Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к лечебным бактериофагам.
К настоящему времени известен фаг Pseudomonas aeruginosa, используемый в лечении гнойно-воспалительных заболеваний [1]. Описанный бактериофаг был выделен из образцов сточных вод.
Однако важно отметить, что при исследовании подобных фагов в лечебных целях возможна их инактивация различными факторами гнойного экссудата [2].
Цель изобретения - пилеспецифичный вирулентный фаг ⊘ 03, используемый для приготовления поливалентного лечебного препарата фагов синегнойной палочки.
Бактериофаг ⊘ 03 Pseudomonas aeruginosa выделен из образца гнойного отделяемого раны, т.е. бактериальный вирус приспособлен к функционированию в данной экологической нише.
Пилеспецифичные фаги Pseudomonas aeruginosa не применялись ранее в качестве лечебных антимикробных агентов.
Бактериофаг ⊘ 03 депонирован в коллекции фагов ГНЦПМ под номером 03.
Бактериофаг характеризуется следующими свойствами.
Морфологические признаки.
Фаг ⊘ 03 имеет несколько удлиненную головку (95 • 60 нм) и несокращающийся хвостовой отросток (165 • 12 нм). Дистальный конец хвостового отростка напоминает усеченный конус, от вершины которого берут начало 3 терминальные фибриллы длиной 10 - 12 нм. Терминальные фибриллы имеют утолщения на дистальных окончаниях. На расстоянии 15 - 17 нм от вершины конуса отростка различимы субтерминальные органеллы адсорбции - образования длиной 15 - 18 нм и шириной 6 - 7 нм. С помощью субтерминальных органелл фаги адсорбируются на пилях P. aeruginosa. Терминальные фибриллы необходимы для адсорбции ⊘ 03 на внешней мембране микроорганизма.
Закономерности взаимодействия фага с клеткой-хозяином.
Фаг ⊘ 03 образует на газонах чувствительных бактериальных культур прозрачные пятна лизиса диаметром 0,5 - 1,5 мм.
Частота образования фагорезистентных форм P. aeruginosa на одну клетку составляет 10-6.
Физиологические признаки.
Кинетика адсорбции ⊘ 03 на клетке-хозяине охарактеризована традиционным способом. При инкубации системы фаг - клетка (титр клеток 108 кл/мл и множественность инфицирования 1:10) в течение 15 мин при 37oC на микроорганизмах адсорбируется 72 + 5% частиц ⊘ 03.
При воспроизведении фага в клетке продолжительность латентного периода составляет 50 - 60 мин, урожайность 30 - 40 частиц на один микроорганизм.
Серологические свойства фага.
Фаг ⊘ 03 не инактивируется антисыворотками, полученными к другим бактериальным вирусам P. aeruginosa из коллекции ГНЦПМ (20 различных форм). Константа инактивации ⊘ 03 гомологической антисывороткой (K) составляет 42 мин-1.
Физико-химические свойства фага.
Литическая активность бактериального вируса не изменяется при нагревании суспензии в течение 60 мин при температуре 55oC. Пределы допустимых в суспензиях значений pH, при которых фаг активен, составляет 4,5 - 11.
Однократное замораживание - оттаивание образца не приводит к снижению титра активных частиц ⊘ 03. Фаг устойчив к хлороформу (в соотношении 1:20).
Литический спектр бактериального вируса ⊘ 03.
Для оценки круга штаммов-хозяев фага использована коллекция P. aeruginosa из 200 штаммов. Коллекция включает 100 клинических изолятов P. aeruginosa и 100 штаммов, представленных музеем бактериальных культур ГНЦПМ. Фаг ⊘ 03 способен лизировать 110 штаммов синегнойной палочки. В отдельных экспериментах показано, что у большинства фагорезистентных форм P. aeruginosa отсутствуют пили.
Пример 1. Адсорбция фага ⊘ 03 на клетке-хозяине. Доказательством первичного взаимодействия фагов с пилями P. aeruginosa являются данные электронно-микроскопического изучения системы ⊘ 03 - клетка. Образцы этой системы в разные моменты времени были фиксированы 1% глутаровым альдегидом, приготовленным на 0,1 M фосфатном буфере (pH 7,2), и проанализированы под электронным микроскопом. Показано, что вслед за первоначальной адсорбцией на полярных пилях частицы ⊘ 03 транслоцируются посредством фимбрий к поверхности P. aeruginosa и закрепляются на внешней мембране терминальными фибриллами.
Пример 2. Получение фага ⊘ 03 на плотной питательной среде. Выращивание ⊘ 03 двуслойным методом предусматривает первоначальное получение фаголизата в слое полужидного (0,7%) мясопептонного агара (МПА). После низкоскоростного центрифугирования системы (5 тыс.g, 10 мин) титр фага в супернатанте обычно составляет 109 - 1010 ч./мл.
Пример 3. Получение фагорезистентных клеток P. aeruginosa и их проверка на лизогенность. Суспензию чувствительных клеток P. aeruginosa (108 кл/мл) с фагом (конечный титр 9 ч./мл) инкубируют в мясопептонном бульоне (МПБ) при 37oC в течение 30 мин и 0,1 мл образца распределяют в чашке Петри на поверхности 1,5%-го МПА. Чашки инкубируют в течение 20 ч в термостате (37oC). Выросшие фагоустойчивые колонии клонируют трехкратным пересевом на МПА. Клонируют 50 - 100 колоний, отобранных произвольно и затем полученные штаммы анализируют на наличие умеренных фагов.
Клетки каждого клона ресуспендирут в МПБ. Начальная концентрация микроорганизмов - 107 кл/мл. Суспензии инкубируют в термостате при 37oC три часа. Затем в системы вносят индуктор митомицин C (конечная концентрация 1 мкг/мл) и образцы инкубируют еще 3 ч. На следующей стадии системы центрифугируют (5 тыс. g, 10 мин). Фракции супернатанта титруют методом агаровых слоев на чувствительных к ⊘ 03 (индикаторных) культурах.
Проверка ⊘ 03 - фагорезистентных форм (100 колоний) P. aeruginosa на наличие умеренных фагов показала, что ⊘ 03 не лизогенизирует клетки синегнойной палочки. Следовательно, ⊘ 03 - вирулентный фаг.
Источники информации
1. Основные направления научных исследований по проблеме бактериофагии Тбилисского НИИВС МЗ СССР. - Чинишвили Т.Г. Бактериофаги: теоретические и практические вопросы. - М., 1983, с. 1-26.
2. H.W. Ackermann, M.S. Dubow. 1987. Viruses of Prokariotes. vol. 1. General properties of bacteriophages. CRC Press, Boca Raton, FL. p. 152.
Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к лечебным фагам. Новый вирулентный пилеспецифичный фаг ГНЦПМ N 03 лизирует широкий круг штаммов синегнойной палочки. Пили (фимбрии) являются одним из факторов патогенности Pseudomonas aeruginosa. Фаг ⊘ 03 проявляет литическую активность по отношению к 55% тест-штаммов Р. aeruginosa. В связи с этим целесообразно включение бактериального вируса ⊘ 03 в состав поливалентного лечебного препарата, состоящего из фагов синегнойной палочки с различной рецепторной специфичностью.
Штамм пилеспецифичного бактериофага Pseudomonas aeruginosa ГНЦПМ N 03, используемый для приготовления лечебного препарата против синегнойной палочки.
