Способ получения комплексного антибиотика циклоспорина и/или его компонентов и штамм грибка ТоLYросLаDIUм VаRIUм Советский патент 1993 года по МПК C12P1/00 

Изобретение относится к способу пол- учен,ия комплексного антибиотика циклоспорина и/или i:ero компонентов циклоспорина А, циклоспорина В и циклоспорина С, аэробной ферментацией.

Отдельные компоненты комплекса представляют состоящие из 11 аминокислот циклические, нейтральные, неполярные олигопептиды, которые отличаются друг от друга только одной или двумя участвующими в построении аминокислотами.

Из компонентов комплексного антибиотика циклоспорин А и циклоспорин С были выделены сначала A. Ruegger и др. и цикло- спорины В, D, Е и С R. Traber и др. из культуры идентифицированного ими раньше как Trichoderma polysporum (Link ex Pers.) Rifae грибка (NRRL 8044). Позднее была уточнена систематическая классификация соответствующего штамма грибка (NRRL 8044), и с тех пор он был назван в литературе как Totypocladlum Inflatum Gams.

В настоящее время известны уже 25 циклоспоринов, которые обозначаются буквами от А до Z.

Из компонентов, самым ценным по действию является имеющий избирательную иммуноподавляющую активность циклоспорина А.

Циклоспорин был известен сначала как антибиотик со слабым противогрибковым действием, его значительное иммуноподав- ляющее действие было открыто лишь позднее.

При помощи целой серии опытов на живом организме и в пробирке можно было доказать, что циклоспорины А, С и G явля(Л

С

00

со о

Јь

К)

ел

СО

ются более специфическими активными веществами, чем известные до сих пор имму- ноподавляющие лекарственные средства. Оказалось, что циклоспорин А подавляет как гуморальный, так и целлюлярный иммунный ответ. При исследовании механизма действия было установлено, что он подавляет пролиферацию Т-клеток и прерывает синтез интерлейкина-2.

О применении циклоспорина А в качестве лекарственного средства при пересадке органов у человека сообщали в 1978. Первое применение было описано в связи с пересадкой почки и трансплантацией костного мозга. Применением циклоспорина А при пересадке органов можно препятствовать отторжению органа (почка, поджелудочная железа, печень, сердце, легкое), при трансплантациях костного мозга отторжению костного мозга.

Циклоспорин А с успехом применяли также для лечения определенных аутоиммунных заболеваний (например, воспаление сосудистого тракта глаза, ревматический артрит, чешуйчатый лишай и тяжелая миастения).

По патентной литературе для получения содержащих комплексный циклоспорин ферментационных бульонов применяли до сих пор культуры следуюадох штаммов микроорганизмов: Cylindocarpon lucldum Boath, NRRL5760 (патент Швейцарии № 589 716), Toiypocladlum inf latum Gams. NRRL 8044 по более старой номенклатуре: Trichoderma polysporium (Unk ex Pers) Rifai, патент Швейцарии fsfe 603790 no Bissett (1983) Toiynfeatum W, Gams, 1971 является синониумом с Tolyniveum (Rostrup) Bisset COOTB, nov. и Fusarium solani, MCf-1549, MIC-1550 (опубликованная заявка на патент Японии № 82 63093). Однако промышленное использование этих штаммов микроорганизмов в способах ферментации имеет тот недостаток, что времена ферментации продолжительные (11-14 дней), получают мало комплексного циклоспорина (около-20-30 .r/мл) и коэффициент полезного действия выделения комплекса из ферментационного бульона низкий (около 40%).

В ходе исследований искали штаммы микроорганизмов, при помощи которых можно получать комплексный антибиотик циклоспорин или его компоненты в высокой концентрации и при более выгодных условиях, чем до сих-пор, В процессе серийных исследований, которые распространялись на много тысяч штаммов грибка, смогли выбрать принадлежащий к виду Toiypocladlum микроорганизм, который за более короткое

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

время и в более значительном количестве биосинтезирует комплексный циклоспорин, чем известные штаммы, и который, как показали таксономические исследования, не идентичен ни с одним из известных продуцирующих циклоспорин штаммов грибка. Новый штамм (СУ/93) - который по собственным исследованиям следует рассматривать как член нового отличительного таксона рода Tolypocladium - был описан под названием Tolypocladium varlum species nova как голотипный штамм.

