СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К ДЕЗИНФИЦИРУЮЩЕМУ СРЕДСТВУ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2010 года по МПК C12N1/00 C12Q1/00 

Изобретение относится к медицине, а именно эпидемиологии, микробиологии, дезинфектологии, и может использоваться для оценки чувствительности (устойчивости) микроорганизмов к дезинфектантам.

Разработка предлагаемого изобретения вызвана необходимостью создания упрощенных методов определения чувствительности (устойчивости) микроорганизмов к дезинфицирующим средствам, доступных для проведения в бактериологических лабораториях ЛПУ и ФГУЗов. Актуальность данного изобретения заключается в необходимости проведения исследований культур микроорганизмов, выделенных от пациентов, из объектов внешней среды стационаров, включая госпитальные штаммы, и очагов инфекционных заболеваний на чувствительность к дезсредствам. Изучение чувствительности (устойчивости) микробной флоры к дезинфицирующим средствам является одним из важнейших этапов характеристики госпитальных и внегоспитальных штаммов. Формирование резистентности к применяемым дезинфектантам среди госпитальной микрофлоры представляет одну из серьезных проблем практического здравоохранения. В медицинской литературе последних лет неоднократно описывались случаи недостаточной эффективности применения дезинфицирующих средств, вследствие чего патогенная микрофлора имела возможность не только сохраняться длительное время на объектах внешней среды, но даже накапливаться в готовых дезрастворах, что резко снижает эффективность проводимых противоэпидемических мероприятий и способствует поддержанию высокого уровня заболеваемости. Определение чувствительности (устойчивости) необходимо для оптимизации дезинфекционного режима и своевременной смены дезинфектантов на более эффективные в отношении резистентной микрофлоры.

В настоящее время для оценки чувствительности микроорганизмов к дезинфектантам используется, например, метод ускоренного определения устойчивости бактерий к дезинфицирующим средствам (Методические рекомендации по ускоренному определению устойчивости бактерий к дезинфекционным средствам. Утверждены руководителем департамента госсанэпиднадзора Минздрава России А.А. Монисовым 10.01.2000 г. за №1100-26-0-117).

Способ основан на применении цветной питательной среды, изменяющей цвет под влиянием жизнедеятельности размножающихся бактерий. Эффективные концентрации дезинфектанта предотвращают накопление бактерий и сохраняют цвет среды.

Данный аналог обладает рядом недостатков:

- рекомендуемая специальная цветная питательная среда отсутствует в продаже, а рецептура не представлена в методических рекомендациях;

- необходимость предварительного тестирования культур микроорганизмов на возможность применения описанного способа определения устойчивости;

- данный метод не позволяет ограничивать время воздействия дезинфицирующего средства (экспозицию);

- возможность искажения цвета питательной среды под действием дезинфектантов;

- невозможность использования дополнительного учетного признака - помутнения среды - для оценки результатов применения тех дезинфекционных препаратов, которые при добавлении к цветной питательной среде образуют выраженную опалесценцию;

- субъективность оценки и интерпретации полученных результатов (визуальная оценка изменения цвета, помутнения питательной среды);

- необходимость использования специальной аппаратуры (аппаратов типа Multiscan) для объективной оценки результатов;

- невозможность количественной оценки результатов (метод является качественным, а не количественным);

- невозможность оценки степени чувствительности (устойчивости) изучаемых микроорганизмов к дезинфектантам (определение только минимальной дезинфицирующей концентрации);

- сложность/невозможность выделения и идентификации культур микроорганизмов, устойчивых к дезинфектантам, выросших на питательной среде после воздействия дезсредства (несоответствие такому требованию как культивирование на твердых питательных средах), и как следствие, - отсутствие качественного контроля выросших культур микроорганизмов;

- сложность широкого внедрения данного способа в практическую деятельность бактериологических лабораторий;

- трудоемкость и дороговизна исследования.

