СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОДЕПРЕССАНТА ЦИКЛОСПОРИНА А И ШТАММ TOLYPOCLADIUM SPECIES СВS630.92, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ЦИКЛОСПОРИН А Российский патент 1998 года по МПК C12P21/04 C12N1/14 C12P21/04 C12R1/645 

Настоящее изобретение описывает новый микробиологический вид Tolypocladium и процесс получения циклоспоринов, главным образом циклоспорина A, при помощи аэробной ферментации штамма этого вида.

Циклоспорины представляют собой нейтральные, сильно липофильные, циклические ундекапептиды с варьируемым аминокислотным составом. К настоящему времени известно 25 различных форм циклоспоринов (A - Z), причем A-форма для клинических целей представляется наиболее значительной (Rehacek and De-xiu, Process Biochem, 1991, 26, 157 - 66).

Первоначально циклоспорин был выделен в 70-х годах из грибковых штаммов Cylindrocarpon lucidium Booth и Tolypocladium inflatum Gams, выделенных из образцов почв США и Норвегии. Продуктивный штамм Tolypocladium inflatum (NRRL 8044, ATCC 34921) был первоначально определен как штамм Trichoderma polysporum (link ex Pers) Rifai. Указанный штамм и антибиотики, им производимые, описаны, например, в патенте FI 54606. Условия выращивания и таксономия этого штамма описаны также в статье Dreyfuss et al., Eur, J, Appl. Microbiol., 1976, 2, 125.

Упомянутый выше Cylindrocarpon lucidum Booth (NRRL 5760) описан в патенте FI 52851. Другие описанные в литературе микробиологические штаммы, производящие циклоспорины, например, штамм Tolypocladium inflatum SF 136, продуцирующий по крайней мере циклоспорин A, описан в патенте DD 298276, a Tolypocladium varium, продуцирующий помимо прочного циклоспорины A, B и C, - в заявке GB N 2227489. В заявке JP 8263093 A2 описаны два продуцирующие циклоспорин штамма Fusarium.

В обзорной статье Isaac et al. (Antimicr. Agents Chemoter,. 1990, 34, 121 - 7) сравнивается выработка циклоспорина некоторыми известными штаммами Tolypocladium.

Циклоспорин A первоначально был описан как антигрибковый антибиотик. Его превосходное иммунодепрессивное действие было обнаружено позже (Borel et al. , Immunology, 1977, 32, 1917) и привело к широкому использованию в послеоперационном лечении при трансплантации органов, причем это - почти единственный эффективный медикамент для этих целей. Это было впервые продемонстрировано при пересадке почек (Calne, Lancet, 1972, 2, 1327) и костного мозга (Powles, Lancet, 1978, 2, 1327). Помимо трансплантации циклоспорин может быть также использован для лечения аутоиммунных болезней, таких как ревматизм и псориаз.

Получение циклоспорина A при помощи микробиологических штаммов в ряде случаев осложнено низким выходом и большой продолжительностью ферментации, причем даже если высокий выход и достигается, относительное количество циклоспорина часто бывает малым. Показано также, что штаммы, дающие низкий выход циклоспорина, продуцируют циклоспорин A в относительно большем содержании (De-xiu et al., Folia Microbiol., 1991, 36 (6), 549 - 556).

Наше изобретение направлено на отыскание продуктивного штамма, способного давать максимальный выход при коротком времени ферментации и экономных условиях.

При поиске потенциальных продуктивных штаммов был найден штамм Tolypocladium, исключительно быстро дающей высокий выход циклоспорина A наряду с относительно низким количеством других форм циклоспоринов, что позволяет легкую его очистку. Этот штамм был выделен из образца почвы, отобранного в России вблизи Москвы.

При изучении выделенного штамма в Голландии доктором В. Гамсом в Центральном бюро плесневых культур в Баарне (Centraalbureau voor Schimmelcultures) оказалось, что микроб представляет новый вид Tolypocladium. Штамму было дано название Tolypocladium sp. LeA3 и он в соответствии с Будапештским договором был депонирован в депозитарии Центрального бюро плесневых культур 7 декабря 1992 г. под N CBS 630.92
Изобретение, таким образом, связано с новым видом Tolypocladium, дающим быстро высокий выход, и его использованием для производства клинически наиболее важного циклоспорина A.

