СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И/ИЛИ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ МАТЕРИАЛА, НАБОР ДЛЯ АНАЛИЗА, ОПТИЧЕСКИЙ ВОЛНОВОД, БИОСЕНСОР Российский патент 1998 года по МПК C12Q1/68 G01N33/52 

Изобретение относится к способу обнаружения идентификации и/или количественной оценки тканей растений или животных, микроорганизмов, или выделенных из клеток РНК или ДНК; а также к реагентам и детекторным устройствам, адаптированным для осуществления указанного способа. Этот способ, в частности, основан на флуоресценции, связанной с явлением полного внутреннего отражения (ПВО-Ф), и используемой для оценки гибридизации РНК или ДНК анализируемого образца с РНК или ДНК, ассоциированных с волноводом детектора затухания колебаний.

Анализ с использованием генных зондов и гибридизации нуклеиновых кислот является альтернативным к иммуноанализу, и направлен на обнаружение и идентификацию биологических материалов. В этом анализе специфичность генных зондов по отношению к их мишеням регулируется значительно легче, чем в анализе, основанном на принципе связывания белка; и, кроме того, при связывании этих зондов с материалами мишенями, заранее амплифицированными с помощью полимеразной цепной реакции, может быть получена максимальная чувствительность. Существующая в настоящее время техника, основанная на использовании генных зондов, дает результат лишь через несколько часов, или даже дней. Биосенсоры, предлагаемые в качестве альтернативного способа, позволяют проводить быстрый анализ с помощью генных зондов, но имеющиеся в настоящее время описания таких биосенсорных анализов относятся к использованию поверхностного плазменного резонанса (Evans & Charles, 1990); Бюллетень 1-го Международного Конгресса по ДНК- зондам и иммуноанализу; Pollard-Knigh et al., 1990, Ann. Biol. Clin. 48, 642-646).

Ранее, в запредельных биосенсорах, где детектирование основано на явлении ПВО-Ф (Sutherland & Dahne, (1987), J. Immunol. Meth., 74, 253-265), в качестве биологических распознающих элементов использовались белки. Например, для изучения связывания ацетилхолина и ингибиторов холинэстеразы использовались антитела, способствующие обнаружению связывания меченного флуоресцином антигена (Eldegrawi et al. (1991) Biosensors & Bioelectronics, 6, 507-516) c рецепторами ацетилхолина. Было также оценено связывание антител с Fc-эпитопами (Poglitsch & Thompson (1990) Biochemistry, 29,248-254).

Настоящее изобретение относится к способу проведения анализов с помощью генных зондов и с использованием биосенсора, включающего детектор затухания колебаний, а также к ПВОФ-волноводу, адаптированному для осуществления указанного способа посредством введения этого волновода в биочувствительный датчик.

Детекторы затухания колебаний, основанные на явлении полного внутреннего отражения (ПВО), позволяют получить высокочувствительный метод обнаружения реакций на поверхности волноводов. Такой волновод может иметь любую форму, но обычно он изготавливается в форме призмы, пластины или волокна. Реакция, используемая для анализа молекулы-мишени, может контролироваться, например, путем оценки изменения флуоресценции при связывании или десорбции флуоресцирующего материала, или путем генерирования флуоресцирующего материала с использованием ферментных или химических реагентов. В некоторых опубликованных патентах раскрывается использование детекторов затухания волн с системами иммуноанализа в качестве биологического чувствительного элемента (см., например, патент США 4582809); однако ограничения, присущие этим иммунореагентам, не позволяют использовать в полной мере возможности указанных датчиков.