Известна также «Методика определения и показатели чувствительности (устойчивости) бактерий к дезинфектантам» (Красильников А.П., Змушко Л.С., Адарченко А.А. // Дезинфекция и стерилизация: Перспективы развития. - Волгоград, 1983. - с.61-63).

Методика основана на определении эффективности дезинфекции носителей (штифтов штампа-репликатора), контаминированных взвесями испытуемых культур микроорганизмов, путем их последовательного погружения в растворы дезинфектантов и нейтрализаторов и высеве на твердые питательные среды посредством прижатия концевых площадок штифтов к поверхности среды на бактериологических чашках. Оценка результатов производится по наличию или отсутствию роста бактерий в зонах посевов-отпечатков. К недостаткам данной методики можно отнести:

- невозможность обеспечения осаждения на поверхности штифтов стандартного количества микроорганизмов из бактериальной взвеси в связи с различной адгезивной способностью микроорганизмов;

- высушивание бактериальной взвеси на поверхности штифтов может привести к частичной или полной гибели микроорганизмов;

- возможность частичного или полного смывания микроорганизмов с поверхности штифтов при погружении в растворы дезинфектантов и нейтрализаторов;

- все вышеперечисленное ведет к невозможности количественного мерного высева бактерий на питательные среды;

- предлагаемое в методике время воздействия дезинфектантов на испытуемые бактериальные культуры (10 минут) не учитывает рекомендуемых для дезинфекции экспозиций;

- невозможность одновременного тестирования нескольких дезинфицирующих средств с различными рекомендованными режимами дезинфекции;

- невозможность оценки степени чувствительности, отсутствие градации результатов исследования;

- во время исследования компоненты находятся в различном состоянии (испытуемые микроорганизмы - в высушенном виде, а дезинфицирующие средства - в растворе), что может сказываться на качестве полученных результатов, так как действие дезинфектантов на микрофлору в растворе и на поверхности проявляется по-разному;

- трудоемкость методики, необходимость специального оборудования (штампы-репликаторы из нержавеющей стали с 50 штифтами; опорные кольца для высушивания контаминированных репликаторов), проведение исследований в асептическом помещении и, как следствие, сложность внедрения в повседневную деятельность ЛПУ.

В задачу предлагаемого изобретения положено упрощение способа при одновременном снижении риска гибели микроорганизмов, а также обеспечение возможности количественной оценки чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующим средствам.

Поставленная цель достигается в результате 2-х вариантов предлагаемого способа определения чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующему средству: вариант №1 - при действии средства в растворе, вариант №2 - при действии средства на поверхности. Поставленная цель в способе по варианту №1 достигается тем, что взвесь культуры микроорганизма готовят по стандарту мутности 5 Ед, затем 0,1 мл этой взвеси смешивают в пробирке с 0,9 мл дезинфицирующего средства и проводят экспозицию полученной смеси в течение времени, известного для данного дезинфицирующего средства, как время, необходимое для проявления дезинфицирующего эффекта, затем добавляют 0,5 мл нейтрализатора, берут 0,1 мл полученной смеси и высевают на твердую питательную среду, о чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующему средству судят при росте микроорганизмов на питательной среде до 300 КОЕ/мл, при этом, при росте до 100 КОЕ/мл судят о неполном бактерицидном действии, при росте 100-300 КОЕ/мл - о суббактерицидном действии, при росте более 300 КОЕ/мл - об устойчивости микроорганизмов к дезинфицирующему средству.