Изобретение основывается, следовательно, на том открытии, что з результате ферментации неизвестного до сих пор штамма типа Tolypocladium varlum species nova (домашнее название: СУ/93), который был депонирован под номером NCAIM(P)F 001005 в Будапештском Университете садоводства и пищевой промышленности в Национальном собрании сельскохозяйственных и промышленных микроорганизмов, можно получать ферментационный бульон с очень высокой концентрацией циклоспорина. Ферментационный бульон наряду с основным продуктом циклоспорина А содержит в небольших количествах циклоспорин В и циклоспорин С.

Используемые для систематизации признаки выделенного нового штамма грибка сравнивают ниже с важнейшими из диагностических характеристик известных видов Tolypocladium.

Род Toiypocladlum был описан в 1971 Gams как новый вид населяющих почву Monilales. Его характерными свойствами являются: медленный рост, полушкообрэзные белые или беловатые бактериальные колонии, конечные и боковые, расположенные частично на коротких боковых ветвях фиали- ды с сильно разбухшим основанием, на котором можно различить нитевидную, часто дугообразно наклоненную шейку, которая оканчивается маленькой одноклеточной конидией (головкой). Внутри этого рода Gams различал 3 следующих новых вида: Т. geodes, T. cylindrosporum, T. inflatum имеет поразительный, напоминающий об актино- мицетах запах земли, который полностью отсутствует у нового Т.varlum sp. nov. СУ/93. Кроме того, клетки носителя Т. geodes значаительно уже, чем клетки носителя Т. varium sp. nov, СУ/93. Конидии Т, cylindrosporum характерно длинные и растянутые, конидии Т. varium sp. nov. СУ/93, напротив, шаровидные или слабо растянутые. Конидии Т, inflatum эллиптические и длиннее, чем конидии Т. varium sp, nov.

СУ/93. Фиэлиды Т. Inflatum расположены или непосредственно на гифе или не клетках держателя длиной 2-3 м клубком.

Для фиалидов Т. varium sp. nov. СУ/93 расположение клубком не является характерным и наблюдается только в отдельных случаях. Бактериальные колонии всех известных до сих пор видов Tolypocladium белые, что объясняется, в первую очередь, белым, ватообразным воздушным мицелием. Нижняя сторона бактериальных колоний желтовато-серая, бесцветная или желтая, характерный растворимый пигмент не производится. И в этом отношении Т. varium sp. nov. СУ/93 отличается от известных видов: на питательных средах с глюкозой и пептоном, также на питательных средах с солодовым экстрактом/дрожжевым экстрактом грибок вырабатывает темный, варьируемый во времени от густого серого до черного цвета, пигмент.

Диагностические признаки Tolypocladium varium sp. nov. СУ/93 можно сообщить следующим образом. Бактериальные колонии возрастом 10 дней имеют диаметр 10-25 мм, их поверхность покрыта ватообразным белым, насыщенным спорами воздушным мицелием. Нижняя сторона бактериальных колоний желтовато-серая или грязно-серая. На многих комплексных питательных средах образуется темно-серый растворимый пигмент. На гифах воздушного мицелия спорообразование протекает как конечное, так и боковое. Фиалиды расположены местами или иногда также пучком на гифах или на коротких (длиной 2-3 fi м) клетках держателя. Фиалиды состоят из разбухшей основной части (2-4 х х2-3 fi м) и длиной нитевидной шейки (3-4 х 0,5-0,6 /и м). Колонии головок небольшие (2-3 х 1,3-2,2 /г м), в общем, шаровидные и ровные. Видовое определение Variun относится к изменчивости фиалидов .Tol. varium проявляет в своем жизненном цикле определенную схожесть с Genus harposporium, о чем позже еще будет говориться. Штамм СУ/93 не использует рафи- нозу, однако хорошо растет в присутствии источников углерода: Маннит, инозит, сахароза, фруктоза, рамноза, галактоза, глюкоза, арабиноза и ксилоза. На питательном агаре и солодовом агаре его культуры развиваются слабо, на соевом агаре, агаре С арек и картофельном агаре они растут усиленно. Овсяно-дрожжевой экстракт, глюко- зо-дрожжевой экстракт и овсяный агар не слишком подходит для сохранения.

