Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению средств защиты растений от бактериального рака, и касается нового штамма бактерий для получения препарата против бактериального рака винограда.
Целью изобретения является получение нового более эффективного штамма бактерий.
Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens выделен с ивового опада. Ему присвоен N 35. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под N В-4117.
Штамм имеет следующие культурально-морфологические признаки.
Морфологические признаки. Неспорообразующие, грамотрицательные, подвижные палочки с полярными жгутами размером 0,6-0,7 х 1,5-2 мкм. Морфология колоний, образующихся при культивировании при 28оС в течение 4-5 сут. На мясопептонном агаре (МПА) - круглые, гладкие, слабо выпуклые, желтовато-серые, иногда с коричневатым более выпуклым центром. Пигмент зеленый флюоресцирующий или темно-желтый. На МПА с глицерином - диссоциация на два колониальных типа желтовато-серые, слабо выпуклые, к центру слегка матовые и беловатые, блестящие, более выпуклые и слизистые.
На среде Клюйвера заключается диссоциация на несколько колониальных типов: коричневатые, прозрачные, почти плоские; коричневато-желтые, матовые, выпуклые; темно-коричневые, покрытые мелкими дочерними колониями; черные, плотные с металлическим блеском и карликовые темные. У колониально-морфологических вариантов пигментация на средах разная: золотисто-желтая, коричневая, розовато-оранжевая, красноватая. На среде Кинга А - колонии однородные, коричневато-розовые, слабо выпуклые. Пигмент коричневато-желтый. На среде Кинга Б - беловатые, выпуклые, круглые колонии. Пигмент интенсивный, зеленый, флюоресцирующий, со временем розовеет.
Культуральные признаки.
МПА (косяки) - штрих серый, масляный, блестящий, слабо выпуклый. Пигмент зеленый, флюоресцирующий у суточных культур, затем становится золотисто-желтым и коричневато-розовым. Картофельный агар (косяки) - рост темно-коричневый, маслянистый, выпуклый. Пигмент коричневый. На мясопептонном бульоне (МПБ) образуется сильная муть, осадок, через сутки роста пигмент зеленый, флюоресцирующий, переходящий на 3-5 сутки в желто-оранжевый.
Физиолого-биохимические признаки.
Прототроф. В факторах роста не нуждаются. Поли- β-оксибутират внутри клеток не накапливает. Аргининдигидролаза имеется. Метаболизм глюкозы окислительный. Желатина - быстрое разжижение. Послойное разжижение начинается через 24 ч, полное наблюдается на третьи сутки (28оС). Молокопептинизация, желто-зеленый пигмент. Нитраты не редуцирует. Молекулярный азот не фиксирует. Крахмал не гидролизует. Клетчатку не разлагает. Картофель не мацерирует (отсутствует пектиназная активность). Каталазу образует. Леван из сахарозы образует. Отношение к температуре: 4, 16, 28, 37оС - рост хороший, 42оС - не растет.
Отношение к источникам углерода. Усваивает с образованием кислоты глюкозу, фруктозу, трегалозу, маннит, глицерин. Не усваивает арабинозу, ксилозу, рамнозу, галактозу, сорбозу , мальтозу, лактозу, мелибиозу, адонит, сорбит, дульцит, инулин. Из органических кислот усваивает муравьиную, уксусную, молочную, янтарную, фумаровую, аконитовую, пировиноградную, яблочную, бензойную, малоновую. Не усваивает винную, лимонную, щавелевую, глюконовую кислоты.
Отношение к источникам азота. Хорошо усваивает (NH4)2SO4, пептон, аланин, гликокол, аргинин, слабо - KNO3, аспарагин, тирозин, мочевину.
Сапрофит. Фитопатогенной активностью по отношению к картофелю, табаку и винограду не обладает. Штамм устойчив к тетрациклину (10 мкг/мл), хлорамфениколу (50 мкг/мл), стрептомицину (100 мкг/мл), ампициллину (200 мкг/мл). Устойчивость к антибиотикам проверяли на агаризованном бульоне Хоттингера.
Условия хранения штамма.
Штамм хранят в лиофильно высушенном состоянии не менее 1 г. Клетки, выросшие на косяках с агаризованным бульоном Хоттингера или картофельным агаром, в течение 1 сут смываются раствором для лиофилизации следующего состава: 1 мл физиологического раствора, 1 мл смеси (10 мл сыворотки крови крупного рогатого скота без консерванта, 1 мл раствора сахарозы 30 г/30 мл).
Способ получения препарата для предупреждения заболевания винограда бактериальным раком.
Примеры использования штамма для получения препарата против бактериального рака винограда.
П р и м е р 1. Клетки штамма бактерий Ps. aureofaciens 35 выращивают в течение 1 сут при 30оС на чашках или матрицах с агаризованным бульоном Хоттингера, затем смывают фосфатным буфером (рН 7,2) и разводят до титра 108-109 кл/мл. С 1 см поверхности питательной среды получают 1˙109 кл. Для выращивания бактерий можно также использовать картофельный агар, для смывания - физиологический раствор или стерильную прокипяченную воду.