Поставленная цель в способе по варианту №2 достигается тем, что взвесь культуры микроорганизма готовят по стандарту мутности 5 Ед, затем 0,1 мл этой взвеси наносят на стерильную поверхность тест-объекта площадью 10×10 см и распределяют стерильным шпателем по всей площади квадрата, после подсыхания микробной взвеси на поверхность наносят 0,9 мл дезинфицирующего средства и распределяют по поверхности квадрата стерильным шпателем, проводят экспозицию полученной смеси в течение времени, известного для данного дезинфицирующего средства, как время, необходимое для проявления дезинфицирующего эффекта, затем на поверхность тест-объекта наносят 0,5 мл нейтрализатора дезинфицирующего средства и после экспозиции нейтрализатора смывают смесь с поверхности тест-объекта стерильным тампоном, этим же тампоном сразу проводят высев 0,1 мл смеси на твердую питательную среду, о чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующему средству судят при росте микроорганизмов на питательной среде до 300 КОЕ/мл, при этом, при росте до 100 КОЕ/мл судят о неполном бактерицидном действии, при росте 100-300 КОЕ/мл - о суббактерицидном действии, при росте более 300 КОЕ/мл - об устойчивости микроорганизмов к дезинфицирующему средству. Необходимость использования определения количественных отличительных признаков в предлагаемых способах обеспечивает возможность количественной оценки чувствительности. Это обосновано следующими проведенными авторами расчетами.

Готовится взвесь микроорганизмов по стандарту мутности 5 Ед (это значит, что в 1 мл взвеси содержится 5×10⁸ микробных клеток), берется 0,1 мл такой взвеси (в данном объеме содержится 5×10⁷ микробных клеток). Далее к микробной взвеси добавляется 0,9 мл дезинфицирующего средства (таким образом, общий объем смеси составляет 1 мл и содержит 5×10⁷ микробных клеток). Добавляется 0,5 мл нейтрализатора (таким образом, общий объем смеси составляет уже 1,5 мл и содержит 5×10⁷ микробных клеток).

Из полученной смеси объемом 1,5 мл берется 0,1 мл (для высева на питательную среду). В этом объеме (0,1 мл) содержится в 15 раз меньше микробных клеток, чем в 1,5 мл (т.е. 0,3×10⁷ - это количество мы высеваем на питательную среду).

Дезинфицирующее средство считается эффективным, если убивает 99,99% микроорганизмов (в соответствии с «Методами испытаний дезинфекционных средств для оценки их безопасности и эффективности», разработанными НИИ дезинфектологии Минздрава России, утвержденными Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Москва, 1998 г.), таким образом, допускается рост 0,01% микроорганизмов. Для этого мы рассчитали, сколько микроорганизмов выжило из тех, что мы высеяли на питательную среду:

0,3×10⁷ - 100%

х - 0,01%

;

Х=300 КОЕ

Таким образом, допускается рост до 300 КОЕ. Поэтому при росте микроорганизмов после действия дезинфектанта до 300 КОЕ мы говорим о чувствительности к данному дезинфицирующему средству, рост более 300 КОЕ - об устойчивости.

Тем не менее, мы не можем не учитывать рост менее 300 КОЕ, проведен ряд клинических испытаний, которые доказали, что наличие такого роста является одним из этапов формирования устойчивости микроорганизмов к дезинфицирующим средствам.

Предлагаемый способ по варианту №1 осуществляют следующим образом.

I. Приготовление бактериальной взвеси

1. Культуры микроорганизмов*, выращенные на плотной питательной среде при температуре 37°С в течение 18-24 часов, смыть 0,9% стерильным изотоническим раствором хлорида натрия.

2. Микробные взвеси каждого вида довести до 5 единиц (5×10⁸) по стандарту мутности для оптической стандартизации бактерий (ГИСК им. Тарасевича Л.А.).

II. Приготовление растворов дезинфектантов

1. Растворы готовятся по активно-действующему веществу на стерильной дистиллированной воде.

2. Дезинфицирующие средства (ДС) периодически подвергаются исследованиям на активность действующего вещества.

III. Проведение исследования

1. Растворы дезинфектантов (0,9 мл) разлить в стерильные пробирки с резиновой пробкой.

2. В пробирки с растворами дезинфектантов вносят по 0,1 мл микробной взвеси и перемешивают встряхиванием несколько секунд.

3. После действия дезинфектанта в указанной в методических рекомендациях по использованию препарата (или необходимой для эксперимента) экспозиции, вносят по 0,5 мл раствора нейтрализатора** и перемешивают встряхиванием.