Род Tolypocladium был впервые открыт В. Гамсом в 1971 г. (W. Gams, Persoonia, 1971, vol. 6, part 2, 185 - 191), описавшим в публикации три вида: T. inflatum, T. geodes и T. cylindrosporum. Обычно виды Tolypocladium медленны в росте, образуют белые флокулярные колонии с большим числом спор.

Штамма Tolepocladium sp. LeA3 был сопоставлен с вышеупомянутыми видами и обнаружил явные от них отличия, давая пониженную способность к спорообразованию, набухшие клеточные цепи и темноватые колонии, имеющие склонность к образованию пигмента, коричневато-серого в отраженном свете. Рассматриваемый штамм, следовательно, был признан как представитель нового вида Tolypocladium.

Согласно изобретению штамм Tolypocladium sp. LeA3 может быть описан следующим способом: семидневная колония, выращенная на солодовом и дрожжевом экстрактах, имеет диаметр около 10 мм и покрыта сероватым мицелием, содержащим несколько спор. Неравномерные конидии и набухшие клеточные цепи типичны для этого штамма. В отличие от Tolypocladium inflatum открытый штамм не потребляет рафинозу, но способен потреблять галактозу. Возможности выращивания штамма Tolypocladium sp. LeA3 в сравнении с возможностью выращивания Tolypocladium inflatum и Cylindrocarpon lucidum представлены в табл. 1.

В соответствии с предлагаемым изобретением для получения циклоспоринов, преимущественно циклоспорина A, штамм нового вида Tolypocladium, выделенный из Tolypocladium sp. LeA3 CBS 630.92, и штаммы, имеющие все необходимые для идентификации характеристики штамма LeA3 CBS 630.92, культивировали в аэробных условиях при температуре 20 - 30^oC в питательной среде, содержащей источник углерода, источник азота и минеральные соли, а продуцируемые циклоспорины при необходимости выделяли и очищали.

В предпочтительном осуществлении согласно изобретению используется штамм Tolypocladium sp. LeA3 CBS 630.92. Этот штамм особо предпочтителен для достижения целей изобретения, поскольку дает высокий выход циклоспоринов уже через несколько дней культивации. Кроме того, он пропорционально продуцирует и значительное количество циклоспорина A. И хотя штамм продуцирует и другие формы циклоспорина (B, C, D и G), их количество значительно более низкое по сравнению с описанными штаммами (цит. выше Isaac et al.). Так, C-форма только 10%, B-форма 4%, а D и G вместе 2%, и это несмотря на то, что выход циклоспорина A столь высок, что достигает 1,5 г/л.

Предлагаемый штамм имеет преимущество и в том, что быстро растет в самых обычных питательных средах. Штамм способен, например, потреблять глюкозу, сахарозу, арабинозу, ксилозу и галактозу (табл. 1) в качестве источника углерода, также как органические и неорганические источники азота, такие как пептон, соевая и рыбная мука, мука из хлопковых семян и сульфат аммония.

Помимо этого питательная среда содержит обычно используемые минеральные соли, такие как сульфат магния или дигидрофосфат калия.

Предпочтительно использовать недорогую мелассу в качестве источника углерода и соевую муку в качестве источника азота.

В предпочтительной процедуре споры и инокулированный мицелий вводятся в среду для предварительной культивации, получаемую суспендированием в воде коллекционной культуры Tolypocladium sp. LeA3. Предварительная культивация длится 2 - 4 дня, после чего полученной жидкостью инокулируют питательную среду. Основная культивация осуществляется при температуре около 20 - 30^oC, предпочтительно 25 - 30^oC, в частности при 25^oC 5 - 7 дней (т.е. 120 - 168 ч), при поддержании pH в пределах 3 - 8, предпочтительно 4 - 7, посредством введения 1 М гидроксида натрия или 1 М соляной кислоты.

Аэробные условия поддерживаются при помощи аэрации со скоростью, например, 1 объем воздуха на 1 объем культуральной жидкости за минуту, которая также перемешивается со скоростью 200 - 350 об/мин.

В течение процесса ферментации концентрацию циклоспорина контролировали при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), как, например, описано Исааком с сотр. (цит. выше). Ферментация продолжается до достижения максимальной концентрации циклоспорина. Предлагаемый штамм продуцирует циклоспорин A в концентрации до 1500 мг/л в течение 6 дней, причем относительное содержание циклоспорина A составляет 84%.