Tol. varium резко отличается от Tot. Trogonosporum так как последний продуци5

0

рует Trigonale conidia, который имеет слабо изогнутые края, Tol. varium отличается также от Tot. balanoldes, так как последний продуцирует боковые фиамиды. 5Кроме того, отличается голотипный

штамм (СУ/93) Tolypocladium varium n. sp. от зарегистрированного тикового штамма (CBS 714.70) Т. Inflatum также тем, что последний образует на солодовом агаре 0 обильный белый воздушный мицеллий, в противоположность этому Т. varium sp. nov. СУ/93 не образует никакого мицелия. Тиковый штамм Т. Inflatum производит в субстрате мицеллия на железо-пептоновом агаре красновато-коричневый конечный пигмент.

В противоположность этому мицеллий- субстрат Т. varium sp. nov. СУ/93 остается бледножелтым.

Т.. varium sp. nov. СУ/93 не перерабаты вает араблюзу, в противоположность Т. inflatum.

5 Т. Inflatum дает с нитритом натрия обильный мицеллий, в противоположность этому Т. varium sp. nov. СУ/93 едва растет.

Сравнение с зарегистрированными

штаммами других видов Tolypocladluma, a

Q также со штаммами Trichoderma polysporum

АТСС 16641 и Cullndrocarpon lucidum MRRL

5760 приведено в таблице .

Предметом изобретения является спо5 соб получения комплексного антибиотика циклоспорина и/или его компонентов: циклоспорина А, циклоспорина В и циклоспорина С культивированием бйосинтезирующего названные антибиотики штамма грибка в со0 держащей усваиваемые источники углерода и азота и минеральные соли питательной среде, при аэробных условиях, и отделением образованных продуктов, Для способа отли- .чительной чертой является то, что продуци5 рующий комплексный антибиотик циклоспорин штамм нового вида грибка Tolypocladium varium, предпочтительно депонированный под номером NCAIM(P)F 001005 в Будапештском Университете садо0 водства и пищевой промышленности в Национальном собрании сельскохозяйственных и промышленных микроорганизмов штамм Totypocladium varium sp. nov, СУ/93, культивируют в содержащей источники углерода, а

5 также органические и неорганические источники азота и минеральные соли питательной среде, при аэробных условиях, при температуре 25-30°С, в случае необходимости выделяют образованный комплексный антибиотик или его компоненты из ферментационного бульона и в случав необходимости очищают.

По изобретению для получения комплексного антибиотика циклоспорина применяют предпочтительно культуру нового штамма Tolypocladlum varlifm -epv-nov-.- СУ/93. Этот штамм вследствие своего быстрого роста является особенно выгодным. Сахарозу, глюкозу, сорбозу, мальтозу, фруктозу, крахмал, глицерин и различные жиры и масла он хорошо использует как источник углерода. В качестве источников азота при нимают в расчет различные органические и неорганические источники азота, например, воду набухания кукурузы, пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, нитрат натрия, нитрат аммония, сульфат аммония и различны© аминокислоты. Кроме этих источников углерода и азота питательная среда может содержать еще минеральные соли (например, хлористый калий, сульфат магния или кислый фосфорнокислый калий), микроэлементы (например, медь, марганец и железо), а также витамины и пеногасящие вещества.

По предпочтительному варианту осуществления способа по изобретению от депонированного под номером NCA1M(P)F 001005 В Будапештском Университете садоводства и пищевой промышленности в Национальном собрании сельскохозяйственных и промышленных микроорганизмов штамма Tolypqclaclium varium sp. nov. СУ/93 делают посев культуры на косом агаре, суспензией спор и суспензией мицелия которого прививают питательную среду инокулята, затем добавляют культуру инокулята возрастом 3 дня к приблизительно десятикратному количеству среды продуцирования и инкубируют среду продуцирования при 25-30°С, предпочтительно 25°С, в течение 5-7 дней. Во время ферментации поддерживают величину рИ между 6,0 и 2,5, предпочтительно при 5,2. Ферментация происходит при аэробных условиях и при интенсивном перемешивании (950-1000 ). Потребность культуры в воздухе составляет около 300 л/час.

Во время ферментации за содержанием активного вещества в ферментационном бульоне наблюдают путем микробиологического измерения величии и путем жидкостной хроматографии при высоком давлении (НИХ). Когда содержание активного вещества достигло своего максимума, ферментацию прекращают и антибиотик выделяют методами экстракции и/или адсорбции.