4. Высевают на твердую питательную среду (МПА) по 0,1 мл смеси.

5. Параллельно с проведением опыта ставят контроли:

1) Контроль жизнеспособности микроорганизма

2) Контроль дезинфектанта без добавления культуры

3) Контроль полноты нейтрализации дезинфектанта

IV. Учет результатов

Учет результатов производят через 24 часа по количеству выросших на чашке Петри колоний. При отсутствии роста чашки оставляют в термостате до 2 суток. Выросшие колонии подвергают микроскопии.

V. Оценка результатов

Культуры считают чувствительными при отсутствии роста или при росте не более 300 КОЕ/мл, что соответствует требуемой эффективности ДС (под действием дезинфицирующего средства гибнет 99,99% микроорганизмов).

1. При росте менее 300 КОЕ/мл штамм считается чувствительным: чувствительные культуры оценивают по степени чувствительности:

1) полная чувствительность - при отсутствии роста;

2) неполная чувствительность - при наличии роста:

100-300 КОЕ/мл - дезинфектант оказывает суббактерицидное действие;

до 100 КОЕ/мл - неполное бактерицидное действие.

2. Штамм устойчив к данному дезинфектанту в изучаемом режиме при росте 300 КОЕ/мл и более.

Кратность постановки эксперимента должна быть не менее трех (при условии получения однотипных результатов). При необходимости статистической обработки - не менее восьми.

*исследуются культуры микроорганизмов, выделенные из клинического материала, объектов внешней среды, тест-микроорганизмы (E.coli шт. 1257, S.aureus шт.906)

**для нейтрализации антимикробного действия дезинфицирующих средств из различных химических групп применяют следующие нейтрализаторы:

- для средств из группы окислителей (галоидсодержащие, окислители, средства, содержащие надуксусную кислоту, озон) - 0,5-1% растворы тиосульфата натрия;

- для альдегид- и фенолсодержащих средств - воду; универсальный нейтрализатор, содержащий твин-80 - 3%, сапонин - 3%, гистидин - 0,1% и цистеин - 0,1%;

- для катионных поверхностно-активных веществ - 0,1-1,0% растворы сульфонола или 0,5-1,0% растворы сольфонола с 10% обезжиренного молока.

Предлагаемый способ по варианту №2 осуществляют следующим образом.

I. Приготовление бактериальной взвеси

3. Культуры микроорганизмов*, выращенные на плотной питательной среде при температуре 37°С в течение 18-24 часов, смыть 0,9% стерильным изотоническим раствором хлорида натрия.

4. Микробные взвеси каждого вида довести до 5 единиц (5×10⁸) по стандарту мутности для оптической стандартизации бактерий (ГИСК им. Тарасевича Л.А.).

II. Приготовление растворов дезинфектантов

3. Растворы готовятся по активно-действующему веществу на стерильной дистиллированной воде.

4. Дезинфицирующие средства (ДС) периодически подвергаются исследованиям на активность действующего вещества.

III. Проведение исследования

6. На стерильную поверхность тест-объекта ** площадью 10×10 см мерно наносится микробная взвесь в количестве 0,1 мл и распределяется стерильным шпателем по всей площади квадрата.

7. После подсыхания микробной взвеси на поверхность мерно наносится 0,9 мл раствора дезинфектанта и распределяется по поверхности квадрата стерильным шпателем. Дезинфектант применяется в концентрациях, указанных в методических рекомендациях по использованию средства (или необходимых для эксперимента).

8. После воздействия дезинфектанта в требуемой экспозиции, на тест-объекты мерно наносится по 0,5 мл нейтрализатора*** и равномерно растирается по поверхности. Экспозиция дезинфектанта определяется, исходя из методических рекомендаций или целей эксперимента. Экспозиция нейтрализатора - стандартная.

9. Смыв производится стерильным тампоном с поверхности тест-объекта.

10. Высев на чашки с питательной средой производится сразу этим же тампоном (по 0,1 мл).

