ШТАММ SAROCLADIUM STRICTUM - ПРОДУЦЕНТ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ С АКТИВАТОРНОЙ К ПЛАЗМИНОГЕНУ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2020 года по МПК C12N1/14 C12N9/68 C12R1/645 

Изобретение относится к области биотехнологии, получению протеолитических ферментов с фибринолитической активностью.

Фибрин - высокомолекулярный, неглобулярный белок, конечный продукт свертывания крови, структурная основа тромба, который образуется из фибриногена плазмы крови под действием фермента тромбина (Северин, 2014). Чрезмерное тромбообразование приводит к развитию тромбоэмболических заболеваний с возможным летальным исходом.

Тромб гидролизуется плазмином, который образуется из предшественика - плазминогена под действием специальных белков-активаторов (Струкова, 2002). Протеазы, обладающие плазминоподобной и активаторной к плазминогену активностями, входят в состав противосвертывающих препаратов (Zarar et al., 2014). Существующие тромболитики имеют серьезные недостатки, связанные с риском кровотечений, аллергических реакций и высокой стоимостью (Zarar et al., 2014). В связи с этим актуальным остается поиск продуцентов тромболитических (фибринолитических) ферментов, которые не будут обладать побочными негативными эффектами, или они будут минимальными, а производство препаратов станет более дешевым. Источниками протеаз с фибринолитической активностью могут быть представители различных организмов - животные, грибы, растения, бактерии (Kotb, 2014). Наиболее перспективными из них являются грибы, среди которых обнаруживают продуценты протеиназ со свойствами ферментов системы гемостаза - плазмина, т.е. плазминоподобной активностью (прямой фибринолитической) и активностью активаторной к плазминогену (катализирует превращение плазминогена в собственный плазмин крови человека) (Шаркова и др., 2015). Использование активаторов плазминогена позволяет уменьшить количество белка в лечебном препарате, повысить специфичность его действия, и, соответственно, снизить риск негативных последствий в сравнении с протеиназами с прямой фибринолитической активностью. Поэтому необходимы продуценты у которых среди фибринолитических ферментов преобладают протеиназы - активаторы к плазминогену.

Известны штаммы Aspergillus ustus 1 и Aspergillus ochraceus L-1, которые обладают фибринолитической активностью. Эти штаммы имеют серьезный недостаток - наличие высокой коллагенолитической активности, которая может вызвать снижение прочности или разрушение стенок кровеносных сосудов, что ведет к кровотечениям (Осмоловский и др., 2016).

Известен штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4104D, продуцирующий протеиназы с активностью в отношении фибрина и фибриногена (Патент РФ 2664468). Недостатком этого штамма является отсутствие активаторной к плазминогену активности.

Известны продуценты фибринолитических ферментов штамм Trichotecium roseum Д (Евразийский патент №002561) и штаммы Arthrobotrys longa 1, 2, ВКПМ F-942 (Авторское свидетельство СССР 745943, Патент РФ 2332450, Шаркова и др., 2016). Они синтезируют комплекс внеклеточных протеиназ с фибринолитической, активаторной к плазминогену активностями, а также проявляют побочные казеинолититическую и эстеразную активность (Андреенко и др., 1983). Недостатками этих штаммов-продуцентов Trichotecium roseum и Arthrobotrys longa является многокомпонентность их протеиназ (экскретируют 5 и 6 белковых фракций, соответственно), широкий спектр действия (побочная казеинолититическая и эстеразная активности), и значительное (в 2-3,5 раза) преобладание прямой плазминодоподобной активности над активаторной к плазминогену.

Ближайшим аналогом является штамм микроскопического гриба Tolypocladium inflatum k1. Он наиболее близок к новому штамму по таксономическому положению, образует менее сложный комплекс протеиназ (два основных компонента) и проявляет активаторную к плазминогену активность сопоставимую с плазминоподобной (Шаркова и др., 2015; Шаркова и др., 2016). Недостатком штамма является необходимость длительного культивирования (5 суток), нестабильность роста и активности, в частности уровень активаторной к плазминогену активности в сравнении с плазминоподобной активностью часто много ниже (Шаркова и др., 2015).