Смесь циклоспоринов может быть выделена и очищена традиционными методами. Мицелий отделяется от культуральной жидкости фильтрованием или центрифугированием. Циклоспорины экстрагируют из мицелия низшим спиртом, например метанолом, этанолом или изопропанолом, предпочтительно метанолом. Экстракт концентрируется, и циклоспорины экстрагируют водонерастворимым органическим растворителем, например бутил- или этилацетатом, предпочтительно этилацетатом. После упаривания остаток растворяют в подходящем органическом растворителе, например толуоле, и циклоспорин A выделяют при помощи колоночной хроматографии, например, на силикагеле. Фракцию, содержащую целевой циклоспорин A, анализируют при помощи тонкослойной хроматографии, после чего собранные фракции концентрируют и перекристаллизовывают циклоспорин A из подходящего растворителя или смеси растворителей, например эфир-гексана.

В заключении у полученного продукта определяют температуру плавления и оптическое вращение.

Пример 1.

Спора и инокулированный мицелий были приготовлены суспендированием культуры Tolypocladium sp. LeA3 (CBS 630.92) в 5 мл стерильной воды, после чего 1 мл этой суспензии использовали для инокулирования 50 мл питательной среды (EI) в 250-миллилитровой колбе Эрленмейера.

Состав среды для предварительной культивации (EI):
Глюкоза, г - 30
Соевая мука, г - 15
Дигидрофосфат калия, г - 1
Сульфат магния, г - 0,5
Сульфат аммония, г - 5
Вода, л - До 1
Среда была стерилизована при 121^oC в течение 20 мин.

Культуру инкубировали на качалке (340 об/мин) при 25^oC в течение 2 дней, после чего культуральную жидкость (50 мл) в стерильных условиях перенесли в 5 л среды Т1 в 10-литровом ферментаторе.

Состав среды Т1 для получения циклоспоринов:
Меласса, г - 150
Соевая мука, г - 17
Сульфат аммония, г - 5
Дигидрофосфат калия, г - 1
Сульфат магния, г - 0,5
Вода, л - До 1
Среда была предварительно стерилизована 20 мин при 121^oC.

Культивацию осуществляли при 25^oC, аэрации 1 объем/мин, перемешивании 200 об/мин. Концентрацию циклоспорина в культуральной жидкости контролировали при помощи ВЭЖХ (цит. выше Isaac et al.). Время ферментации 6 сут (144 ч), концентрация циклоспорина A достигла 1500 мг/л. Концентрации других форм: C - 155 мг/л, B - 62 мг/л, D - 28 мг/л и G - 29 мг/л.

Смесь циклоспоринов была выделена и очищена следующим способом: 4,5 л среды фильтровали и дважды экстрагировали метанолом по 1 л, объединенный экстракт концентрировали в вакууме, из остатка циклоспорины извлекали экстракцией 2 порциями этилацетата по 300 мл. Объединенный экстракт сушили над сульфатом натрия, раствор затем концентрировали и остаток растворяли в 100 мл толуола, после чего раствор вносили в колонну (5 см х 40 см) с 200 г силикагеля (Мерк, 0,063-0,2 мм) в толуоле. Элюирование осуществляли смесью толуол-ацетон 4:1. Фракции, содержащие чистый циклоспорин A, затем анализировали методом тонкослойной хроматографии на пластинке Kieselgel 60 F 254, растворитель гексан-ацетон 1:1, проявление в парах иода. Далее фракции концентрировали и циклоспорин A перекристаллизовывали из смеси эфир-гексан. Выход составил 4.5 г. Температура плавления циклоспорина A была 139 - 140^oC, оптическое вращение -189^oC (0,5 MeOH).

Пример 2.

Спора и мицеллий приготовлены, как в примере 1. Далее 1 мл суспензии использовали для инокулирования 50 мл питательной среды (E2) в 200-миллилитровой колбе Эрленмейера.

Состав среды E2 для предварительной культивации:
Мальтоза, г - 40
Сульфат аммония, г - 5
Мука из хлопковых семян, г - 10
Дигидрофосфат калия, г - 1
Сульфат магния, г - 0,5
Вода, л - До 1
Среда была стерилизована при 121^oC в течение 20 мин.

Культуру инкубировали при 25^oC на качалке (230 об/мин) в течение 2 сут, после чего раствор (50 мл) в стерильных условиях переносили в 5 л среды Т2 в 10-литровом ферментаторе.

