Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и касается нового штамма бактерий, синтезирующего на поверхности мясопептонного агара (МПА) с глюкозой внеклеточный поверхностно-активный агент, обладающий гидрофилизирующей активностью.
Цель изобретения - новый штамм бактерий, продуцирующий на МПА с глюкозой внеклеточный поверхностно-активный агент, обладающий гидрофилизирующей способностью.
В литературе отсутствуют сведения об использовании продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, обладающих гидрофилизирующими свойствами. Проведен скрининг 2000 штаммов микроорганизмов, установлено, что только несколько из них, в том числе Pseudomonas aeruginosa ВКПМ В-7144, обладает свойством продуцировать вещество (действующее начало не выделено в чистом виде), способное вытеснять гидрофобные жидкости с поверхностей, предварительно обработанных фильтратом.
Штамм Ps. aeruginosa ВКПМ В-7144 отличается от известных в настоящее время аналогов-продуцентов поверхностно-активных веществ и эмульгаторов, например от штамма Ps. fluorescens, тем, что последний не синтезирует вещество, обладающее гидрофилизирующей активностью. В настоящее время, например, в текстильной промышленности применяют химические гидрофилизаторы.
Штамм бактерий Ps. aeruginosa ВКПМ В-7144 получен как аттенуированный вариант штамма Ps. aeruginosa III, ранее выделенного из нефтезагрязненной почвы. Ps.aeruginosa ВКПМ В-7144 получен с использованием нитрозометилнитрогуанидина (НМНГ) путем выделения культуры из морской свинки, зараженной Ps. aeruginosa III и леченной гентамицином.
Выделенный штамм проверен на активность при хранении и пересевах на неселективные среды.
Штамм Ps. aeruginosa ВКПМ В-7144 имеет следующую характеристику.
Культурально-морфологические признаки. Среда для хранения - мясопептонный агар с 1%-ной глюкозой (МПА с глюкозой). На твердой среде МПА с глюкозой штамм образует бежевые, неправильной формы пуповидные колонии, выделяющие в среду на 3-4-е сутки роста сине-зеленый пигмент пиоцианин, а в жидкой среде - мутный рост с пленкой. Клетки прямые или слегка изогнутые, подвижные палочки, грамотрицательные, спор не образуют. На среде Кинг А и Кинг Б образуется пиоцианин, флюоресцеирующий пигмент отсутствует. Длина клеток на МПА с глюкозой 2-4 мкм, ширина 0,7-1,0 мкм.
Физиолого-биохимические признаки. Аэроб и факультативный анаэроб. Температурные пределы 10-41oC, оптимум для роста 30-37oC, пределы pH 5,5-8,0; оптимум pH 6,8-7,2. Обладает оксидазной селективностью. Источниками углерода для роста являются глюкоза, маннит, глицерин, в факультативно-анаэробных условиях - глюкоза, лактоза, сахароза, маннит, мальтоза. Растет на нефти и гудроне. Восстанавливает нитраты. Обладает аргининдегидролазной активностью.
Штамм непатогенен.
Синтез поверхностно-активного агента, обладающего гидрофилизирующей активностью, штаммом Ps. aeruginosa ВКПМ В-7144 происходит на поверхности МПА с глюкозой, в МПБ и ПБ с глюкозой, в простой минеральной среде с H-алканами в качестве источника углерода.
Кратковременное хранение штамма осуществляется в полужидких столбиках МПА с глюкозой под слоем вазелинового масла при 4oC. По истечении 4-6 мес бактерии пересевают на свежие среды МПА с глюкозой. Для более длительного хранения штамм хранят в лиофилизированном состоянии в запаянных ампулах с желатиной и 10%-ной сахарозой в качестве криопротектора.
Свойства штамма синтезировать поверхностно-активный агент, обладающий гидрофилизирующей способностью, иллюстрируются примером.