Задачей настоящего изобретения является поиск штамма микроскопического гриба Sarocladium strictum ВКМ F-4845D, продуцирующего фибринолитические ферменты с высокой активностью протеиназы - активатора плазминогена плазмы крови, преобладающей над плазминоподобной активностью, и срок его культивирования сокращен.

Задача решается с помощью вновь выделенного авторами почвенного штамма Sarocladium strictum 203. Штамм 203 депонирован во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов (ВКМ) под номером ВКМ F-4845D.

Штамм Sarocladium strictum F-4845D при культивировании на жидкой питательной среде продуцирует внеклеточный фермент с активаторным к плазминогену действием существенно превышающем плазминоподобную активность. Выделение фибринолитических ферментов из культуральной жидкости проводят известными методами с помощью осаждения белков сульфатом аммония до степени насыщения 80%, растворением в минимальном объеме дистиллированной воды или осаждают двукратным объемом ацетона, охлажденным до -20°С. Сформированные осадки центрифугируют, растворяют в буфере (рН 8,2) или дистиллированной воде, удаляют нерастворимую часть осадков, а для удаления солей аммония раствор диализуют при 4°С против того же буфера или проводят гель-фильтрацию на колонках с сефадексом G-25 (Ландау и др., 1998). Раствор хранят в холодильнике при 4°С или лиофилизируют для длительного хранения. Методом фибриновых пластин определяют, что активаторная активность к плазминогену значительно (в 1,5 раза) превышает плазминоподобную активность в полученном растворе и его лиофилизате.

Штамм Sarocladium strictum 203 (ВКМ F-4845D) идентифицирован по морфолого-культуральным признакам (Domsch et al., 2014) и методом секвенирования ITS-региона рДНК. Его нуклеотидная последовательность депонирована в Генбанка по номером MF192758. Он относится к порядку Hypocreales, подклассу Hypocreomycetidae, классу Sordariomycetes, подотделу Pezizomycotina, отделу Ascomycota.

Культурально-морфологические признаки.

Штамм хорошо растет на стандартных агаровых средах - сусло, Чапека, Гетчинсона, глюкозо-пептонной при температуре 25°С - 28°С. Спороношение штамм начинает на 4-5 сут, обильноспороносящие колонии формирует к 10 суткам. На агаризованной среде Чапека штамм Sarocladium strictum образует широкорастущие приподнятые бесцветные пушисто-тяжистые, иногда розовеющие с возрастом, колонии с ровным краем. Обратная сторона колонии бывает с радиальными складками и слабой оранжевой пигментацией. В центре колонии обычно находится пучок вертикальных столонов (плотных пучков из более длинных и менее ветвящихся гиф). Нередко отмечают зональность колоний по ее высоте и интенсивности пигментации. На жидкой среде штамм растет в виде мелкодисперсной массы, состоящей из тяжей слабо ветвящегося мицелия, с многочисленными фиалидами и овально-палочковидными одноклеточными конидиями, длиной 3-5 мкм.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм с определенной степенью термотолерантности, способен расти в интервале температур 8°С - 42°С. Оптимум роста 26-27°С. Использует широкий спектр источников азота, как восстановленные - аммоний, пептон, казеин, так и окисленные, нитриты и нитраты. В глубинной культуре лучше растет на синтетической среде с нитратом, при низком соотношении углерода и азота и значениях рН, близким к нейтральным. Растет на моносахарах, крахмале, ксилане, целлюлозе в качестве источников углерода. Штамм обладает хорошей протеолитической (казеинолитической) и относительно невысокой целлюлозолитической активностью.

Штамм поддерживают на косяках с сусло-агаром 4-5°Б с начальным рН 6,0-6,2 или на среде Чапек-агар при комнатной температуре с пересевом через 1-3 месяца, а при хранении при 4°С с пересевом через 6-12 месяцев или под вазелиновым маслом с пересевом 1 раз в год. Штамм культивируют при 28°С на среде Чапека-Докса 7 суток. Состав среды (в г/л): NaNCb - 3; КН₂РО₄ - 1; KC1 - 0,5; MgSO₄ - 0,5; сахароза - 25; агар-агар -

Штамм при внутривенном заражении лабораторных крыс (линия Вистар) не проявляет зоопатогенных свойств и не вызывает токсической реакции.

