Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и касается нового штамма и питательной среды, в которой он способен утилизировать мелассу или этанол с образованием эмульгирующего, поверхностно-активного вещества, которое может быть использовано для повышения нефтеотдачи пластов, очистки окружающей среды.
Цель изобретения - новый штамм бактерий, синтезирующий на минеральной среде с мелассой или этанолом, внеклеточный нефтерастворимый агент, не требующий его выделения из культуральной жидкости, и питательная среда для его культивирования.
Ps. putida ВКПМ В-6641 был выделен по способности образовывать стойкую газонефтяную пену в отличие от других продуцентов эмульгаторов и био ПАВ, в том числе и от Ps.fluorescens [1], продуцирующего эмульгатор. По сравнению со штаммом, описанным в АС, заявляемый штамм может быть использован для повышения нефтеотдачи пластов в сухом виде после высушивания культуральной жидкости при 80oC, не теряя при этом своих активных свойств.
Штамм бактерий Ps.putida ВКПМ В-6641 выделен из нефтезагрязненной почвы.
Выделенный штамм проверен на активность при хранении и пересевах на неселективные среды.
Штамм Ps.putida ВКПМ В-6641 имеет следующую характеристику.
Культурально-морфологические признаки.
Среда для хранения - мясо-пептонный агар с 1% глюкозы (МПА с глюкозой). На твердой среде МПА с глюкозой образует бежевые неправильной формы пуповидные колонии, а на жидкой - мутный рост. Клетки прямые или слегка изогнутые, грамотрицательные, спор не образуют. На среде КингА и КингБ флюоресцирующий пигмент не образуется. Длина клеток на МПА с глюкозой 2-4 мкм, ширина 0,7-1 мкм.
Физиолого-биохимические признаки.
Аэроб. Температурные пределы 10-40oC, оптимум для роста 28-30oC, пределы pH 4,5-8,5; оптимум pH 6,8-7,2. Крахмал не гидролизует. Обладает оксидазной активностью. Источниками углерода для роста являются глюкоза, глицерин, этанол, нефть, гудрон. Не утилизирует сахарозу, масло трансформаторное, масло подсолнечное, метанол, гексадекан. Не восстанавливает нитраты.
Штамм не патогенен.
Синтез внеклеточного нефтерастворимого агента штаммом Ps.putida ВКПМ В-6641 происходит на простых синтетических средах, не содержащих каких-либо индукторов. Предпочтительным источником азота являются соли аммония.
Кратковременное хранение штамма осуществляется в полужидких столбиках МПА с глюкозой под слоем вазелинового масла при 4-6oC. По истечении 4-6 мес. желателен пересев на свежие среды МПА с глюкозой. Для более длительного хранения штамм хранят в лиофилизированном состоянии в запаянных ампулах с 10%-ной сахарозой в качестве криопротектора.
Штамм Ps. putida ВКПМ В-6641 способен через 18-21 ч и 36-48 ч культивирования в среде с мелассой или этанолом синтезировать нефтерастворимый агент в количестве 14 и 8 г/л по сухому весу соответственно. Меласса, используемая в качестве единственного источника углерода и энергии, потребляется за это время на 95%.
Внеклеточный нефтерастворимый агент из фильтрата культуральной жидкости осаждают этиловым спиртом в отношении 1:4.
Высушенная при 80oC культуральная жидкость (препарат "Псевдопол") обладает поверхностно-активными и эмульгирующими свойствами при последующем ресуспендировании.
По литературным данным питательные среды, применяемые для бактерий рода Pseudomonas в качестве сред для продуцирования биосурфактантов, непригодны для штамма Ps.putida ВКПМ В-6641 продуцента внеклеточного нефтерастворимого агента [1].
Нами был проведен скрининг питательных сред для продуцирования штаммом Ps. putida ВКПМ В-6641 нефтерастворимого агента. Например, Ps.putida ВКПМ В-6641 не растет на питательной среде для культивирования Ps.fluorescens-продуцента эмульгатора [2] , и только заявляемая среда, содержащая мелассу или этанол в качестве источника углерода и энергии и минеральные соли, пригодна для культивирования данного штамма с целью получения активного агента в фильтрате культуральной жидкости.
Свойства штамма синтезировать нефтерастворимый агент подтверждаются примерами.