11. Параллельно с проведением опыта ставят контроли:

1) Контроль жизнеспособности микроорганизма

2) Контроль контаминации тест-объекта

3) Контроль стерильности тест-объекта

4) Контроль дезинфектанта без добавления культуры

5) Контроль полноты нейтрализации дезинфектанта

IV. Учет результатов

Учет результатов производят через 24 часа по количеству выросших на чашке Петри колоний. При отсутствии роста чашки оставляют в термостате до 2 суток.

Выросшие колонии подвергают микроскопии.

V. Оценка результатов

Культуры считают чувствительными при отсутствии роста или при росте не более 300 КОЕ/мл, что соответствует требуемой эффективности ДС (под действием дезинфицирующего средства гибнет 99,99% микроорганизмов).

2. При росте менее 300 КОЕ/мл штамм считается чувствительным: чувствительные культуры оценивают по степени чувствительности:

1) полная чувствительность - при отсутствии роста;

2) неполная чувствительность - при наличии роста:

100-300 КОЕ/мл - дезинфектант оказывает суббактерицидное действие;

до 100 КОЕ/мл - неполное бактерицидное действие.

3. Штамм устойчив к данному дезинфектанту в изучаемом режиме при росте 300 КОЕ/мл и более.

Кратность постановки эксперимента должна быть не менее трех (при условии получения однотипных результатов). При необходимости статистической обработки - не менее восьми.

*исследуются культуры микроорганизмов, выделенные из клинического материала, объектов внешней среды, тест-микроорганизмы (E.coli шт.1257, S.aureus шт.906)

**в качестве тест-объектов можно использовать металлические поверхности, клеенку, пластик, керамическую плитку, деревянные поверхности, окрашенные красками и т.д.

***для нейтрализации антимикробного действия дезинфицирующих средств из различных химических групп применяют следующие нейтрализаторы:

- для средств из группы окислителей (галоидсодержащие, окислители, средства, содержащие надуксусную кислоту, озон) - 0,5-1% растворы тиосульфата натрия;

- для альдегид- и фенолсодержащих средств - воду; универсальный нейтрализатор, содержащий твин-80 - 3%, сапонин - 3%, гистидин - 0,1% и цистеин - 0,1%;

- для катионных поверхностно-активных веществ - 0,1-1,0% растворы сульфонола или 0,5-1,0% растворы сольфонола с 10% обезжиренного молока.

Следует отметить, что существенным является порядок распределения нейтрализатора и последующего взятия смыва для высева. В предлагаемом способе нейтрализатор наносится мерно на поверхность тест-объекта по истечение экспозиции, затем берется смыв с поверхности тест-объекта стерильным тампоном (он впитывает 0,1 мл раствора) и этим же тампоном производится высев на чашки Петри с питательной средой. В известных способах смыв с поверхности производится стерильными салфетками, смоченными нейтрализатором, которые затем отбиваются в емкости с физ.раствором со стеклянными бусами в течение определенного времени, откуда затем берется некоторое количество смеси с последующем высевом на питательную среду; кроме того, применяется методика последовательного погружения носителей (штифтов штампа-репликатора), контаминированных взвесями культур микроорганизмов, в дезинфектант, а затем в нейтрализатор с последующим высевом на твердые питательные среды посредством прижатия концевых площадок штифтов к поверхности среды на чашках Петри.

Таким образом, взятие смыва с поверхности тест-объекта стерильным тампоном с последующим высевом на питательную среду представляется удобным с практической точки зрения, кроме того, на стандартном тампоне содержится 0,1 мл раствора, что соответствует количеству высеваемой смеси варианта №1 предложенного нами способа, что позволяет сравнивать результаты обоих вариантов способа между собой.

Кроме того, растирание (а не распыление, не орошение) стерильным шпателем взвесей микроорганизмов, растворов дезинфектантов и нейтрализаторов по поверхности тест-объекта является приближенным к практическим условиям применения дезинфектанта, т.к. в ЛПУ используется метод протирания растворами дезинфектантов различных поверхностей, в то время как распыление или орошение растворами дезинфицирующих средств используется на практике крайне редко.