Пример 1. Активаторная к плазминогену и плазминоподобная активности протеиназ культуральной жидкости Sarocladium strictum ВКМ F-4845D.

В качестве посевного материала используют двухсуточную культуру, полученную на среде, содержащей сусло, глюкозу и пептон. Штамм Sarocladium strictum ВКМ F-4845D выращивают в условиях глубинного культивирования в 100 мл питательной среды в качалочных колбах объемом 750 мл на круговых качалках (200 об/мин) при 28°С. Дальнейшее культивирование штамма проводят при тех же условиях на сложной среде, содержащей глюкозу, крахмал, соевую муку, мясной экстракт, пептон, хлорид натрия, дигидрофосфат калия, гидратированный сульфат магния, при следующем соотношении компонентов, г/л (в пересчете на кристаллогидратные формы солей):

Сахароза - 40,0

Нитрат натрия NaNO₃ - 19,0

Нитрат калия KNO₃ - 2,5

Гидрофосфат калия K₂HPO₄- 4,4

Вода водопроводная - (1 л)

рН 6,5.

Мицелий после 4 суток культивирования отделяют от среды (фильтрованием через бумажный фильтр или центрифугированием) и получают культуральную жидкость.

Белки культуральной жидкости осаждают двукратным объемом ацетона, охлажденным до -20°С. После формирования осадков их отделяют центрифугированием при 15 тыс. об/мин. Отфильтрованный гомогенный осадок высушивают над серной кислотой в вакуум-эксикаторе.

Фибринолитическую (плазминоподобную и активаторную к плазминогену) активности протеиназ культуральной жидкости штамма Sarocladium strictum ВКМ F-4845D определяют с использованием метода фибриновых пластин (Astrup and Mullerz, 1952).

Готовят 3% раствор бычьего фибриногена и тромбина в концентрации 2 мг/мл в физиологическом растворе (0,5 М NaCl). В чашке Петри смешивают 900 мкл раствора фибриногена и добавляют 200 мкл раствора тромбина. Смесь аккуратно перемешивают в чашках Петри круговыми движениями. Образование фибринового геля происходит при комнатной температуре в чашках с открытыми крышками. Уплотнение геля продолжается в таких условиях в течение 1-3 часов. После этого часть чашек с закрытыми крышками прогревают при температуре 86°С 30 минут, в них инактивируют плазминоген.

Для измерения плазминоподобной и активаторной к плазминогену активности на пластины наносят по 30 мкл полученного после диализа раствора и помещают чашки в термостат на 5 часов при 37°С. По истечении указанного времени, на пластинах измеряют площадь зоны лизиса в мм². Разность в размерах зон на непрогретых и прогретых чашках служит показателем способности фермента не только к прямой фибринолитической активности, но и его способности активировать плазминоген (Astrup and Mullerz, 1952).

Повторность в опытах - 3-х кратная.

Плазминоподобная и активаторная к плазминогену активность штамма Sarocladium strictum ВКМ F-4845D, определенная методом фибриновых пластин, составляет 213,2 мм² и 272,5 мм², соответственно.

Пример 2. Сравнение активаторной к плазминогену и плазминоподобной активностей штамма Sarocladium strictum ВКМ F-4845D и ближайшего аналога - штамма Tolypocladium inflatum k1.

Культивирование штаммов Sarocladium strictum ВКМ F-4845D и ближайшего аналога Tolypocladium inflatum k1 проводят 4 суток согласно примеру 1. Фибринолитическая активность у S. strictum близка к таковой у штамма Tolypocladium inflatum k1, в то время, как значение активаторной к плазминогену активности у S. strictum (280 мм²) в 2,4 раза превосходит таковую у ближайшего аналога (115 мм²) (см. табл.1).

