ШТАММ БАКТЕРИОФАГА PSEUDOMONAS AERUGINOSA ГНЦ ПМ N 02, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ПРИ ИЗГОТОВЛЕНИИ ПОЛИВАЛЕНТНОГО ЛЕЧЕБНОГО ПРЕПАРАТА ПРОТИВ СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ Российский патент 1998 года по МПК C12N7/00 A61K35/76 A61K39/104 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к лечебным фагам.

Известен бактериофаг Pseudomonas aeruginosa при лечении гнойно-воспалительных заболеваний [1].

Недостатком подобных фагов является ограниченный спектр литического действия. Фаги, как правило, были выделены из образцов сточных вод. При практическом применении таких бактериальных вирусов велика вероятность их инактивации неспецифическими факторами крови, гноя и т.п. [2].

Цель настоящего изобретения - вирулентный бактериофаг ⊘ 02 Pseudomonas aeruginosa с широким литическим спектром. Фаг выделен из образца гнойного отделяемого раны, т. е. из той экологической ниши, в которой бактериальный вирус активен и в дальнейшем будет использован как антимикробный агент. Фаг депонирован в коллекции фагов ГНЦ ПМ под номером 02.

Бактериофаг ⊘ 02 характеризуется следующими свойствами.

Морфологические признаки.

Размеры основных структурных элементов фага представлены в таблице. Фаг имеет изометричную головку и сокращающийся хвостовой отросток (морфотип А1). От базальной пластинки ⊘ 02 берут начало 6 хвостовых фибрилл длиной 50 - 55 нм. Фаг не имеет воротничка.

Закономерности взаимодействия фага ⊘ 02 с клеткой-хозяином.

На газоне чувствительных бактериальных культур P.aeruginosa фаг ⊘ 02 образует прозрачные пятна лизиса диаметром 1 - 1,5 мм.

Штаммы P.aeruginosa, лизогенные по ⊘ 02, не выявлены.

При воспроизведении фага в клетке-хозяине продолжительность латентного периода составляет 45 - 55 мин, урожайность - 80 - 90 частиц на одну клетку.

Серологические свойства ⊘ 02.

Константа инактивации фага гомологической антисывороткой (К) составляет 100 мин^-1.

Химический состав фага.

Для оценки типа нуклеиновой кислоты очищенный фаговый препарат был окрашен акридиновым оранжевым. Характер флуоресценции мазков при ультрафиолетовом облучении свидетельствовал о тои, что фаг ⊘ 02 содержит ДНК. Белковый состав вириона исследован на основе электрофореза в 10% полиакриламидном геле с SDS. Выявлено 9 белков с молекулярными массами (в килодальтонах): 77; 70; 63; 49; 42,5; 38; 36; 34 и 27.

Физико-химические свойства фага.

Фаг ⊘ 02 не инактивируется при нагревании суспензии в течение 30 мин при 60^oC. Литическая активность бактериального вируса не изменяется в пределах pH 5-9. Фаг устойчив к хлороформу, который, следовательно, можно использовать в качестве консерванта.

Литический спектр бактериофага ⊘ 02.

Для оценки литического спектра ⊘ 02 использована коллекция клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa, включающая 100 изолятов. Данная коллекция сформирована частично за счет штаммов, представленных ГосНИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевача. Другой источник получения клинических изолятов P.aeruginosa - образцы гнойного отделяемого ран от разных больных, собранные на территории Московской области.

Из данных, полученных титрованием методом агаровых слоев, следует, что фаг ⊘ 02 лизирует 89% штаммов данной коллекции.

Таким образом, широта литического спектра действия в сочетании с высокой воспроизводимостью фага в клетке и устойчивостью к действию физико-химических факторов среды позволит считать ⊘ 02 перспективным бактериальным вирусом в создании поливалентного лечебного препарата фагов.

Пример 1. Изготовление препарата фага ⊘ 02.

Выращивание фага ⊘ 02 в мясо-пептонном бульоне проводят с использованием термостатируемой качалки.

Режим культивирования: температура 30^oC, частота вращения колб - 100 об/мин. Первоначально в колбы со средой вносят по 2,5 - 3 см³ ночной культуры Pseudomonas atruginosa и выращивают клеточную биомассу в течение 5-6 ч. В данных условиях концентрация клеток обычно составляет 10⁸ - 5•10⁸ кл/см³. На следующем этапе в клеточные суспензии вносят фаг (множественность заражения 1:100), после чего систему продолжают инкубировать в том же режиме в течение суток. Обычно концентрация ⊘ 02 в полученных лизатах составляет 10¹⁰ - 5•10¹⁰ част./см³.

Пример 2. Титрование фага ⊘ 02 методом агаровых слоев.

Первоначально готовят разведения анализируемой фаговой суспензии в физиологическом растворе. Пробу (0,1 см³) соответствующего разведения смешивают с 0,2 см³ ночной культуры Pseudomonas aeruginosa. В полученную суспензию вносят 2,5 см³ расплавленного до 42^oC мясо-пептонный 0,7%-ный агар и после быстрого перемешивания содержимое пробирки выливают на поверхность 1,5%-ного мясо-пептонного агара в чашке Петри. После застывания верхнего слоя чашку переворачивают и инкубируют в термостате при 30^oC в течение 16 - 18 ч. Пятна лизиса фага ⊘ 02 на газоне бактериальной культуры подсчитывают для определения концентрации (титра) бактериального вируса в анализируемой системе.

Пример 3. Проведение теста на лизогению.

При титровании начальных разведений образцов фага ⊘ 02 выявляются фагорезистентные формы синегнойной палочки с частотой 10^-7. Произвольно отбирают 30 колоний фагоустойчивых штаммов P.aeruginosa из разных чашек. Штаммы трехкратно пассируют на чашках с МПА и затем анализируют на наличие умеренных фагов.

Суспензии клеток первоначально инкубируют в мясо-пептонном бульоне при 37^oC в течение 3 ч. Затем в системы вносят митомицин C до конечной концентрации 1 мкг/см³ и продолжают инкубировать культуры еще 2,5-3 ч.

На следующем этапе клетки отделяют центрифугированием (5 тыс.g, 10 мин), а фракции надосадочной жидкости анализируют на наличие фагов титрованием на индикаторных (чувствительных) штаммах P. aeruginosa. С другой стороны, фракции супернатанта изучают под электронным микроскопом.

Проверка ⊘ 02 - устойчивых клонов P.aeruginosa, проведенная по данной схеме, показала, что фаг ⊘ 02 не лизогенизирует клетки синегнойной палочки. Это дает основание считать ⊘ 02 вирулентным бактериофагом.

Источники информации:
1. Основные направления научных исследований по проблеме бактериофагии Тбилисского НИИВС МЗ СССР. - Чинишвили Т.Г. Бактериофаги: теоретические и практические вопросы - М., 1983, с.1-26.

2. H. W. Ackermann, M.S.Dubow. 1987. Viruses of Prokariotes. vol.1 General properties of bacteriophages. CRC PRESS, Boca Raton, FL.P.152.

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а имеено к лечебным фагам. Новый бактериафаг ГНЦП N 02 имеет широкий спектр литического действия по отношению к патогенным штаммам Pseudomonas aeruginosa. Бактериофаг депонирован в колекции фагов ГНЦ ПМ под номером 02. Целесообразность использования фага 02 как элемента поливалентного лечебного препарата подтверждается тем, что данный бактериальный вирус лизирует 89% клинических изолятов. 1 табл.

Штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa ГНЦ ПМ N 02, используемый при изготовлении поливалентного лечебного препарата против синегнойной палочки.