ШТАММ БАКТЕРИОФАГА Pseudomonas aeruginosa, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ОСНОВЫ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ АСЕПТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА ПРОТИВ СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ Российский патент 2012 года по МПК C12N7/00 A61K35/76 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к антисептическим средствам на основе бактериофагов.

К настоящему времени известен штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), используемый для лечения гнойно-воспалительных заболеваний (Чинишвили Т.Г. Бактериофаги: теоретические и практические вопросы. Основные направления научных исследований по проблеме бактериофагии Тбилисского НИИВС МЗ СССР. - М.: 1983, с.1-26). Описанный бактериофаг был выделен из образцов сточных вод.

Недостатком подобных бактериофагов является ограниченный спектр литического действия, кроме этого, при практическом применении в лечебных целях таких бактериальных вирусов возможна их инактивация различными факторами гнойного экссудата (H.W.Ackermann, M.S.Dubow. 1987. Viruses of Prokariotes. vol. 1. General properties of bacteriophages. CRC Press, Boca Raton, FL. p.152).

Известен пилеспецифичный бактериофаг Pseudomonas aeruginosa Фи 03 (патент RU №2112800, опубл. 10.06.1998). Пили (фимбрии) являются одним из факторов патогенности Pseudomonas aeruginosa. Фаг Фи 03 проявляет литическую активность по отношению к 55% тест-штаммам Р. aeruginosa. Достоинством и одновременно недостатком фага является необходимость наличия пилей в патогенной бактерии. Если в штамме Р. aeruginosa отсутствуют пили, то бактериофаг не способен лизировать бактерию.

Наиболее ближайшим к заявляемому штамму - прототипом, является штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa ГНЦ ПМ N 02 (Фи 02), используемый для лечения гнойно-воспалительных заболеваний (патент RU 2113476, опубл. 20.06.1998). Штамм обладает широким спектром литического действия по отношению к тест-штаммам Р.aeruginosa и выделенным из клинических изолятов образцам гнойного отделяемого ран от разных больных, собранных на территории Московской области. Сравнительная проверка данного штамма на бактериальные изоляты, выделенные из ветеринарных клиник Омской и Новосибирской областей показала, что бактериофаг лизирует только 50% тестируемых штаммов P.aeruginosa.

Технической задачей изобретения является создание высоковирулентного бактериофага ph 57, обладающего широким спектром литической активности в отношении синегнойной палочки для борьбы с гнойно-септическими инфекциями.

Штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa ph 57 выделен из экскрементов животных вивария, т.е. бактериальный вирус приспособлен к функционированию в данной экологической нише.

Штамм бактериофага ph 57 был депонирован в коллекции Научно-исследовательского института «Коллекция культур микроорганизмов» Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» (НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор», г.Новосибирск) под регистрационным номером V-357.

Заявляемый штамм может быть использован в качестве основы для приготовления антисептического средства против синегнойной палочки

Бактериофаг характеризуется следующими свойствами.

Морфологические признаки:

Головка гексогональной формы размером 66-72 нм, диаметр хвостового отростка 16-18 нм. На газоне бактериальных культур Р. aeruginosa фаг образует прозрачные пятна лизиса диаметром негативных колоний 1,5-2,0 мм. Центр прозрачный, край неровный, вторичный рост отсутствует.

Серологические характеристики.

Фаг не инактивируется антисыворотками, полученными к другим бактериальным вирусам Р. aeruginosa из коллекции НИИ ККМ ГНЦ ВБ Вектор (11 различных форм) Константа инактивации фага гомологической антисывороткой (К) составляет 85 мин^-1.

Тип нуклеиновой кислоты штамма фага - ДНК.

Физико-химические свойства фага ph 57.

Литическая активность бактериофага ph 57 не инактивируется при нагревании суспензии в течение 30 мин при температуре 55°С (табл.1). Пределы допустимых значений рН, при которых фаг активен, составляют 4,5-9,5 (табл.2). Трехкратное замораживание - оттаивание образца не приводит к снижению титра активных частиц фага ph 57 (табл.3). Фаг устойчив к хлороформу в соотношении (1:20) (табл.4). Экспозиция ультрафиолетом (табл.5) и с перекисью водорода (табл.6) приводит к снижению литической активности бактериофага. В течение 15 мин 1% хлорамин инактивирует бактериофаг.