Для микробиологического измерения величин используют оказанное циклоспорином А на многие гифомицеты избирательное торможение роста. В качестве тест-организмов наиболее подходящим являются AspergiHus nigor, Asperglllus japanlcus и Сип/uiarfa lunata. Для анализа жидкостной хроматографией при высоком давлении (HPLC) ферментационного бульона приме:

0 няют фильтрат разбавленных в отношении 1:10 метанолом проб (аппарат: 1KB, модель насоса 2150, модель ультрафиолетового детектора 2151; измерение при 220 нм; колонка BST - ЮС-Сз, 7 /и м; высота колонки 25 ° см, внутренний диаметр 0,4 см; жидкий элю- ент: ацетонитрил и триэтиламин фосфорной кислоты (рЫ 6,8) в отношении 65:35).

Экспериментальные опыты показали,

р. что новый штамм Tofypocladium varium sp. nov. СУ/93 дает с очень высоким выходом (950 i г/мл) комплексный антибиотик, содержащий в качестве основного продукта циклоспорин А и наряду с ним в качестве

g небольших компонентов циклоспорин В и циклоспорин С.

Выделение комплексного циклоспорина из ферментационного бульона целесообразно проводить экстракцией. Выгодно

0 перед экстракцией удэлять.;мицелий из питательной среды фильтрованием или центрифугированием. От.отдельной биомассы прилипший антибиотик целесообразно промывать низшими спиртами, особенно мета5 нолом, или кетонами, особенно ацетоном, в то время как для экстракции растворенных в питательной среде циклоспоринов находят применение несмешиваемые с водой растворители, например, этилацетат, ri-бу0 тилацетат, i-бутилацетат, дихлорметан, 1,2- дихлорэтанилихлороформ,

предпочтительно n-бутилацетат. Полученный экстракцией сырой продукт загрязнен продуцированными грибком красными и ли5 левыми пигментами. Последние можно удалять адсорбцией на. активном угле или силикагеле. Имеющиеся при случае в ферментационном бульоне примеси липидного характера (например, антивспениватели)

0 можно удалять диспергированием сырого продукта в петролейном эфире и содержащим 10% воды метаноле. Липидообразные примеси переходят в фазу петролейного эфира. Из воднометаноловой фазы метанов удаляют выпариванием в вакууме, остающуюся водную фазу экстрагируют дихлормета- ном и выпаривают экстракт. Из полученного таким путем очищенного продукта можно отделять циклоспорин А и другие образо5

ванные в меньшем количестве компоненты циклоспорина хроматографией на колонне или перекристаллизацией.

При сравнении с известными до сих пор способами способ по изобретению имеет ряд преимуществ, которые можно суммировать следующим образом:

1.Основное преимущество способа состоит в том, что штамм Tolypocladlum varlum sp. nov. СУ/93 дает в несколько раз более количество комплексного циклоспорина, получаемого известными до сих пор методами, при лабораторных условиях количества достигают до 950 р, г/мл.

2.Новый штамм дает комплексный циклоспорин благоприятного состава (около 85% комплекса состоят из циклоспорина А), и поэтому ферментационный бульон можно проще и экономичнее перерабатывать чем это имеет место при известных способах.

Выделенные продукты идентифицировали исследованиями ультрафиолетового спектра, инфракрасного спектра, спектра -ядерного магнитного резонанса и 13О ядерного магнитного резонанса, анализом аминокислот и жидкостной хроматографией при высоком давлении.

Изобретение поясняют подробнее на основании следующих примеров.

Пример 1. Из выращенной на содержащем солодовый экстракт и дрожжевой экстракт косом агаре возрастом 5-7 дней культуры штамма Toiypocladium varium sp. nov. СУ/93 (NCAIM(P)F 001005) приготовляют с 5 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия суспензию спор. При помощи 1 мл этой суспензии спор засевают 100 мл питательной среды с инокулятом, которая находится в колбе Эрленмейера объемом 500 мл.

Состав питательной среды с инокулятом 1C

глюкза40 г

казеиновый

пептон- 5 г

нитрат натрия3 г

кислый фосфорнокислый

калий2 г

хлористый

калий0,5 г

сульфат

магния 7Н200,5 г

сульфат железа (II) 7НаО0,01 г

в 1000 г водопроводной воды

Питательную среду устанавливают до рН 5,2 и после этого стерилизуют при 121°С в течение 25 минут.