Преимущества предлагаемого изобретения:

1) отсутствует необходимость предварительного тестирования культур микроорганизмов на возможность применения предлагаемого метода;

2) ограничение времени воздействия дезинфектанта на изучаемую культуру микроорганизмов за счет применения нейтрализаторов дезинфектантов, что позволяет проводить исследования с учетом рекомендуемых режимов дезинфекции;

3) возможность одновременного испытания нескольких дезинфицирующих средств с различными рекомендуемыми режимами дезинфекции;

4) стандартность методики (мерное внесение дезинфицирующих растворов, взвеси микроорганизмов и растворов нейтрализаторов, а также количественный высев на питательные среды);

5) возможность идентификации выросших на твердых питательных средах микроорганизмов;

6) количественная оценка результатов (подсчет числа выросших колоний);

7) градация чувствительности (определение степени чувствительности испытуемых культур микроорганизмов к дезинфектантам);

8) предлагаемое изобретение является микрометодом, что позволяет работать с малыми количествами дезинфектантов (измеряемыми в миллиграммах);

9) простота и экономичность методики, дающая возможность ее широкого применения в различных бактериологических лабораториях.

Примеры конкретного исполнения даны в виде протоколов испытаний.

Пример №1

Протокол испытаний действия Жавель-Солида на зараженную поверхность культурами, выделенными из внешней среды.

Проведено изучение чувствительности 17 культур, выделенных из внешней среды стационара, к дезинфицирующему средству «Жавель-Солид» на различных поверхностях.

Изучение действия дезинфицирующего средства проводилось по собственной методике определения чувствительности (устойчивости) микроорганизмов к дезинфицирующим средствам при обработке различных поверхностей.

Ход исследования

1. Приготовление микробных взвесей из исследуемых культур, выращенных на плотной питательной среде при температуре 37°С в течение суток. Взвеси готовятся на 0,9% стерильном изотоническом растворе хлорида натрия по стандарту мутности 5 ед. (т.е. в 1 мл раствора содержится 5×10⁸ микробных клеток).

2. Приготовление рабочего раствора дезинфектанта «Жавель-Солид» на стерильной дистиллированной воде в бактерицидной концентрации 0,015%.

3. На стерильные поверхности тест-объектов площадью 10×10 см мерно наносится микробная взвесь в количестве 0,1 мл и распределяется по поверхности стерильным шпателем по всей поверхности квадрата.

После подсыхания взвеси на поверхность наносится 0,9 мл дезинфектанта и растирается подобным образом.

В качестве тест-поверхностей были использованы:

- клеенка,

- металл,

- стекло,

- текстиль,

- кафель,

- пластик,

- стена, окрашенная масляной краской.

Действие дезинфектанта на клеенке проводилось с культурами №267 (S.epidermidis), 304 (S.epidermidis), 309 (S.epidermidis), 314 (S.epidermidis), 315 (S.epidermidis);

на металле - с культурами №268 (S.epidermidis), 281 (S.epidermidis), 286 (S.epidermidis), 308 (S.epidermidis);

на стекле - с культурой №311 (S.aureus);

на текстиле - с культурой №312 (S.epidermidis);

на кафеле - с культурой №316 (S.epidermidis);

на пластике - с культурами №285 (S.epidermidis), 288 (S.epidermidis), 296 (S.epidermidis), 302 (S.epidermidis);

на стене, окрашенной масляной краской, - с культурой №310 (S.aureus). Время взаимодействия дезинфектантов с микробной взвесью составило 60 минут (экспозиция указана в методических рекомендациях по использованию данного дезинфицирующего средства), после завершения экспозиции на тест-объекты мерно наносится 0,5 мл нейтрализатора (раствор тиосульфата натрия) и равномерно распределяется по поверхности в течение нескольких секунд. После этого с поверхности тест-объекта производился смыв стерильным тампоном с последующим высевом на чашки Петри с питательной средой (этим же тампоном). Параллельно ставится контроль:

- жизнеспособности культур,

- дезинфектанта без добавления культуры,

- полноты нейтрализации дезинфектанта,

- контаминации тест-объекта,

- стерильности тест-объекта.

