КОНСОРЦИУМ ДРОЖЖЕЙ CANDIDA MALTOSA ДЛЯ БИОДЕГРАДАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕНИЙ Российский патент 1998 года по МПК C12P39/00 C12N1/16 C02F3/34 B09C1/10 C12N1/16 C12R1/72 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, микробиологии и экологии и касается получения нового препарата - консорциума, предназначенного для очистки воды, водных стоков, почвы и др. объектов от широкого диапазона нефтепродуктов и непосредственно нефти.

Известен штамм микроорганизмов Rhodococcus sp. НХ7, обладающий нефтеокисляющими свойствами, используемый при очистке воды и почвы от нефтезагрязнений. При обработке этими бактериями обычно вносится доза 1 г клеточной биомассы на 1 м² обрабатываемой поверхности или суспензия, содержащая 10⁷-10⁸ клеток в 1 мл, при этом расход суспензии - 1 л на 1 м² загрязненной площади.

Однако процесс очистки объектов от нефтезагрязнений является недостаточно эффективным, поскольку используется монокультура бактерий, что ограничивает круг очищаемых углеводородов. Кроме того, способ выращивания данной культуры является продолжительным и составляет несколько суток (патент RU N 2039714, кл. C 02 F 3/34, 1995).

Известно использование природного штамма Pseudomonas putida - 36 в способе очистки почвы от нефтяных загрязнений (патент US N 4822490, кл. C 02 F 3/34, 1989). При очистке в этом случае бактериальную культуру вносят в нефтяное загрязнение совместно с минеральным удобрением, содержащим азот в нитратной форме. Количество вносимой культуры составляет не менее 1•10⁴ кл/мг. При этом расход водной смеси 0,5 - 1,0л на 1 м².

Однако очистка, достигаемая при использовании указанного штамма бактерий, также недостаточно высока. Кроме того, его использование имеет ограниченное применение. Это связано с тем, что штамм, выращенный на стандартном углеводном субстрате, с трудом приспосабливается к новым условиям, что приводит к необходимости использовать новые субстраты из почвы. Также указанный штамм Pseudomonas putida - 36 обладает гемолитической и желатиназной активностью, что препятствует развитию процесса самоочищения с помощью микроорганизмов. Более того, применение нитратных форм азота при внесении бактериальной культуры в почву приводит к дополнительному загрязнению среды токсичными нитрат-ионами.

Необходимо отметить, что с точки зрения достижения более полного использования функциональных биотехнологических возможностей микроорганизмов - биодеструкторов нефти, применение чистых монокультур и микроорганизмов менее предпочтительно, чем применение смесей или ассоциаций микроорганизмов, которые в силу их специфики обладают способностью к очистке неоднородных по составу субстратов (промышленные сточные воды, почвенные загрязнения) и обеспечивают деградацию органических соединений за счет комбинированного воздействия несколькими видами микроорганизмов. Тем самым биотехнологическое обеззараживание и очистка объектов ведется за меньшее время.

Известен консорциум микроорганизмов Rhodococcus sp. Bk mac - 1500D, Rhodococcus maris BKM AC-150 ID, Rhodococcus crythropolis BKM AC-1502D, Pseudomonas stutzeri BKM B-1972D, Candida sp. BKM-Y-2778D.

Данный консорциум, известный под названием "Devouroil", используется для очистки почвенных и солоновато-водных экосистем от загрязнения нефтепродуктами. Он включает как липофильные, так и галофильные микроорганизмы, обладает способностью окислять нефтепродукты как в зоне контакта с водой, так и непосредственно в нефтяной пленке. Процесс удаления нефтезагрязнений можно вести не только в пресной, но и засоленной экосистеме (патент RU N 2023686, кл. C 02 F 3/34, 1994).

Однако использование данного консорциума для очистки от нефтезагрязнений в промышленных условиях затруднено, так как пять входящих в него штаммов микроорганизмов сильно различаются по своим физиологическим особенностям и имеют различные характеристики роста.

В связи с вышеизложенным целью изобретения явилось создание нового консорциума микроорганизмов, который обладал бы улучшенными свойствами: наряду с активной работой по биоразложению нефти, в частности, непосредственно в нефтяной пленке, обладал бы более коротким циклом развития составляющих культур и обеспечивал бы биоразложение широкого диапазона углеводородов - составляющих нефтепродуктов в условиях повышенных температур и большем диапазоне засоленности очищаемой среды. Кроме того, способ получения данного консорциума должен быть более простым и экономичным.