Культуру встряхивают на аппарате для встряхивания (340 мин1, отклонение 3.5 см) при 25°С в течение 3 дней. При помощи 5 мл полученной культуры инокулята засеивают 15 колб Эрленмейера объемом 500 мл, в которых находятся по 100 мл стерильной питательной среды FCi.

Состав питательной среды FCi глюкоза80 г

трипказин40 г

мочевина2 г

сульфат аммония12 г

нитрат натрия3 г

кислый фосфорнокислый калий2 г

хлористый калий0,5 г

сульфат магния 7Н200,5 г

сульфат железа (И) 7Н200,01 г

в 1000 мл водопроводной воды. Питательную среду устанавливают до рН 5,2 и после этого стерилизуют при 121°С в течение 25 минут.

Колбы встряхивают на аппарате для встряхивания (340 мин 1, отклонение 3,5 см) при 25°С. За изменением содержания антибиотика в ферментационном бульоне наблюдают при помощи микробиологического метода диффузии в агаре. Метод диффузии в агаре для микробиологического измерения величин основывается на противогрибковом действии циклоспорина А, В качестве тест-организма применяют Asperglllusntger. Активность об- разованного комплексного циклоспорина измеряют относительно циклоспорина А- стандарта. Содержащие 2-8 /л г/мл циклоспорина А, приготовленные с водным спиртом стандартные растворы дают на со- держащей дрожжевой экстракт и глюкозу агаровой среде зоны торможения диаметром 16-25 мм.

Ферментацию продолжают 168 часов, потом выделяют образованный комплекс- ный антибиотик из ферментационного бульона.

Из одного литра ферментационного бульона, который при прекращении ферментации содержал 400 /и. г/мл комплекс- ного циклоспорина, получают антибиотики следующим образом;

Клетки удаляют фильтрованием из ферментационного бульона и прилипшие антибиотики отмывают 2 х 200 мл метанола. Из водно-метаноловой промывочной жидкости удаляют метанол при пониженном давлении и экстрагируют полученный водный концентрат 2 х 50 мл n-бутилацетата. Из фильтрата ферментационного бульона экстрагируют комплексный циклоспорин 200 мл п-бутилацетата. Экстракты соединяют, сушат над безводным сульфатом натрия и выпаривают при пониженном давлении при 40°С. Полученный сырой продукт(3,7 г)растворяют в 10 мл метанола, и липофмльные примеси удаляют элюированием с метанолом на слое геля из Sephadex LH-2Q (высота 40 см, диаметр 2,6 см). Содержащие комплексный циклоспорин фракции выпаривают при пониженном давлений при 40°С, Полученный комплексный циклоспорин разделяют на его компоненты на приготовленной из 20 г силикагеля (силикагель 40, Реанал, Будапешт) колонке элюированием повышающим градиенты хлороформа-метанола содержанием метанола. Элюирование начинают с 100 мл хлороформа и продолжают с 100 мл - количествами элюента, в котором содержание метанола при каждой стадии повышают на 0,5%. За содержанием циклоспорина в хроматографических фракциях следят при помощи тонкослойной хроматографии (пластины с силикэгелем 60 F254, DC алюминиевая фольга, Мерк; конструктор: зтилацетат м изопропанол 95:5, окраска: пары йода). Циклоспорин А отделяют от колонки содержащим 2,0% метанола хлороформом, циклоспорин В идет при 2,5% содержания метанола, и циклоспорин С можно найти во фракции с 3,0% метанола, Хроматографические фракции, содержащие отдельные компоненты циклоспорина в чистом виде, выпаривают в вакууме. Таким путем получают 225 мг циклоспорина А (точка плавления: 137-140°С; : - 189° (метанол); 25 мг циклоспорина В (точка плавления: 149-151°С)и 52 мг циклоспорина С (точка плавления:- 150-152°С).

При м е р 2. Описанным а примере 1 способом приготовляют на аппарате для встряхивания культуру инокулята. 200 мл этой культуры засевают 5 литров питательной среды с инокулятом 1C, которые находятся в лабораторной установке для ферментации объемом 10 литров, и стерилизуют при 1210Сэтечение 45 минут. Культуру перемешивают при 25°С с числом оборотов 750 и при этом аэрируют количеством воздуха 300 л/чае.