4. Учет результатов проводился через 24 часа инкубации в термостате при t=37°С. Проведена микроскопия выросших культур.

Получены следующие результаты:

При обработке Жавель-Солидом 0,015% при экспозиции 60 минут показатель эффективности составил 100% (отсутствие роста на чашках Петри) на клеенке, металле, стекле, текстиле, кафеле, пластике, зараженной культурами №267 (S.epidermidis), №304 (S.epidermidis), №309 (S.epidermidis), №314 (S.epidermidis), №315 (S.epidermidis), №268 (S.epidermidis), №281 (S.epidermidis), №286 (S.epidermidis), №308 (S.epidermidis), №311 (S.aureus), №312 (S.epidermidis), №316 (S.epidermidis), №285 (S.epidermidis), №288 (S.epidermidis), №296 (S.epidermidis), №302 (S.epidermidis).

Обработка стены, окрашенной масляной краской, зараженной культурой №310 (S.aureus), оказалась неэффективна (обнаружен рост до 100 КОЕ на чашках Петри - неполное бактерицидное действие дезинфектанта).

Пример №2

Протокол испытаний воздействия дезинфицирующих растворов на Salmonella agona.

В проблемную научную лабораторию микробиологии НИИ ПФМ ГОУ ВПО НижГМА из ГУЗ НО «Дзержинский специализированный дом ребенка №2» доставлены культуры Salmonella agona (№784, 823, 824), выделенные от больных, для проведения исследований на чувствительность к дезинфектантам, которые используются в данном учреждении (дезинфицирующие средства «Пюржавель» и «Сульфохлорантин» были предоставлены).

Изучение действия препаратов проводилось по собственной методике определения чувствительности (устойчивости) микроорганизмов к дезинфицирующим средствам.

Ход исследования

1. Приготовление микробных взвесей из культур S.agona, выращенных на плотной питательной среде при температуре 37°С в течение суток. Взвесь готовится на 0,9% стерильном изотоническом растворе хлорида натрия по стандарту мутности 5 ед. (т.е. в 1 мл раствора содержится 5×10⁸ микробных клеток).

2. Приготовление рабочих растворов дезинфектантов на стерильной дистиллированной воде в бактерицидных концентрациях. Использовались дезинфектанты в следующих концентрациях: Пюржавель 0,015%, Сульфохлорантин 0,2%, Хлорамин 1%.

3. Растворы дезинфектантов разливаются по стеклянным пробиркам с резиновыми пробками в мерных количествах (по 0,9 мл), после чего в пробирки вносится микробная взвесь (0,1 мл) и перемешивается встряхиванием в течение нескольких секунд. Время взаимодействия дезинфектантов с микробной взвесью составило 60 минут (экспозиция указана в методических рекомендациях по использованию данных дезинфицирующих средств), после завершения экспозиции в смесь добавляется 0,5 мл нейтрализатора (растворы тиосульфата натрия) и перемешивается встряхиванием в течение нескольких секунд, после чего производится высев 0,1 мл полученной смеси на чашки Петри с плотной питательной средой (мясо-пептонный агар).

Параллельно поставлены контроли:

- жизнеспособности S.agona,

- дезинфектантов без добавления культуры,

- полноты нейтрализации дезинфектанта.

4. Учет результатов проводился через 24 часа инкубации в термостате при t=37°С. Проведена микроскопия выросших культур.

Получены следующие результаты:

1. Культуры Salmonella agona (№784, 823) оказались чувствительны ко всем представленным дезинфицирующим средствам (отсутствие роста).

2. Культура Salmonella agona №824 проявила неполную чувствительность к средству «Сульфохлорантин» 0,2% при экспозиции 60 минут (рост до 100 КОЕ на чашках Петри - неполное бактерицидное действие).