Предлагаемый новый препарат является биодеструктором нефтяных загрязнений и представляет собой консорциум, в состав которого входят штаммы дрожжей Candida maltosa ВКПМ У-2256 и ВКПМ У-2257. Биопрепарат на основе этого консорциума получил название "Дизойл". Штаммы Candida maltosa ВКПМ У-2256 и ВКПМ У-2257 выделены из почвы, пропитанной нефтью. Они обладают следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Штамм Candida maltosa ВКПМ У-2256.

Культурально-морфологические признаки.

На сусло-агаре: клетки овальные и коротко овальные.

Размеры клеток: 3,0-7,5 • 2,5-6,3 мк, хорошо почкуются. В двухсуточной культуре на солодовом сусле образует островки легкой матовой пленки, белый плотный осадок. Солодовый агар: колонии крупные, диаметр до 0,7 см, белого цвета, блестящие с желтоватым оттенком в средней части колонии. Поверхность колонии гладкая с намечающимся рисунком, край колонии бахромчатый или ровный.

Физиолого-биохимические признаки.

Хорошо сбраживает глюкозу, сахарозу, мальтозу, галактозу, ксилозу; несколько хуже - арабинозу; не ассимилирует лактозу. Хорошо ассимилирует аммонийную форму азота, азотнокислый калий не ассимилирует. Растет при 5-41^oC и pH 3,0-9,0. Оптимум роста - при 30-34^oC и pH 3,8-5,5.

Штамм Candida maltosa ВКПМ У-2257.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки овальные и округло-овальные, одиночные, а также в виде небольших цепочек (из трех-четырех клеток). Размеры клеток: 3,0-7,8 • 5,2-3,0 мк. Аскоспоры не образует. Среда - сусло-агар: колонии круглые, гладкие, кремовые с гладкой поверхностью и ровным краем. Центр колонии возвышен и слегка наплывает на край. В солодовом сусле образует пленку, кольца не образует. Осадок - плотный, светлый.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэробные свойства. Хорошо сбраживает глюкозу, сахарозу, галактозу, трегалозу; медленно - мальтозу; не сбраживает лактозу и раффинозу. Ассимилирует глюкозу, сахарозу, мальтозу, галактозу, ксилозу, трегалозу, глицерин, адонит, сорбит, маннит. Не ассимилирует лактозу, раффинозу, рибозу, эритрит, инозит, растворимый крахмал. Хорошо усваивает аммонийную форму азота. Не усваивает азотнокислый калий.

Растет при 5 - 41^oC и pH 3,0 - 9,0.

Оптимум роста при 30 - 41^oC и pH 3,5 - 5,5.

Штаммы хранят при 18 - 20^oC на сусло-агаре.

Учитывая, что параметры роста штаммов Candida maltosa ВКПМ У-2256 и Candida maltosa ВКПМ У-2257 одинаковы и выращивание их проводится одновременно в одной емкости, предпочтительное соотношение указанных штаммов в консорциуме 1 : 1.

Для получения консорциума штаммы дрожжей Candida maltosa ВКПМ У-2256 и Candida maltosa ВКПМ У-2257 выращивают непрерывным способом (при соотношении, например, 1 : 1) в условиях аэрации на природных или искусственных смесях углеводородов, например нефтяных дистиллятах, при соотношении между изопарафинами и н-парафинами от 0,2 : 1 до 2 : 1 в водно-минеральной питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, калия и магния при 30 - 41^oC и pH 3,8 - 7,0, коэффициенте разбавления среды Д = 0,2 ч^-1. Время выращивания - 5 ч.

Для удобства хранения и транспортирования полученную суспензию дрожжей собирают и сгущают путем декантации водной фазы, затем отделяют биомассу сепарацией и сушат до влажности не более 12%.

Как видно из вышеприведенного, способ получения биопрепарата "Дизойл" является достаточно простым.

Полученный таким образом биопрепарат представляет собой порошок светло-желтого цвета, влажностью не более 12% и титром живых клеток 1•10⁸ - 1•10¹¹ кл/г. Полученный биопрепарат обладает:
- высокой нефтеокисляющей активностью,
- устойчивостью к химическим загрязнениям,
- устойчивостью к резким колебаниям pH и температуры среды, способностью активно работать в интервале температур от 5^oC до 41^oC и при pH 3,0 - 9,0, - адаптированностью к засоленным условиям среды (до 15% NaCl),
- отсутствием токсичности и патогенности (подтверждено заключением НИИ Медицины труда РАМН).

Кроме того, полученный биопрепарат может работать как на поверхности нефтяной пленки, так и непосредственно в толще нефтяного слоя.