После 72 часов ферментации 500 мл полученной культуры инокулята применяют для засевания 5 литров питательной среды FC2, которая находится в лабораторной установке для ферментации объемом 10 л, и стерилизуют при 121°С в течение 45 минут. Состав питательной среды FC2 глюкоза80 г

трип казн н40-г-

мочевина2 г

сульфат

аммония12 г

нитрат натрия3 г

кислый

фосфорнокислый

калий2 г

хлористый

калий0,5 г

сульфат

магния 7Н200,5 г

сульфат

меди -7Н200,01 г

сульфат марганца (II) ,01 г

сульфат

железа (II) 7Н200,01 г

в 1000 мл водопроводной воды.

Величину рН питательной среды уста- навливают перед стерилизацией до 5,2. Посевную культуру перемешивают при 25°С с числом оборотов 750 и при этом аэрируют количество воздуха 300 л/час. Ферментацию продолжают в течение 144-168 часов и прекращают после достижения максимальной концентрации циклоспорина.

Из 4,8 литра ферментационного бульона, который к концу ферментации содержит 500 fi г/мл комплекстного циклоспорина, выделяют циклоспорин А следующим образом.

Клетки удаляют из ферментационного бульона фильтрованием, прилипшее на клетках содержание антибиотика вымывают 2x1 литром метанола. Из промывочной жидкости метанол удаляют при пониженном давлении и активное вещество экстрагируют из концентрата 2 х 250 мл п-бутилацетата.

Из фильтрата ферментационного бульона комплексный циклоспорин экстрагируют 2 х 500 мл л-бутилацетатом. Экстракты соединяют, сушат над безводным сульфатом натрия и выпаривают при пониженном давлении при 40°С. Полученный сырой продукт (19,2 г) предварительно очищают методом хроматографии на колонне на 100 г силикагеля 60 (размер частиц: 0,,2 мм) с хло- реформой: метанолом; ацетоном 92:4:4 в качестве элюента. Содержащие комплексный циклоспорин фракции (тонкослойная хроматография на пластинах из силикагеля 80 F254, DC-алюминиевая фольга (Мерк); конструктор: гексан и ацетон в отношении 2:1, окраска: хлор и толидин) выпаривают досуха. Из остатка от выпаривания (5,28 г) отделяют методом хроматографии на колонне циклоспорин. Колонна содержит 115 г

силикагеля 60 (размер частиц: 0,063-0.2 мм). В качестве растворителя применяют содержание ацетона, повышающее градиент гек- сана-ацетона. Циклоспорин А промывают содержащим 23 % ацетона n-гексаном из ко- лонны. Выпариванием содержащих циклоспорин А фракций получают 1,46 г циклоспорина А.

Пример 3. Из выращенной на содержащем солодовый экстракт и дрожжевой экстракт косом агаре возрастом 5-7 дней культуры штамма Toiypocladium varlum sp. nov. СУ/93 (NCAIM(P)F 001005) приготовляют с 5 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия суспензию спор. Суспензию спор применяют для посева 800 мл питательной среды 1C указанного в примере 1 состава,- которая находится в колбе Эрленмейера объемом 3 литра и которая предварительно была стерилизована. Колбу встряхивают в аппарате для встряхивания (340 , отклонение3,5 см) при 25°С в течение 2,5 дней. Полученной культурой инокулята засевают 5 литров питательной среды РСз. Питательная среда находится в лабораторной установке для ферментации объемом 10 л и была предварительно стерилизована при 121°С в течение 45 минут.

Состав питательной среды РСз

сорбоза60 г

трипказин40 г

мочевина2 г

сульфат

аммония12 г

нитрат натрия3 г

кислый фосфор-.

нокислый

калий2 г

хлористый

калий0,5 г

сульфат

магния 7Н200,5 г

сульфат

марганца (II) 7НгО0,01 г

сульфат

железа(Н) 7Н200,01 г

в 1000 мл водопроводной воды.

Посевную культуру поддерживают тер- мостатом при 25°С, перемешивают (1000 ) и аэрируют 300 литрами/час воздуха. Культуру ферментируют 120-168 часов, после этого ферментационный бульон по микробиологическим измерениям величин содержит 600 / г/мл комплексного циклоспорина. Из одного литра ферментационного бульона описанным в примере 2 способом получают 310 мг циклоспорина А.

