ШТАММ ГРИБА TOLYPOCLADIUM INFLATUM SUBSP. BLASTOSPORUM - ПРОДУЦЕНТ ЦИКЛОСПОРИНА А И СПОСОБ БИОСИНТЕЗА ЦИКЛОСПОРИНА А Советский патент 1996 года по МПК C12P1/06 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков.

Цель изобретения повышение выхода целевого продукта.

Штамм Tolypocladium inflatum subsp. blastosporum N 1069 получен в результате последовательных мутагенных воздействий УФ-лучами с последующим отбором активных вариантов исходного штамма N 2223, Штамм N 1069 депонирован под номером ВНИИА N 319А и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки. Хорошо развивается на большинстве агаризованных сред, образуя колонии размером 4-15 мм песочно-кремового цвета. Колонии неправильной формы, сильно складчатые, медленно покрывающиеся спорообразующим слоем белого цвета.

На наиболее типовой среде с 2% солодового экстракта штамм через 14 суток роста при 24^оС образует колонии диаметром 10-12 мм, приподнятые, кремовые, слабо опущенные, с приподнятым краем, неправильно-складчатые. Характерен землистый запах.

В процессе развития у штамма почти не образуется типичного нитевидного мицелия, он фрагментируется и представлен, в основном, цепочками бластоспор. Мутовки встречаются редко. Бластоспоры прорастают короткой гифой, на которой образуются фиалиды со сферическими спорами, собранными в рыхлые головки. Часто мицелиальная стадия редуцирована, и в этом случае на бластоспоре сразу образуется фиалида с рыхлой головкой спор. Конидии шаровидные, соединенные в рыхлую головку. Хламидоспоры отсутствуют. На границе агара и воздуха бластоспоры прорастают типичным вытянутым конидиофором.

Солодовый агар. Рост хороший, колонии 10-12 мм, приподнятые, кремовые, слабо опушенные, с неровным краем, неправильно-складчатые, диффузного пигмента не образуют.

Среда N 6 с кукурузным экстрактом. Рост умеренный, колонии 7-9 мм, беловатые, мучнистые с неровным краем, кремовые диффузного пигмента не образуют.

Гаузе 2. Рост хороший, колонии 10 мм, кремовые, сильно выпуклые с обрубленным краем, складчатые.

Агар с тирозином. Рост хороший, колонии 10-11 мм, белые изрытые, с ровным краем, с обратной стороны желтые.

Агар глюкозодрожжевой. Рост обильный, колонии 15 мм, белые, слабо опущенные, с приподнятым центром и неровным крем, кремовые.

Агар овсяный. Рост умеренный, колонии 7 мм, белые слабо опушенные, с ровным краем, обратная сторона желтая.

Агар Райстрик. Рост обильный, колонии 10 мм, белые, мучнистые, высоко приподнятые, с неровным краем, обратная сторона желтая, складчатая.

Агар Чапекa с глюкозой. Рост обильный, колонии 10-12 мм, белые, плоские, с неровной поверхностью, обратная сторона желтая.

Агар Ваксмана. Рост умеренный, колонии 7-10 мм, белые, приподнятые, с неровным краем, обратная сторон желтая.

Агар глюкозоаспрагиновый. Рост умеренный, колонии 7 мм, белые, приподнятые, с неровным краем, обратная сторона кремовая.

Агар Гaузе 1. Рост хороший, колонии 8 мм, беловатые, слабо опушенные, с ровным краем, обратная сторона белая.

Агар крахмальный. Рост слабый, колонии 4 мм, белесые, слабо ростущие.

Агар СР-1 с глюкозой. Рост обильный, колонии 10-12 мм, кремово-белые приподнятые, с неровным краем, обратная сторона желтая.

Физиологические признаки.

Аэроб. Максимум роста при 24-26^оС.

Молоко коагулирует, крахмал гидролизует очень слабо, желатин разжижает.

Гетеротроф и прототроф.

Хорошо растет в присутствии глюкозы, ксилозы, маннита, сорбита, усваивает арабинозу и мальтозу, слабо усваивает сахарозу, гелактозу, раффинозу и не усваивает лактозу и рамнозу.

Штамм хранится на скошенных агаризованных средах при 5^оС в течение 6 месяцев.

Антагонистические свойства. Штамм N 1069 при культивировании в жидкой питательной среде в колбах на качалках или в ферментерах образует антигибридной антибиотик в количестве до 800 мкг/мл, спектр действия которого приведен в табл. 1.