Литический спектр бактериального вируса.

Для оценки круга штаммов-хозяев фага была использована коллекция Р. aeruginosa из 78 штаммов. Фаг обладает способностью лизировать 100% испытанных культур синегнойной палочки (табл.7).

Диапазон специфичности: лизирует Р. aeruginosa, не лизирует дизентерийные палочки (шигеллы Зонне, Флекснера), свежевыделенные и музейные штаммы кишечной палочки и других представителей нормальной микрофлоры.

Оптимальные условия размножения.

Условия культивирования. Штамм фага размножается на чувствительной культуре синегнойной палочки (культура 663, табл.7) на обычных питательных средах (мясо-пептонный бульон, простой питательный агар) при температуре 37°С в течение 16-18 - часовой инкубации.

Условия хранения: бактериофаг ph 57 сохраняет литическую активность при хранении при температуре +4°С - +6°С в пептонной воде в течение 1 года.

Периодичность пересевов 1 год.

Способ размножения: при воспроизведении фага в клетке-хозяине продолжительность латентного периода составляет 45-50 мин, урожайность - до 100 частиц на одну клетку.

Пример 1. Выращивание бактериофага ph 57

Выращивание фага ph 57 в мясо-пептонном бульоне проводят с использованием термостатируемой качалки. Режим культивирования: температура 37°С, частота вращения колб - 200 об/мин. Первоначально в колбы объемом 250 мл со средой вносят по 5 мл ночной культуры Pseudomonas aeruginosa и выращивают клеточную биомассу в течение 4-6 часов. На следующем этапе в клеточные суспензии вносят фаг (множественность заражения 1:10), после чего систему продолжают инкубировать в том же режиме в течение 12 часов. Обычно концентрация фага ph 57 в полученных лизатах составляет (1-5)×10¹⁰ част./мл.

Пример 2. Титрование фага ph57 методом агаровых слоев

Первоначально готовят разведения анализируемой фаговой суспензии в физиологическом растворе. Пробу (100 мкл) соответствующего разведения смешивают с 100 мкл ночной культуры Pseudomonas aeruginosa. В полученную суспензию вносят 10 мл расплавленного до 42°С 0,7%-ного агара и после быстрого перемешивания содержимое пробирки выливают на поверхность 1,5%-ного мясо-пептонного агара в чашке Петри. После застывания верхнего слоя чашку переворачивают и инкубируют в термостате при 37°С в течение 16-18 ч. Пятна лизиса фага ph 57 на газоне бактериальной культуры подсчитывают для определения концентрации (титра) бактериального вируса в анализируемой системе.

Результаты проверки 10 штаммов Pseudomonas aeruginosa на литическую активность фага ph 57 представлены в таблице 7.

Пример 3. Применение бактериофага ph57 в качестве асептического средства против синегнойной палочки

Высевались штаммы из пациентов с диагнозом «диабетическая стопа». Штаммы принадлежали патогенному виду Pseudomonas aeruginosa и показали множественную устойчивость к антибиотикам, рекомендованным для лечения синегнойной палочки. Модельным животным, зараженным этим штаммом, ежедневно, в течение 5 дней, проводили очищение ран раствором, содержащим заявляемый бактериофаг ph57 с титром 2,4×10⁷ БОЕ/мл. Через 5 дней произошло полное очищение ран от гнойно-некротического содержимого.

Пример 4. Были пролечены двое больных с диагнозом панкреонекроз, у которых после ряда санаций брюшной полости и взятия посевов стала высеиваться синегнойная палочка. Больным дважды промывалась брюшная полость раствором, содержащим бактериофаг ph57 с титром 1,4×10⁷ БОЕ/мл. На последующих релапаротомиях установлено, что у данных больных в брюшной полости имелся адгезивный безфибриновый процесс, а последующие посевы микрофлоры имели чувствительность к антибактериальной терапии.