П р и м е р 2. Определение антагонистической активности штамма.
Клетки штамма засевают уколом на вышеуказанные среды и выращивают 2 сут при 28-30оС. Выросшие колонии инактивируют парами хлороформа, после чего поверхность среды заливают вторым слоем 3 мл 0,7% агаровой среды того же состава, смешанной с 0,1 мл индикаторной культуры, выросшей до экспоненциальной фазы роста (1-3 х 108кл/мл) на качалке в жидкой среде того же состава. Штамм выделяет антибиотическое вещество, подавляющее рост агробактерий октопинового и нопалинового типа, на средах, NBY, картофельном агаре, минимально-солевой среде с глюкозой следующего состава (на 1 л дистиллированной воды): NH4Cl 1 г; KH2PO4 1,5 г; Na2HPO4 3,5; MgSO4 0,1 г; агар Дифко 1,5% , глюкоза (глицерин, сахароза) 0,2% , рН 7,0-7,5. Вокруг колоний штамма бактерий Pseudomonas aureofaciens 35 образуются прозрачные зоны радиусом 7-25 мм (табл. 1). Штамм оказывает антагонистическое действие на большое количество онкогенных штаммов агробактерий, выделенных из почвы и с побегов винограда и плодовых деревьев. Кроме того, антибиотическое вещество, выделяемое клетками штамма, подавляет рост других фитопатогенных бактерий таких, как Ezwinia carotovora, Psendomonas syringae, Xanthomonas malvacearum, а также Erwinia herbicola и Psendomonas fluorescens.
Антибиотическое вещество, выделяемое клетками штамма Ps. aureofaciens 35, не анактивируется действием протеолитических ферментов (проназа, трипсин, химотрипсин, пепсин), а также РНКазы и ДНКазы. Активность вещества сохраняется при выдерживании в течение 1,5 ч при 75-80оС.
П р и м е р 3. Изучали возможность предупреждения образования опухолей на винограде путем обработки черенков винограда суспензией клеток P. aureofaciens 35.
Неодревесневевшие черенки винограда сорта Молдова нарезают на двухглазковые черенки. Нижние срезы черенков помещают в емкость с суспензией штамма P. aureofaciens 35 с титром клеток 108-109 кл/мл на 30-60 мин. Контрольные варианты помещают в емкости с водой на то же время. Затем черенки размещают в установке для зеленого черенкования, где и выдерживают при 25-26оС, и постоянного туманообразования в течение 25-30 дн. За этот период формируются корни и трогается в рост верхний глазок (почка). По прохождении этого периода черенки вынимают из пенополистерола и анализируют на наличие опухолей.
Из данных табл. 2 видно, что около 80% черенков винограда двух испытанных сортов поражаются в данных условиях бактериальным раком в результате латентной инфекции. Предварительная обработка срезов черенков суспензией штамма P. aureofaciens 35 приводит к полному подавлению опухолеобразования в случае сорта винограда Молдова, и в 2,7 раза уменьшает количество опухолей на черенках винограда сорта Каберне.
Штамм бактерий P. aureofaciens 35 по сравнению с известным штаммом A. radiobacter 84 имеет более широкий спектр действия, он подавляет рост агробактерий не только нопалинового, но и октопинового типа. В отличие от известного штамма штамм P. aeureofaciens защищает от опухолеобразования растения винограда. По-видимому этот штамм может быть применен для защиты и других сельскохозяйственных культур от бактериального рака. Кроме того, тот факт, что штамм P. aeureofaciens 35 подавляет рост таких фитопатогенных бактерий, как Erwinia carotovora, Pseudomonas syringae, Xanthomonas malvacearum, позволяет предположить, что он окажется перспективным и для биологической борьбы с заболеваниями, вызываемыми этими бактериями. (56) Moore L. W. , Warren G. Agrobacterium radiobacter strain 84 and biological control of crown gall. - Ann. Rev. Phytopatol, 1979, v. 17, p. 163.
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения средств защиты растений от бактериального рака, а именно к новым штаммам для получения препарата против бактериального рака винограда. Целью изобретения является получение нового более эффективного штамма Pseudomonas aureofaciens 35. Штамм бактерий выделен из ивового опада. Штамму бактерий P. aureofaciens авторами присвоен N 35, он депонирован по ВКПМ под номером В-4117. Отличительным признаком штамма является его способность подавлять рост вирулентных агробактерий, вызывающих бактериальный рак винограда и других растений. Для заявляемого штамма характерен более широкий спектр антагонистического действия, чем для штамма Agrobacterium radiobacter 84, используемого для биологической борьбы с бактериальным раком. Он подавляет рост агробактерий, содержащих плазмиды октопинового и нопалинового типов. Кроме того, заявляемый штамм проявляет антагонистическое действие и против других фитопатогенных бактерий, вызывающих заболевания важных сельскохозяйственных культур. Штамм может быть использован для биологической борьбы с бактериальным раком винограда, а также других растений. Проведенные испытания штамма показали, что обработка черенков винограда суспензий клеток штамма приводит к подавлению опухолеобразования на растениях. 2 табл.
Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-4117 для получения препарата против бактериального рака винограда.