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения, идентификации и/или количественной оценки материала, выбранного из тканей растений или животных, микроорганизмов, или неклеточных свободных РНК или ДНК, заключающемуся в том, что:
(I) получают олигонуклеотид, комплементарный всей или части олигонуклеотидной последовательности, характерной для РНК или ДНК исследуемого материала, иммобилизованный на поверхности волновода детектора затухания колебаний;
(II) иммобилизованный олигонуклеотид из стадии (I) подвергают взаимодействию с образцом или ДНК- или РНК-материалом, полученным из этого образца, в условиях, при которых ДНК или РНК, имеющие характерную олигонуклеотидную последовательность, гибридизируются с указанным иммобилизованным олигонуклеотидом;
(III) иммобилизованный олигонуклеотид стадии (I) или нуклеиновокислотный материал, полученный из образца, подвергают связыванию с флуоресцентно детектируемым агентом до, в течение или после гибридизации с ДНК или РНК, как указывается в стадии (II), таким образом, чтобы указанный флуоресцентно детектируемый агент связывался с гибридизованным продуктом, и не связывался с негибридизированным иммобилизованным олигонуклеотидом;
(IV) с помощью детектора затухания волн оценивают количество флуоресцентно детектируемого агента, связанного, как описано в стадии (III), и в соответствии с этой оценкой определяют наличие, идентичность и/или количество анализируемого материала.

В одном из предпочтительных вариантов настоящего изобретения флуоресцентно детектируемым агентом является флуоресцентно детектируемый интеркалирующий краситель, способный встраиваться в дуплекс гибридизационного продукта. В этом варианте метода настоящего изобретения краситель не связывается с негибридизованными иммобилизованными олигонуклеотидами. Такой метод определения присутствия гибридизационного продукта является идеальным при использовании иммобилизованных последовательностей с длиной, достаточной для осуществления специфической гибридизации в используемых гибридизационных условиях. Анализируемый таким образом образец может иметь неизменное содержание ДНК/РНК либо это содержание может быть избыточным в результате специфической амплификации последовательности, например, с помощью полимеразной цепной реакции (PCR) или лигазной цепной реакции (LCR).

Во втором предпочтительном варианте настоящего изобретения указанным обнаруживаемым агентом является флуоресцентно детектируемый олигонуклеотид, который способен гибридизироваться с гибридизованной характерной последовательностью либо который способен действовать как специфический праймер для реакции амплификации последовательности, например, для полимеразной цепной реакции, обеспечивающей продуцирование флуоресцентно-детектируемого амплифицированного продукта, который, после его гибридизации с иммобилизованным на волноводе олигонуклеотидом, может быть обнаружен по затуханию колебаний.

Во втором своем предпочтительном варианте, который описан выше и в котором используется детектируемый олигонуклеотид, настоящее изобретение относится к способу обнаружения, идентификации и/или количественной оценки материала, выбираемого из ткани растений или животных, микроорганизмов, или свободной неклеточной РНК или ДНК, заключающемуся в том, что:
(I) получают олигонуклеотид, комплементарный всей или части олигонуклеотидной последовательности, характерной для РНК или ДНК анализируемого материала, и иммобилизованный на поверхности волновода детектора затухания колебаний;
(II) получают флуоресцентно-детектируемый олигонуклеотид, который является комплементарным всей или части остальной характеристической последовательности;
(III) иммобилизованный олигонуклеотид из стадии (I) обрабатывают раствором, содержащим исследуемый материал, или полученный из него ДНК- или РНК-материал, в условиях, при которых характерная олигонуклеотидная последовательность будет гибридизироваться с указанным иммобилизованным олигонуклеотидом (IV), раствор материала (III) заменяют раствором, содержащим флуоресцентно детектируемый комплементарный олигонуклеотид, определенный в (II); и
(V) с использованием детектора затухания колебаний оценивают количество флуоресцентно детектируемого связанного олигонуклеотида и в соответствии с этой оценкой определяют наличие, идентичность и/или количество целевого материала в образце.