Во всех случаях применения антисептического средства на основе заявляемого фага ph57 отмечался выраженный положительный клинический эффект. У пациентов с инфекциями мочеполовых путей и пневмонией быстро улучшалось общее состояние, температура снижалась, явления воспаления в пораженных органах стихали. У больных с гнойными ранами происходило очищение от некротизированных тканей, появлялись грануляции, ускорялось заживление.

Кроме оценки клинического эффекта на отдельных больных проводилась оценка возможности достижения противоэпидемического эффекта на популяции пациентов гнойного отделения травматологического стационара. После начала применения антисептического средства синегнойного фага ph57 в стационаре отмечалось резкое снижение частоты внутрибольничных заражений гнойно-септическими инфекциями, вызванными P.aeruginosa, с 40,8 до 8,9%.

Заявляемый штамм бактериофага ph57, обладающий широким спектром литической активности в отношении синегнойной палочки, может быть использован в качестве основы для приготовления антисептического средства для лечения гнойно-септических инфекций.

Таблица 1 № п/п Время инкубации, мин Титр, БОЕ/мл 1 0 (исх) 1,0×10⁸ 2 5 1,2×10⁸ 3 10 1,0×l0⁸ 4 20 1,1×l0⁸ 5 30 1,7×10⁸ 6 60 2,9×10⁷ 7 90 2,9×10⁷

Таблица 2 Время Титр, БОЕ/ мл pH 1 рН 3 РН 4,5 рН 8 рН 9,5 pH 11 1 час 0 0 1,2×10⁸ 1,6×10⁸ 2,0×10⁶ 0 48 час - - 5,6×10⁶ 1,15×10⁸ 1,7×10⁶ -

Таблица 3 № п/п Количество замораживаний Титр, БОЕ/мл 1 0(исх) 2,0×10⁷ 2 1 7,4×10⁷ 3 2 8,7×10⁷ 4 3 6,6×10⁷ 5 4 2,4×10⁶ 6 5 1,4×10⁶ 7 6 8,5×10⁴ 8 7 3,4×10⁴ 9 8 8,6×10³ 10 9 6,0×10³

Таблица 4 № п/п Время инкубации, мин Титр, БОЕ/мл 1 0(исх) 2,0×10⁷ 2 15 2,7×10⁷ 3 30 1,6×10⁷ 4 60 1,87×10⁷ 5 Сутки 1,4×10⁷

Таблица 5 № п/п Время инкубации, мин Титр, БОЕ/мл 1 0(исх) 2,0×10⁷ 2 5 4,0×10⁶ 3 10 1,6×10⁵ 4 15 7,0×10⁴ 5 35 4,6×10³ 6 60 0

Таблица 6 № п/п Время инкубации, мин Титр, БОЕ/мл 1 0(исх) 2,0×10⁷ 2 15 2,0×10⁴ 3 30 0 4 60 0

Таблица 7 № п/п Штамм Р. aeruginosa (клинические изоляты) Литическая активность ph 57, БОЕ/ мл 1 671 5,4×10⁷ 2 662 2,0×10⁸ 3 663 2,6×10⁸ 4 664 4,8×10⁵ 5 665 2,6×10⁸ 6 666 1,54×10⁸ 7 667 4,1×10⁵ 8 668 5,2×10⁵ 9 669 8,0×10⁴ 10 670 1,8×10⁸

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и касается штамма Pseudomonas aeruginosa. Предложен высоковирулентный штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa ph57, выделенный из экскрементов животных вивария, задепонированный в коллекции НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» под регистрационным номером V-357. Представленный штамм обладает широким спектром литической активности в отношении бактерий Pseudomonas aeruginosa и может быть использован в качестве основы для приготовления антисептического средства против синегнойной палочки. 7 табл., 4 пр.

Штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa, депонированный в коллекции НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» под регистрационным номером V-357, обладающий литической активностью в отношении бактерий Pseudomonas aeruginosa, используемый в качестве основы для приготовления антисептического средства против синегнойной палочки.