Штамм Sarocladium strictum ВКМ F-4845D, продуцирует внеклеточные фибрилотитические ферменты с активаторной к плазминогену активностью существенно превышающей плазминоподобную и с достоверно более высокой активностью в сравнении с ближайшим аналогом. При этом сокращается времени культивирования штамма с 5-ти до 4-х суток.

Сравнение в аналогичных условиях фибринолитической активности штамма Sarocladium strictum ВКМ F-4845D с другим известным штаммом Trichothecium rozeum, показывает, что при близкой плазминоподобной активности 208 мм², активаторная к плазминогену у него также значительно ниже - 98 мм².

Литература

1. Северин Е.С., 2014. Биохимия для медицинских вузов. М.: ГЭОТАР-МЕД, 768.

2. Струкова С.М., 2002. Современные представления о механизмах свертывания крови. Тромбы, кровоточивость и болезни сосудов, 2, 21-26.

3. Kotb Е., 2014. The biotechnological potential of fibrinolytic enzymes in the dissolution of endogenous blood thrombi. Biotechnol Prog. 30, 3, 656-72.

4. Zarar A., Khan A.A., Adi M.M., Qureshi A.I., 2014. Anaphylactic shock associated with intravenous thrombolytics. Am. J. Emerg. Med., 32, 1, 113, e3-5.

5. Осмоловский A.A., Попова E.A., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Егоров Н.С., 2016. Фибринолитическая и коллагенолитическая активность внеклеточных протеиназ штаммов микромицетов Aspergillus ochraceus L-1 и Aspergillus ustus 1. Вестник Московского университета. Серия 16: Биология, 1, 71-75.

6. Шаркова Т.С., Матвеева Э.О., Крейер В.Г., Осмоловский А.А., Кураков А.В., Баранова Н.А., Егоров Н.С., 2016. Образование протеиназ - активаторов плазминогена микроскопическим грибом Tolypocladium inflatum Kl. Прикладная биохимия и микробиология, 52, 1, 38-43.

7. Шаркова Т.С., Кураков А.В., Осмоловский А.А., Матвеева Э.О., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Егоров Н.С., 2015. Скрининг продуцентов протеиназ с фибринолитической и коллагенолитической активностями среди микромицетов. Микробиология, 84, 3, 316-322.

8. Ландау Н.С., Кураков А.В., Туликова О.М., Батомункуева Б.П., Струкова СМ., Егоров Н.С, 1998. Экстрацеллюлярные протеиназы микромицетов с фибринолитическими и антикоагулянтными свойствами. Микробиология, 67, 2, 215-220.

9. Astrup R., Mullertz S., 1952. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity. Arch. Biochem. Biophys., 40, 346-351.

10. Патент РФ 2332450, 2007. Штамм гриба Arthrobotrys longa ВКПМ F-942 - продуцент лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов.

11. Патент РФ 2664468, 2018. Способ получения протеиназ с фибринолитической и фибриногенолитической активностями.

12. Авторское свидетельство СССР 745943, 1980. Штамм Arthrobotrys longa Mecht - продуцент фибринолитических ферментов.

13. Евразийский патент №002561, 2002. Способ получения фармацевтического препарата, обладающего фибринолитической и противовоспалительной активностью.

14. Андреенко Г.В., Серебрякова Т.Н., Максимова Р.А., Цыманович С.Т., Шаркова Т.С., Мурашова Н.С., Козлова М.А., 1983. Свойства препарата фибринолитических ферментов, полученного из культуралной жидкости несовершенного гриба Arthrobotrys longa. Вестник МГУ. Серия биология, 1, 24-28.

15. Domsch K.Н., Gams W., Anderson Т-Н., 2007. Compendium of soil fungi. Second edition revised by W.Gams. IHW-Verlag & Verlagsbuchhandlung. 700 pp.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм микроскопического гриба Sarocladium strictum BКM F-4845D обладает способностью продуцировать фибринолитические протеиназы с активаторной к плазминогену и плазминоподобной активностью. Изобретение обеспечивает получение протеолитических ферментов с фибринолитической активностью. 1 табл., 2 пр.

Штамм Sarocladium strictum BКM F-4845D - продуцент фибринолитических протеиназ с активаторной к плазминогену и плазминоподобной активностью.