В другом предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способу обнаружения, идентификации и/или количественной оценки тканей растений или животных, микроорганизмов, или свободной клеточной РНК или ДНК, который заключается в том, что:
(I) получают олигонуклеотид, комплементарный части олигонуклеотидной последовательности, характерной для РНК или ДНК анализируемого материала, и иммобилизованный на поверхности волновода детектора затухания колебаний;
(II) получают флуоресцентно детектируемый олигонуклеотид, который является идентичным всей или части остальной характеристической последовательности;
(III) используя флуоресцентно детектируемый олигонуклеотид стадии (II) в качестве одного из праймеров, осуществляют специфическую реакцию амплификации последовательности на исследуемом образце материала, в результате которой амплифицируется любая присутствующая характерная последовательность, причем в эту последовательность встраивается флуоресцентно детектируемый агент;
(IV) иммобилизованный на волноводе комплементарный олигонуклеотид из стадии (I) обрабатывают реакционной смесью из стадии (III) в условиях, при которых может происходить гибридизация амплифицированного продукта с указанным иммобилизованным олигонуклеотидом;
(V) используя детектор затухания колебаний, оценивают количество флуоресцентно детектируемого олигонуклеотида, гибридизованного с иммобилизованным олигонуклеотидом, и в соответствии с этой оценкой определяют количество амплифицированного материала, первоначально присутствовавшего в образце.

Подходящей и предпочтительной специфической реакцией амплификации, используемой в стадии (III), является полимеразная цепная реакция, однако могут быть также использованы и другие реакции, хорошо известные специалистам, например лигазная цепная реакция.

Во всех вариантах осуществления настоящего изобретения волновод предпочтительно помещают в условия температурного контроля, например в камеру с терморегулированием или термостат так, чтобы можно было регулировать жесткость гибридизации комплементарных последовательностей с РНК- или ДНК-мишенями или можно было осуществлять термоциклы денатурации, гибридизации и удлинения цепи полимеразной цепной реакции.

Флуоресцентно детектируемые комплементарные олигонуклеотиды могут быть получены в различных формах, например, в виде олигонуклеотида, меченного либо флуоресцентной меткой; либо молекулами или их группами, с которыми могут быть связаны флуоресцирующие материалы; либо ферментом или катализатором, способным генерировать флуоресцирующий материал. Поэтому перед проведением стадии детектирования флуоресценции могут потребоваться дополнительные стадии, например стадия обработки флуоресцентным материалом той части, которая способна связываться с указанным материалом, или стадия обработки субстратом для ферментной или каталитической реакции.

Комплементарная последовательность стадии (I) может иметь длину, достаточную для специфического связывания с РНК- или ДНК-мишенью, но при этом должна оставаться достаточная часть несвязанной РНК- или ДНК-последовательности, которая связывается с детектируемым олигонуклеотидом стадии (III). Обычно иммобилизованная последовательность составляет примерно половину от длины целевой последовательности, но при увеличении длины целевой последовательности это соотношение может быть меньшим.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения с использованием детектируемого олигонуклеотида детектируемая последовательность этого олигонуклеотида может быть комплементарной всей или почти всей остальной части целевой последовательности, но по мере увеличения длины характерной целевой последовательности эта часть, аналогично указанному выше, может быть меньшей.

Предпочтительно, если иммобилизованный олигонуклеотид является комплементарным последовательности, находящейся ближе к концу или в конце последовательности-мишени, а флуоресцентно детектируемый олигонуклеотид является комплементарным последовательности, находящейся ближе к другому концу или в другом конце последовательности-мишени. Поэтому для того, чтобы эти концы характерной последовательности-мишени сделать более доступными, желательно перед стадией гибридизации провести гидролиз РНК или ДНК с использованием рестриктирующих эндонуклеаз. Аналогично этому во втором предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения необходимо, чтобы детектируемая последовательность имела лишь такую длину, которая была бы достаточной для использования ее в качестве PCR-праймера нужной специфичности, но не более. При этом следует отметить, что оба PCR-праймера могут быть флуоресцентно детектируемыми, что будет способствовать повышению уровня флуоресценции на поверхности волновода, и тем самым увеличению эффективности, соответствующей затуханию колебаний. Во всех случаях предпочтительная длина реагента составляет 5-30, более предпочтительно 10-25, а в частности, 15-20 оснований.