"Дизойл" может применяться для очистки почвы от нефтяных загрязнений как путем распыления, так и закачки в подпочвенный слой. При проникновении нефти в почву на глубину до 20 мм расход препарата составляет 2 - 3 кг/га.

Как показали испытания, проведенные НИИ Медицины труда РАМН, в течение 10 суток, после внесения консорциума в загрязненную почву, содержание нефти в ней уменьшилось на 30%, а при применении консорциума для очистки поверхности воды нефтяная пленка на ней исчезла на 90%.

Кроме того, описываемый биопрепарат может успешно применяться для очистки сточных вод, содержащих нефть и/или продукты ее переработки, а также при очистке различного оборудования нефтяной и нефтехимической промышленностей, например нефтеналивных барж, танкеров и т.п.

Пример 1. Для испытания полученного биопрепарата по методике НИИ Медицины труда РАМН использовалась подзолистая почва, освобожденная от посторонних включений. Нагрузка нефтью составляла 40 г/кг.

В лотки 0,033 м², высотой 10 см вносили по 8 кг почвы, обработанной профильтрованной хозяйственно-фекальной сточной водой из расчета 2 мг/кг. Использовалось 4 лотка:
N 1 - почва без нефти и препарата,
N 2 - почва с препаратом, но без нефти,
N 3 - почва с нефтью, но без препарата,
N 4 - почва с нефтью и препаратом.

Загрязнение почвы нефтью осуществлялось за 5 cyт до внесения в нее препарата.

Препарат вводился в почву в виде суспензии. При этом вначале готовилась базовая суспензия. Для чего в емкость объемом 100 мл вносили 1 г полученного в виде сухого порошка препарата, 250 мг диаммофоса (азотно-фосфатного удобрения) и 50 мл теплой воды с температурой 15 - 30^oC. Полученную суспензию тщательно перемешивали и аэрировали в течение 12 ч, после чего дополнительно вносили 3 г диаммофоса и доводили объем жидкости до 100 мл водой.

Непосредственно перед обработкой почвы приготовленную базовую суспензию разводили в 100 раз и перемешивали, после чего полученным рабочим составом обрабатывали лотки N 2 и N 4 с почвой. Обработка велась из расчета 10 л рабочего состава на 1 м² поверхности (при комнатной температуре).

Наблюдение вели в течение 20 дней, после чего определяли нефть в почве весовым методом с экстракцией ее из почвы хлороформом и последующим хроматографическим выделением.

Санитарно-химические показатели: азот аммония, нитриты, нитраты, фосфаты, перманганатная окисляемость, растворенный кислород, БИК, водородный показатель - определялись общепринятыми методами (Новиков Ю. В. и др. Методы исследования качества воды в водоемах. - М.: Медизд., 1990).

Результаты исследований по деградации нефти в почве сведены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, в лотке N 3 с почвой, загрязненной нефтью, за счет естественных процессов самоочищения содержание нефтепродуктов, растворимых в хлороформе, снизилось за 10 сут с 38,6 г/кг до 37,2 г/кг, т.е. на 2,9%.

В лотке N 4, где загрязненная нефтью почва обрабатывалась приготовленным составом, за 10 сут содержание нефти, экстрагируемой в хлороформе, уменьшилось с 40,8 г/кг до 28,2 г/кг, т.е. на 30,8%.

Концентрация азота аммонийного во всех четырех лотках снижалась к десятому дню, но максимальная интенсивность процесса зарегистрирована в лотках N 2 и N 4, т. e. там, куда вводился препарат. В эти же сроки наблюдался процесс нитрафикации. Максимальное увеличение содержания нитратов также имело место в лотках N 2 и N 4, где был введен препарат.

Что касается процесса фосфорилирования, то наиболее активно он протекал в лотке N 4 (снижение фосфора относительно фона - 6,7%, в то время как в других лотках указанный показатель колебался в пределах 22 - 49%).

Обработка загрязненной нефтью почвы препаратом положительно отразилась на сапрофитной микрофлоре. Так, общее микробное число (ОМЧ) при 22 и 37^oC в почве лотка N 4 было выше контрольного уровня (лоток N 1), в то время как в лотке, где почва с нефтью не подвергалась воздействию препарата, эти показатели были на порядок ниже, чем в контрольном лотке N 1 на всем протяжении эксперимента.

Отсутствие токсического действия предлагаемого препарата подтверждается и результатами дегидрогеназного теста (см. табл. l).

