнивают циркадианный ритм и ультрадианные гармоники с периодом 12 и 8 часов по мезору (М), амплитуде и акрорфазе.

При несовпадении биоритма выделенного штамма с биоритмом эталонных негоспитальных штаммов данного вида бактерий выделенную культуру бактерии от больного относят к госпитальному штамму.

Для анализа биоритмов бактерий использованы относительные параметры, независимые от значения показателя М.

Расчет амплитуды проводят по формуле: A_nr=A_j•100%/M, где

A_j - амплитуда ультрадианной или циркадианной гармоники (j=8 ч, 12 ч, 24 ч);

М - мезор.

Анализ соотношения трех основных гармоник (особенности хроноинфраструктуры) проводят по средним показателям процентного отношения циркадианного ритма к ультрадианным гармоникам с периодом 12 и 8 часов по формуле: X_i=[∑(A_24r/A_12r+A_24r/A_8r)/2, где

X_i - интегральный показатель хроноинфраструктуры штамма;

А_24r - процентное отношение амплитуды 24-часового ритма к мезору;

A_12r - процентное отношение амплитуды 12-часового ритма к мезору;

А_8r - процентное отношение амплитуды 8-часового ритма к мезору.

Примеры конкретного использования предлагаемого способа

Пример 1

В качестве эталонных негоспитальных штаммов взято 2 культуры стафилококка американской коллекции типовых культур микроорганизмов (АТСС №25923 и 209-М).

От больных, находящихся на лечении в областной клинической больнице (ОКБ) г.Тюмени, выделена культура стафилококка Staphylococcus aureus №1, идентифицированная в бактериологической лаборатории ОКБ г.Тюмени как госпитальный штамм.

При проведении исследований соблюдались стандартные условия получения временного ряда. Определение количества микробных клеток проводили в течение 24 часов с интервалом между наблюдениями, равным 3 часам. Было получено 8 значений функций в равноудаленные моменты времени. В каждый момент времени получено 5 дискретных наблюдений, которые составили 5 произвольных временных рядов. Для каждого из 5 временных рядов проведен расчет биоритмологических параметров.

На фиг.1 представлена динамика суточной репродуктивной активности двух эталонных негоспитальных штаммов S.aureus, а на фиг.2 - госпитального штамма S.aureus 1. Полученные диаграммы свидетельствуют, что биоритмы эталонных негоспитальных штаммов имеют отличия от биоритмов госпитального штамма S.aureus №1.

Циркадианный ритм и ультрадианные гармоники с периодом 12 и 8 часов также имели существенные отличия у госпитального штамма S. aureus №1 и двух негоспитальных штаммов (фиг.5, 6). В таблице 1 дана характеристика этих штаммов по мезору, амплитуде и акрофазе. У негоспитальных эталонных штаммов выявлено наличие всех трех ритмов, а у госпитального штамма S.aureus №1 отмечалась только 8-часовая ритмичность. Вариабельность количества микробных клеток, выраженных в средних показателях удельного соотношения суточного ритма к ультрадианным гармоникам с периодами 12 и 8 часов, составила 1,37±0,31 и 0,49±0,04 соответственно при доверительном интервале 95% (таблица 2).

Пример 2

По методике предложенного способа проведен анализ биоритмов госпитального штамма S.aureus №2. Характеристики биоритмов данного штамма представлены на фиг.3, 7, таблице 1. Данный госпитальный штамм обладал только 24-часовой ритмичностью. Вариабельность количества микробных клеток, выраженная в средних показателях удельного соотношения суточного ритма к ультрадианным гармоникам с периодами 12 и 8 часов, составила 13,51±9,66 при доверительном интервале 95% (таблица 2).

Пример 3

По методике предложенного способа проведен анализ биоритмов госпитального штамма S.aureus №3. Характеристики биоритмов данного штамма представлены на фиг.4, 8, таблице 1. У штамма отмечена 12- и 8-часовая ритмичность. В отличие от эталонных негоспитальных штаммов, у S.aureus №3 не выявлено 24-часовой ритмичности. Интегральный показатель удельного соотношения суточного ритма к ультрадианным гармоникам с периодами 12 и 8 часов при доверительном интервале 95% составил 0,23±0,15 (таблица 2).

На конкретных примерах использования предложенного способа показана возможность применения данного способа для диагностики госпитальных штаммов. Несоответствие биоритмов выделенного штамма от больного биоритмам эталонного негоспитального штамма позволяет отнести выделенный штамм - к госпитальному. Исследования проведены на базе бактериологической лаборатории ГОУ ВПО Тюменской государственной медицинской академии Минздрава России. Всего проведено 800 измерений в четырехсуточных экспериментах.

Результаты исследований легко воспроизводимы, не требуют больших материальных затрат, расчеты показателей биоритмов не сложны и на проведение диагностики госпитального штамма необходимо не более 60 часов. Предложенный способ диагностики госпитальных штаммов позволяет диагностировать госпитальные штаммы с точностью 100%.

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологической лабораторной диагностике. Способ включает определение биоритмов бактерий, выделенных от больных, и сравнение полученных биоритмов с биоритмами эталонных негоспитальных штаммов данного вида бактерий, рассчеты проводят по формулам. Анализ биоритмов проводят по периоду репродуктивной активности бактерий, частоте ритма, мезору, амплитуде репродуктивной активности бактерий и акрофазе. При несовпадении биоритмов выделенного штамма бактерий с биоритмами эталонного негоспитального штамма выделенный штамм относят к госпитальному. Способ обеспечивает простоту и точность диагностики госпитальных штаммов. 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 8 ил.

1. Способ диагностики госпитальных штаммов включает выделение возбудителя инфекции, отличающийся тем, что госпитальный штамм диагностируют по отсутствию совпадения хроноинфраструктуры биоритмов с эталонными биоритмами бактерий по периоду репродуктивной активности, частоте ритма, мезору, амплитуде репродуктивной активности и акрофазе.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что определение хроноинфраструктуры штаммов проводят по средним показателям процентного отношения циркадианного ритма к ультрадианным гармоникам с периодом 12 и 8 ч по формуле

X_i=[∑(A_24r/А_12r+A_24r/A_8r/2],

где X_i - интегральный показатель хроноинфраструктуры штамма;

А_24r - процентное отношение амплитуды 24-часового ритма к мезору;

A_12r - процентное отношение амплитуды 12-часового ритма к мезору;

A_8r - процентное отношение амплитуды 8-часового ритма к мезору.

A_nr=A_j•100%/М,

где A_j - амплитуда определенной ультрадианной или циркадианной гармоники;

М - мезор.