П р и м е р 1. Агаровым блоком 15-20-суточной культуры Tolypocladium inflatum subsp, blastosporum N 1069, выращенной на среде Райстрик при 24^оС, засевют посевную среду следующего состава, мас.

Соевая мука 3,0
Глицерин 3,5
Калий фосфорнокислый
однозамещенный 0,6
Натрий хлористый 0,6
Меласса 2,5
Вода Остальное
pH 6,5
Объем среды в колбах 50 мл. Выращивание проводят в колбах на качалках при 240 об/мин и при 24^оС в течение 48 ч.

Мицелий из маточной колбы переносят в посевные колбы, содержащие 100 мл среды указанного состава. Культивирование в посевных колбах ведут также, как и в маточных.

Мицелий из посевных колб используют в качестве инокулята при биосинтезе циклоспорина в колбах на качалках. Количество вносимого посевного материал 10%
Для ферментации используют среду следующего состав, мас.

Меласса 14
БВК 0,6
Глицерин 1,0
Аммоний фосфорнокислый
двузамещенный 0,6
Кобальт хлористый 0,0004
Вода Остальное
pH 6,5.

Ферментацию продолжают 6 сут.

Наполнение среды в колбах 50 мл. Рост при 24^оС на качалках при 240 об/мин. Активность культуральной жидкости при этом составляет до 800 мкг/мл.

П р и м е р 2. Биосинтез циклоспорина А ведут, как в примере 1, с использованием посевной среды следующего состава
Вариант А, мас.

Меласса 12-20
Глицерин 0,5-1,5
БВК 0,4-0,8
Аммоний фосфорнокислый
двузамещенный 0,5-0,8
Кобальт хлористый 0,0003-0,0006
Вода Остальное
pH 0,6-6,5
Соевая мука 2,0
Глицерин 2,5
Калий фосфорнокислый
однозамещенный 0,3
Натрий хлористый 0,3
Меласса 2,0
Вода Остальное
pH 6,7 состав ферментационный среды, как в примере 1.

Активность культуральной жидкости через 6 суток культивирования составляет 800 мкг/мл.

П р и м е р 3. Биосинтез циклоспорина А ведут, как в примере 1, с использованием посевной среды, как в примере 1, и ферментационной среды следующего состава, мас.

Меласса 12
Глицерин 0,5
БВК 0,4
Аммоний фосфорнокислый
двузамещенный 0,5
Кобальт хлористый 0,003
Вода Остальное
Ферментация ведется, как в примере 1, активность культуральной жидкости 750 мкг/мл.

П р и м е р 4. Биосинтез проводят, как в примере 1, но с использованием штамма 392, ВНИИА N 331А, полученного параллельно со штаммом 1069. Активность культуральной жидкости в конце ферментации 600 мкг/мл.

П р и м е р 5. Биосинтез ведут, как в примере 1, но c использованием штамма 106 ВНИИА N 330А. Активность культуральной жидкости в конце ферментации 700 мкг/мл.

П р и м е р 6. Биосинтез циклоспорина А ведут, как в примере 1, с использованием различных штаммов и следующих вариантов ферментационных сред:
Вариант А₁: все компоненты среды в минимальных концентрациях.

Вариант А₂: все компоненты среды в оптимальных концентрациях.

Вариант А₃: все компоненты среды в максимальных концентрациях.

Вариант Б, мас.

Меласса 12-20
Глицерин 0,5-1,5
Соевая мука 0,5-1,5
Аммоний фосфорнокислый
двузамещенный 0,5-0,8
Кобальт хлористый 0,0003-0,0006
Вода Остальное
pH 6,0-6,5
Вариант В, мас.

Меласса 12-20
Глицерин 0,5-1,5
Кукурузный экстракт 0,5-1,5
Аммоний фосфорнокислый
двузамещенный 0,5-0,8
Кобальт хлористый 0,0003-0,0006
Вода Остальное
pH 6,0-6,5
Вариант Г, мас.

Меласса 12-20
Глицерин 0,5-1,5
БВК+соевая мука 0,3-0,5+0,3-1
+кукурузный экстракт 0,3-0,8
(общее содержание 1,0-1,5)
Аммоний фосфорнокислый
двузамещенный 0,5-0,8
Кобальт хлористый 0,0003-0,0006
Вода Остальное
pH 6,0-6,5 Результаты представлены в табл. 2
П р и м е р 7. Биосинтез циклоспорина А ведут, как в примере 1, с варьированием температуры. Результаты приведены в табл. 3.