Пример 2. При оценке эффективности очистки воды в качестве экспериментальных моделей использовались 10 - литровые стеклянные емкости, заполненные речной водой из реки Яуза. Опыты проводились на 4 моделях:
N 1 - речная вода без нефти и препарата,
N 2 - речная вода без нефти с препаратом,
N 3 - речная вода с нефтью без препарата,
N 4 - речная вода с нефтью и препаратом.

Водная поверхность в каждой емкости составляла 201 см². Нагрузка нефтепродуктов на водоемы создавалась из расчета 5 г/л.

Для оценки деградации нефтяной пленки использовались "малые" водоемы емкостью 10 л, в которые вносилось 5 г нефти на 1 л речной воды. Обработка препаратом осуществлялась через двое суток после внесения в модели нефти.

При обработке моделей N 2 и N 4 использовали рабочий состав. Для приготовления рабочего состава базовая суспензия препарата, приготовленная в соответствии с примером 1, была разбавлена в 10 раз. Доза рабочего состава при обработке 1 м² поверхности составляла 1 л. Титр микроорганизмов в рабочем составе составлял 1•10⁸ кл/г.

Наблюдение за качеством воды в экспериментальных моделях выявили высокую эффективность консорциума при очистке от нефти. Так, к десятому дню нефтяная пленка в модели N 4 (вода с нефтью и препаратом) исчезла на 90% относительно исходной величины, в то время как в модели N 3 (вода с нефтью без препарата) нефтяная пленка уменьшилась не более, чем на 10%.

Уровень пленочных нефтепродуктов, растворенных в хлороформе, за рассматриваемый период снизился с 4,8 г до 1,7 г.

Данные проведенных наблюдений и анализов сведены в табл.2.

Концентрация нефтепродуктов в водном слое, растворенном в гексане, в модели N 4 снизилась с 7 мг/л до 5 мг/л. В то же время в воде модели N 3 (вода с нефтью без препарата) содержание пленочной нефти снизилось с 4,9 г до 4,5 г, при этом в водном слое зафиксировано увеличение содержания нефти с 6 мг/л до 6,7 мг/л.

Процессы нитрафикации и фосфорилирования замедляются только в модели N 3, где снижение загрязнения нефтью на протяжении срока эксперимента незначительно.

Снижение перманганатной окисляемости (ПО), а также содержания растворенного кислорода (см. табл.2) свидетельствует о протекании деструктивных процессов нефти под действием внесенного препарата.

Низкое содержание кислорода в водоемах моделей N 2 и N 4 и уровень ВПК коррелирует с количеством сапрофитной микрофлоры. Таким образом, данные табл.2 отражают выраженную деструкцию нефти в присутствии консорциума.

Для очистки внутренних поверхностей оборудования, загрязненного нефтепродуктами (например, емкостей), применяется рабочий состав, представляющий собой разбавленную в 10 раз базовую суспензию препарата, приготовленную в соответствии с примером 1. Очищаемую емкость заполняют рабочим составом до уровня или выше уровня загрязнения стенок емкости. Процесс очистки желательно вести совместно с другими, общепринятыми мероприятиями по очистке емкостей, например, совместно с механической очисткой. В процессе очистки необходимо производить перемешивание рабочего состава и его аэрирование, что активизирует действие предлагаемого консорциума. При этом очистку указанных поверхностей желательно осуществлять при pH = 4,5 - 7,0 и температурах 25 - 32^oC.

Результаты биодеградации углеводородов нефти под воздействием предлагаемого препарата в засоленных средах приведены в табл. 3.

Как показали проведенные эксперименты, предлагаемый консорциум обеспечивает эффективную биодеградацию нефтезагрязнений в почве и воде.

По данным гигиенической экспертизы НИИ Медицины труда РАМН ограничений для опытно-промышленного применения предлагаемого консорциума не выявлено.

Изобретение относится к биотехнологии и экологии и касается очистки воды, почвы и др. объектов от нефтезагрязнений и касается нового консорциума дрожжей Candida maltosa штаммов ВКПМ У-2256 и У-2257, используемого для вышеуказанной цели. Соотношение штаммов в консорциуме может быть любым, предпочтительно 1: 1. Диапазон очищаемых углеводородов достаточно широк. Консорциум утилизирует нефтезагрязнения при температуре до 41°С и при рН 3,0-9,0, может работать в засоленных экосистемах. При использовании консорциума для очистки почвы содержание углеводородов нефти на десятые сутки снижается на 30%, а при очистке воды - на 90%. 3 табл.

Консорциум дрожжей Candida maltosa ВКПМ У-2256 и Candida maltosa ВКПМ У-2257, используемый для биодеградации нефтезагрязнений.