Состав среды Т2 для получения циклоспоринов:
Глюкоза, г - 10
Мальтоза, г - 10
Сахароза, г - 60
Мука хлопковых семян, г - 10
Хлопковое масло, г - 5
Сульфат аммония, г - 5
Дигидрофосфат калия, г - 1
Сульфат магния, г - 0,5
Вода, л - До 1
Среда была стерилизована при 121^oC в течение 20 мин.

Культивацию проводили при 24^oC, аэрация 1 объем/мин, перемешивание 200 об/мин. Время ферментации 5 сут (120 ч), выход циклоспорина A 1410 мг/л. Концентрацию циклоспорина A контролировали при помощи ВЭЖХ (цит. выше Isaac et al. ). Концентрация других форм: C - 135 мг/л, B - 50 мг/л, G и D - 30 мг/л.

Циклоспорин A выделяли также, как в примере 1.

Сравнительные опыты.

Эксперименты были предприняты для сравнения скорости образования циклоспорина A грибковыми штаммами Tolypocladium inflatum Gams (ATCC 34921) и используемым в настоящем изобретении Tolypocladium sp. LeA3 (CBS 630.92) в одинаковых условиях.

Пример A. Культивация выполнена по С.Н. Агатосу с сотр. (J. Industrial Microbiology 1, 39 - 48, 1986) в среде, содержащей 3% (масса/объем) сорбозы. Согласно методике предварительная культивация составила 3 сут, основная - 10 сут.

Результаты были следующими (табл. 2 и 3).

Пример B. Культивация выполнена по А. Маргаритису с сотр. (Biochem. Letters 11 (11), 765 - 768, 1989) в среде с 3% фруктозы. Предварительная культивация продолжалась 3+2 сут, основная - 8 сут при регулируемом pH.

Результаты были следующими (табл. 4 и 5).

Пример C. Культивация проведена также, как в примере 1. Время предварительной культивации - 2 сут, основной - 6 (144 ч).

Результаты были следующими (табл. 6 и 7).

Результаты каждой параллельной культивации даны как среднее из трех параллельных определений.

Таким образом, результаты ясно показывают, что представленный штамм Tolypocladium sp. LeA3 (CBS 630.92) продуцирует во всех трех испытанных средах исключительно большое количество циклоспорина A, измеряемого в мг на 1 л культуральной жидкости. Особенно третья культивация показала, что предлагаемый штамм дает возможность получать значительные количества циклоспорина A за короткое время. Tolypocladium inflatum Gams растет хорошо во всех испытанных средах, но скорость образования остается низкой для циклоспорина A. Удельные скорости образования в мг на 1 г сухой биомассы были также вычислены для целей сравнения, хотя эта величина не имеет особого значения для характеристики штамма как продуцента циклоспорина. Штамм Tolypocladium sp. LeA3 тем не менее во всех опытах показал большую удельную скорость образования, чем Tolypocladium inflatum Gams.

Депонированные микроорганизмы.

Микроорганизм, депонированный согласно Будапештскому договору в депозитарии Центрального бюро плесневых культур (CBS); Oosterstaat 1, P. O. Box 273, NL-3740 AG Baarn, The Netherlads.

Микроорганизм Tolypocladium sp. LeA3. Депозитный N CBS 630.92. Дата депонирования 7 декабря 1992 г.

Способ получения иммунодепрессанта циклоспорина А осуществляют культивированием штамма продуцента Tolypocladium species CBS 630.92 в питательной среде аэробно. Питательная среда содержит в качестве источников углерода и азота мелассу и соевую муку или сахарозу и муку из хлопковых семян соответственно. После культивирования производят выделение и очистку циклоспорина А. 2 с. и 2 з.п. ф-лы, 7 табл.

1. Способ получения иммунодепрессанта циклоспорина А, включающий культивирование штамма-продуцента рода Tolypocladium аэробно в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что культивируют штамм Tolypocladium sp. LeA3 CBS 630.92. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что питательная среда в качестве источников углерода и азота содержит мелассу и соевую муку соответственно. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что питательная среда в качестве источников углерода и азота содержит сахарозу и муку из хлопковых семян соответственно. 4. Штамм Tolypocladium species LeA3 CBS 630.92, продуцирующий иммунодепрессант циклоспорин А.