Предлагаемая группа изобретений относится к биотехнологии и может использоваться для оценки чувствительности (устойчивости) микроорганизмов к дезинфектантам. Способ предусматривает следующее. Готовят взвесь культуры микроорганизмов. Полученную взвесь смешивают в пробирке с дезинфицирующим средством или в случае нанесения на поверхность полученной взвеси, дают этой поверхности подсохнуть и наносят дезинфицирующее средство. Добавив дезинфицирующее средство, проводят экспозицию полученной смеси в течение времени, известного для данного дезинфицирующего средства. После этого, добавляют в пробирку или наносят на поверхность нейтрализатор дезинфицирующего средства. Затем, высевают полученную взвесь на твердую питательную среду, а в случае нанесения на поверхность, предварительно проводят экспозицию, после которой смывают полученную смесь с поверхности тампоном и проводят посев полученной смеси при помощи тампона на твердую питательную среду. О чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующему средству судят по росту микроорганизмов на питательной среде до 300 КОЕ/мл. При этом, при росте до 100 КОЕ/мл судят о неполном бактерицидном действии, при росте более 300 КОЕ/мл - об устойчивости микроорганизмов к дезинфицирующему средству. Изобретение позволяет быстро количественно оценить степень сформировавшейся устойчивости микроорганизмов к дезинфицирующим средствам.

1. Способ определения чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующему средству при действии его в растворе, включающий экспозицию смеси взвеси культуры микроорганизма с дезинфицирующим средством, добавление нейтрализатора дезинфицирующего средства, высев взвеси на твердую питательную среду с последующей оценкой роста микроорганизмов на питательной среде, отличающийся тем, что взвесь культуры микроорганизма готовят по стандарту мутности 5 Ед, затем 0,1 мл этой взвеси смешивают в пробирке с 0,9 мл дезинфицирующего средства и проводят экспозицию полученной смеси в течение времени, известного для данного дезинфицирующего средства как время, необходимое для проявления дезинфицирующего эффекта, затем добавляют 0,5 мл нейтрализатора, берут 0,1 мл полученной смеси и высевают на твердую питательную среду, о чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующему средству судят при росте микроорганизмов на питательной среде до 300 КОЕ/мл, при этом при росте до 100 КОЕ/мл судят о неполном бактерицидном действии, при росте 100-300 КОЕ/мл - о суббактерицидном действии, при росте более 300 КОЕ/мл - об устойчивости микроорганизмов к дезинфицирующему средству.

2. Способ определения чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующему средству при действии его на поверхностях, включающий экспозицию смеси взвеси культуры микроорганизма с дезинфицирующим средством, добавление нейтрализатора дезинфицирующего средства, высев взвеси на твердую питательную среду с последующей оценкой роста микроорганизмов на питательной среде, отличающийся тем, что взвесь культуры микроорганизма готовят по стандарту мутности 5 Ед, затем 0,1 мл этой взвеси наносят на стерильную поверхность тест-объекта площадью 10×10 см и распределяют стерильным шпателем по всей площади квадрата, после подсыхания микробной взвеси на поверхность наносят 0,9 мл дезинфицирующего средства и распределяют по поверхности квадрата стерильным шпателем, проводят экспозицию полученной смеси в течение времени, известного для данного дезинфицирующего средства как время, необходимое для проявления дезинфицирующего эффекта, затем на поверхность тест-объекта наносят 0,5 мл нейтрализатора дезинфицирующего средства и после экспозиции нейтрализатора смывают смесь с поверхности тест-объекта стерильным тампоном, этим же тампоном сразу проводят высев 0,1 мл смеси на твердую питательную среду, о чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующему средству судят при росте микроорганизмов на питательной среде до 300 КОЕ/мл, при этом при росте до 100 КОЕ/мл судят о неполном бактерицидном действии, при росте 100-300 КОЕ/мл - о суббактерицидном действии, при росте более 300 КОЕ/мл - об устойчивости микроорганизмов к дезинфицирующему средству.