0

° с

0

5

0

5

o 5

Пример 4. Из выращенной на содержащем солодовый экстракт и дрожжевой экстракт косом агаре возрастом 5-7 дней культуры штамма Tolypocladlufri varlutn sp. nov. СУ/93 (NCAIM(P)F 001005) приготовляют с 5 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия суспензию спор, Суспензию спор применяют для посева 500 мл питательной среды 1C указанного в примере 1 состава, которая находится в колбе Эрленмейера объемом 3 литра и была предварительно стерилизована. Колбу встряхивают в аппарате для встряхивания (340 , отклонение 3,5 см) при 25°С в течение 3 дней. Полученной культурой инокуляра засевают 5 литров питательной среды FC. Питательная среда находится в лабораторной установке для ферментации объемом 10 литров и она была предварительно стерилизована npw 121°C в течение 45 минут.

Состав питательной среды FC4

мальтоза80 г

трипказин40 г

мочевина2 г

сульфат

аммония12 г

нитрат натрия3 г

кислый фосфорнокислый

калий2 г

хлористый

калий0.5 г

сульфат

магния 7НаО0,5 г .

сульфат

меди (Я) -7Н2О0,01 г

сульфат

марганца (Н) 7H2U0,01 г

сульфат

железа (II) 7Н200,01 г

в 1000 мл водопроводной воды.

Питательную среду перед стерилизацией устанавливают до величины рН 5,2. Посевную культуру подвергают ферментации при 25°С и при перемешивании (1000 ) и аэрации (300 л/час) в течение 144 часов. В конце ферментации ферментационный бульон по микробиологическим измерениям величин содержит 620 ц г/мл комплексного циклоспорина. Из одного литра ферментационного бульона описанным в примере 1 способом получают 305 мг циклоспорина А.

Пример 5. Из выращенной на содержащем солодовый экстракт и дрожжевой экстракт косом агаре возрастом 5-7 дней культуры штамма Toiypocladium varium sp. nov. СУ/93 (NCAIM(P)F 001005) приготовляют с 5 мл 0,9%-ного раствора хлористого

натрия суспензию спор. Суспензию спор применяют для засевания 500 мл питательной среды 1 С указанного в примере 1 состава, которая находится в колбе Эрленмейера объемом 3 литра. Колбу встряхивают при 25°С на вибрационной машине с мельничным ситом (430 мин 1, отклонение 3,5 см) в течение 2 дней. Полученной культурой ино- кулята засевают 5 литров питательной среды FCi. Питательная среда находится в лабораторной установке для ферментации объемом 10 литров и она была предварительно стерилизована при 121 °С в течение 45 минут. Посевную культуру подвергают ферментации при 25°С при перемешивании (750 ) и аэрации (300 л/час). В .96-й час добавляют 2% отдельно стерилизованной мальтозы, затем производят ферментацию до 144-го часа. Ферментационный бульон содержит к этому моменту по микробиологическим измерениям величин 950 ft г/мл комплексного циклоспорина. Из 2,8 литра ферментационного бульона описанным в

0

0

примере 2 способом выделяют 2,75 г циклоспорина А.

Формулаизобретения

1.Способ получения комплексного антибиотика циклоспорина и/или его компонентов, включающий культивирование продуцента при аэробных условиях в питательной среде, содержащей усваиваемые источники углерода, азота и минеральной соли с последующим выделением целевых продуктов, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют грибок Tolypocladium varlum NCAiM(P)F 001005, при этом культивирование осуществляют при температуре 25-30°С.

2.Способ по п. 1,отличающийся тем, что в качестве источника азота применяют пептон, сульфат аммония, трипказин, в качестве источника углерода - глюкозу, мальтозу, сорбит.

3.Штамм грибка Tolypocladium varium NCAIM(P)F 001005 - продуцента комплексного антибиотика циклоспорина и/или его компонентов.

Продолжение таблицы

Использование: фармацевтическая и микробиологическая промышленность. Сущность способа: заключается в том, что грибок Tolypoctadlum varium NCAIM/P/F 001005 культивируют в аэробных условиях при t 25-30°C в питательной среде, содержащей в качестве источника азота пептон, сульфат аммония, трипказин, а в качестве источника углерода - глюкозу, мальтозу, сорбит. 2 с.п. ф-лы и 1 з.п. ф-лы, 1 табл.