Пример. Штамм Ps. aeruginosa ВКПМ В-7144 выращивают на МПА г, содержащей в качестве источника углерода глюкозу. Состав среды, г/л воды: бульон Хоттингера 5; глюкоза 10; NaCl 5; бактопептон 5; агар 15; pH 7,0-7,2. Стерилизация 20 мин при 1 атм. Инокулируют среду культурой, выращенной в течение 24-30 ч на косячках МПА с глюкозой. После 68-72 г культивирования при 30oC на поверхности МПА с глюкозой в матрацах бактерии смывали физраствором, бактериальные клетки отделяли от жидкости центрифугированием и определяли гидрофилизирующие, эмульгирующие и поверхностно-активные свойства фильтрата.
Гидрофилизирующую активность определяли по отталкиванию (отторжению) поверхностями, смоченными фильтратом гидрофобных жидкостей (нефть, масляная краска, подсолнечное масло, окрашенное суданом черным) двумя способами.
1. Опыты с влажными поверхностями, покрытыми фильтратом. Источником гидрофилизирующей активности служила надосадочная жидкость культуры Ps. aeroginosa ВКПМ В-7144 после осаждения клеток центрифугированием и последующего кипячения. Стеклянные, керамические, латунные, алюминиевые, стальные, полиэтиленовые, полипропиленовые и тефлоновые палочки, а также протезы аорты из полиэфира (Dallon, Польша) погружали на несколько секунд в фильтрат, затем в гидрофобные окрашенные жидкости (нефть, масляную краску, подсолнечное масло, окрашенное суданом черным). Поверхность металлических, стеклянных и керамических палочек оставалась совершенно незагрязненной; полиэтиленовые и полипропиленовые поверхности и протезы аорты слегка загрязнялись; тефлоновые палочки загрязнялись сильно. Контрольные, не покрытые фильтратом поверхности сильно и прочно загрязнялись указанными выше гидрофобными жидкостями.
2. Опыты с сухими поверхностями, покрытыми фильтратом. Палочки из материалов, перечисленных в п.1, кроме тефлоновых, погружали в фильтрат, высушивали и погружали в окрашенные гидрофобные жидкости, выдерживали разное время (до 60 дн) при комнатной температуре. Поверхность палочек при этом оказывалась загрязненной, хотя и в меньшей степени, чем поверхности, не покрытые фильтратом. Однако при увлажнении загрязненных поверхностей водой происходило быстрое, спонтанное (без механического воздействия) очищение стеклянных, керамических и металлических покрытых фильтратом поверхностей; протезы аорты отмывались почти полностью (на поверхности оставались следы загрязнений); наиболее трудно отмывались полиэтиленовые и полипропиленовые поверхности.
Раствор фильтрата в концентрациях менее 1% хорошо отмывает поверхности, загрязненные нефтью и другими маслами. Отмывание происходит спонтанно, без механического воздействия.
В разработанные растворы фильтрата (менее 0,1%) погружали различные ткани и волокна (хлопок, капрон, нейлон). После высушивания оценивали смачиваемость материалов по времени впитывания определенного объема воды. Во всех случаях ткани и волокна приобретали высокогидрофильные свойства.
Эмульгирующую активность определяли методом пробирочной пробы. В пробирку с делениями на 25 мл вносили 5 мл пентадекана или гексапедена и 5 мл фильтрата. Смесь интенсивно встряхивали в течение 2 мин. Эмульгирующую активность определяли измерением высоты образования эмульсии через 24 ч и выражали в процентах. Она составляла 50-60% разведенного в 100 раз фильтрата.
Поверхностную активность определяли сталагмометрическим методом по снижению межфазного натяжения. Межфазное натяжение снижалось в 7 раз.
Новый штамм Pseudomonas acruginosa ВКПМ В-7144, продуцирующий поверхностно-активный полимер - ойлрепеллер, культивируют на поверхности мясопептонного агара, содержащего глюкозу в качестве источника углерода и энергии. Время культивирования 68 - 72 ч. Выход ойлрепеллера по сухому весу 6 г/л МПа. Он может быть использован для повышения нефтеотдачи пластов, очистки окружающей среды, в текстильной промышленности, для покрытия изделий из стекла, металла, керамики, пластмасс с целью придания им маслоотталкивающих, гидрофильных и антистатических свойств, в качестве моющего средства.
Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa ВКПМ В-7144, продуцирующий внеклеточный поверхностно-активный агент, обладающий гидрофилизирующей способностью.
| SU, авторское свидетельство, 14722496, C 12 N 1/20, 1989. |