Пример 1. Штамм Ps.putida ВКПМ В-6641 выращивают в минеральной среде, содержащей в качестве источника углерода технический этанол, состав среды, г/л, водопроводной воды: K2HPO4 4,3; KH2PO4 3,4; (NH4)2SO4 4; MgSO4 0,5; CaCO3 0,3; NaCl 5; KCl 0,2; этанол - 20; pH 7,0-7,2. Стерилизация при 1 атм. 20 мин. Инокулируют среду культурой, выращенной в течение 36-48 ч. После 36-48 ч культивирования при 28 - 30oC в колбах на 750 мл, объем среды в колбе 100 мл, на качалке, дающей 200 об/мин, определяют эмульгирующие и поверхностно-активные свойства культуральной жидкости до и после высушивания при 80oC, а нефтерастворимый агент выделяют из культуральной жидкости осаждением этиловым спиртом.
Выход нефтерастворимого агента из расчета на сухой вес 8 г/л.
Пример 2. Штамм Ps.putida ВКПМ В-6641 выращивают в минеральной среде, содержащей в качестве источника углерода мелассу. Состав среды, г/л, водопроводной воды: K2HPO4 4,3; KH2PO4 3,4; (NH4)2SO4 4; MgSO4 0,5; CaCO3 0,3; NaCl 5; KCl 0,2; меласса 20; pH 7,0 - 7,2. Стерилизация при 1 атм. 20 мин. Инокулируют среду культурой, выращенной в течение 36-48 ч. После 18-21 ч культивирования при 28-30oC в колбах на 750 мл, объем среды в колбе 100 мл, на качалке, дающей 200 об/мин, определяют эмульгирующие и поверхностно-активные свойства культуральной жидкости до и после высушивания при 80oC. Выход нефтерастворимого агента из расчета на сухой вес 14 г/л.
Определение эмульгирующей активности культуральной жидкости и фильтрата.
Эмульгирующую активность определяют методом пробирочной пробы [3] по способности исследуемой жидкости эмульгировать н-алканы следующим образом. В пробирку с делениями на 25 мл вносят 5 мл пентадекана или гексадекана и 5 мл исследуемой жидкости. Смесь интенсивно встряхивают вручную в течение 2 мин. Эмульгирующую активность определяют измерением высоты образовавшейся эмульсии через 24 ч и выражают в %. Она составляет 50-60%.
Поверхностную активность определяют тестом нестабильности капель на гидрофобной поверхности [4]. В каплю дистиллированной воды на полиэтиленовой пленке вносят на кончике микробиологической иглы культуральную жидкость или фильтрат, перемешивают. При наличии поверхностно-активного вещества капля воды теряет стабильность, т. е. растекается. Культуральная жидкость и фильтрат содержат поверхностно-активное вещество, так как капля дистиллированной воды растекается на полиэтиленовой пленке при соприкосновении с ними.
Источники информации.
1. АС СССР 1472496, Бюл.N 14, 1989.
2. АС СССР 1565885, Бюл.N 19, 1990.
3. Cooper, D.G., C.N.Liss, R.Londay and J.E.Zajic, 1981. Surface activity of Mycobacterium and Preudomonas. J.Ferment. Technol. 59, N 2, 97-101.
4. Person A., Molin G., 1987. Capacity for biosurfactant production of environmental Pseudomonas and Vibronaceae growing on carbohydrates. Appl.Microbiol.and Biotechnol. 26, N 5, 439-442.
Новый штамм бактерий Pseudomonas putida ВКПМ В-6641 продуцирует на новой минеральной среде нефтерастворимый не требующий выделения из культуральной жидкости биополимер. Штамм культивируют на новой минеральной среде, содержащей мелассу или этанол в качестве источника углерода и энергии. Время культивирования 18-21 ч в среде с мелассой и 36-42 ч в среде с этанолом, выход биополимера по сухому весу 14 и 8 г/л соответственно. Культуральная жидкость Pseudomonas putida или высушенная при 80oC культуральная жидкость - препарат "Псевдопол" - может быть использована для повышения нефтеотдачи. 2 с.п. ф-лы.
Источники углерода - меласса или этанол - 10 - 20
K2HPO4 - 2,0 - 4,8
KH2PO4 - 1,5 - 4,0
(NH4)2SO4 - 0,5 - 4,0
MgSO4 - 0,2 - 0,5
CaCO3 - 0,3 - 3,0
NaCl - 1,0 - 5,0
KCl - 0,1 - 0,5
Вода - Остальное