Использование изобретения позволяет повысить выход антибиотика циклоспорина А.

Вариант Б₁: все компоненты среды в минимальных концентрациях.

Вариант Б₂: все компоненты среды в оптимальных концентрациях.

Вариант Б₃: все компоненты среды в максимальных концентрациях.

Вариант В₁: все компоненты среды в минимальных концентрациях.

Вариант В₂: все компоненты среды в оптимальных концентрациях.

Вариант В₃: все компоненты среды в максимальных концентрациях.

Вариант Г₁: все компоненты среды в минимальных концентрациях.

Вариант Г₂: все компоненты среды в оптимальных концентрациях.

Вариант Г₃: все компоненты среды в максимальных концентрациях.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта. Штамм Tolypocladium inflatum subsp. blastosporum 1069 получен путем селекции и депонирован под номером ВНИИА N 319А. Для реализации способа кроме штамма 1069 используют штаммы ВНИИА N 331А или ВНИИА N 330А. Продуцент выращивают в посевной среде следующего состава, мас.%: соевая мука 2 - 3, глицерин 2,5 - 3,5, меласса 2,0 - 2,5, калий фосфорнокислый однозамещенный 0,3 - 0,6, натрий хлористый 0,3 - 0,6, вода - остальное, рН среды 6,5 - 6,7. Полученный мицелий используют в качестве инокулята при биосинтезе. Для ферментации, проводимой в условиях аэрации и перемешивания при температуре 23 - 25^oС, используют ферментационную среду следующего состава, мас.%: меласса 12 - 20; глицерин 0,5 - 1,5; источник органического азота 0,4 - 1,5 (в качестве которого используют БВК 0,4 - 0,8 мас.%, соевую муку 0,5 - 1,5 мас. %, кукурузный экстракт 0,5 - 1,0 мас.% или их смесь общей концентрации 0,8 - 1,5 мас. %); калий фосфорнокислый однозамещенный или аммоний фосфорнокислый двузамещенный 0,5 - 0,8; кобальт хлористый 0,0003 - 0,0006, вода - остальное, рН среды 6,0 - 6,5. Активность культуральной жидкости при использовании штамма 319А 750 - 800 мкг/мл, штамма 330А 550 - 800 мкг/мл, штамма 331А 120 - 600 мкг/мл. 2 с. и 2 з. п. ф-лы, 3 табл.

1. Штамм гриба Tolypocladium inflatum subsp. blastosporum ВНИИА N 319А - продуцент циклоспорина А. 2. Способ биосинтеза циклоспорина А путем выращивания продуцента Tolypocladium inflatum subsp. blastosporum в посевной среде, содержащей источник углерода, источник азота, минеральные соли и воду, с последующей инокуляцией ферментационной среды, содержащей источник углерода, источник органического азота, соль фосфорной кислоты, соль соляной кислоты и воду, и проведением процесса ферментации в условиях аэрации и перемешивания, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, посевная среда в качестве источника углерода содержит глицерин и мелассу, в качестве источника азота - соевую муку, в качестве минеральных солей - калий фосфорнокислый однозамещенный и натрий хлористый при следующем количественном соотношении компонентов, мас.%:
Соевая мука - 2 - 3
Глицерин - 2,5 - 3,5
Меласса - 2,0 - 2,5
Калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,3 - 0,6
Натрий хлористый - 0,3 - 0,6
Вода - Остальное
а ферментационная среда содержит в качестве источника углерода мелассу и глицерин, в качестве соли фосфорной кислоты она содержит калий фосфорнокислый однозамешенный или аммоний фосфорнокислый двузамещенный, в качестве соли соляной кислоты - кобальт хлористый при следующем количественном соотношении компонентов, мас.%:
Меласса - 12 - 20
Глицерин - 0,5 - 1,5
Источник органического азота - 0,4 - 1,5
Калий фосфорнокислый однозамещенный или аммоний фосфорнокислый двузамещенный - 0,5 - 0,8
Кобальт хлористый - 0,0003 - 0,0006
Вода - Остальное
а процесс ферментации ведут при температуре 23 - 25^oС. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм Tolypocladium inflatum subsp. blastosporum ВНИИА N 319А, ВНИИА N 331А или ВНИИА N 330А. 4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве источника органического азота ферментационная среда содержит БВК в концентрации 0,4 - 0,8 мас. %, или соевую муку 0,5 - 1,5 мас.%, или кукурузный экстракт 0,5 - 1,0 мас.%, или их смесь общей концентрации 0,8 - 1,5 мас.%.