При этом следует учесть, что указанные комплементарные последовательности необязательно должны быть комплементарными в каждой паре оснований, где они гибридизируются. Так, например, каждый специалист может легко определить условия жесткости для статистически допустимого использования дефектного спаривания олигомеров (например, последовательностей, комплементарных на 90%); а также может получить достаточно хороший результат путем корректировки температуры гибридизациии, при которой используются такие "дефектно спаренные" последовательности.

Требования к использованию абсолютно точно комплементарных последовательностей варьируются в зависимости от уникальности последовательности, предназначенной для исследования. Так, например, последовательность, которая имеет высокий процент схожести оснований с другими потенциально присутствующими последовательностями, требует использования большей степени комплементарности, чем в случае ее относительного отличия. Таким образом, если исследуемая последовательность является выявленной не полностью, либо она является измененной, то специалист может легко определить статистически приемлемые олигомеры для стадий (I) и (III).

Во втором варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к тест-набору для использования в способе данного изобретения, содержащему: (1) олигонуклеотид, комплементарный всей или части олигонуклеотидной последовательности, характерной для РНК или ДНК исследуемого материала; и (2) флуоресцентно детектируемый олигонуклеотид, комплементарный или идентичный части или всей остальной характеристической последовательности РНК или ДНК исследуемого материала.

При выборе компонентов (1) и (2) следует руководствоваться соображениями, указанными выше или в формуле изобретения; причем набор указанных компонентов может быть, но необязательно, дополнен реагентами, необходимыми для иммобилизации олигомера (1) на волноводе и описанными в нижеприведенном обсуждении методов настоящего изобретения.

В третьем варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к волноводу, подходящему для использования в биологических датчиках и отличающемуся тем, что он содержит на своей поверхности иммобилизованный олигонуклеотид, комплементарный всей или части олигонуклеотидной последовательности, характерной для РНК- или ДНК-последовательности исследуемого материала. Кроме того, наборы, содержащие указанные волноводы, предназначены для использования в методе настоящего изобретения, описанном в формуле изобретения.

В четвертом варианте своего осуществления настоящее изобретение относятся к биосенсору, включающему детектор затухания колебаний, отличающемуся тем, что он содержит волновод, который имеет иммобилизованный на его поверхности олигонуклеотид, комплементарный всей или части олигонуклеотидной последовательности, характерной для НК- или ДНК-последовательности исследуемого материала. Такой волновод может, например, иметь форму призмы, пластины или волокна.

При этом следует отметить, что во всех вариантах настоящего изобретения, одновременно могут быть коньюгированы несколько характерных последовательностей с использованием нескольких типов иммобилизованных нуклеотидов и флуоресцентно детектируемых связывающих агентов в данном конкретном методе и приборе.

Преимущества метода настоящего изобретения по сравнению с аналогичными системами иммуноанализа заключаются в том, что:
(a) более плотная упаковка иммобилизованного компонента на поверхности волновода позволяет увеличить чувствительность и динамический диапазон метода и дает возможность конструировать более простые поверхности с мультиспецифичностью;
(b) связывание между анализируемым образцом и иммобилизованными и дериватизированными олигонуклеотидами может регулироваться путем корректировки условий гибридизации и длины олигонуклеотидов, что, в конечном счете, позволяет получить нужную специфичность и чувствительность теста, удовлетворяющие соответствующим требованиям;
(с) обычные иммуноанализы ограничены доступностью и стабильностью реагентов, разнообразием антигенных свойств, маскированием антигенной детерминанты и константами диссоциации комплексов антитело/антиген. В этом отношении анализ с использованием генных зондов имеет значительные преимущества;
(d) флуоресцентные иммуноанализы имеют ряд недостатков, связанных с воздействием загрязнения окружающей среды и неспецифического связывания, тогда как в анализах настоящего изобретения с использованием генных зондов необходимость применения более высоких температур (более 60^oC, вместо 37^oC) позволяет уменьшить нежелательную адсорбцию примесей на поверхности детектора;
(e) благодаря более низким константам диссоциации, получаемым для нуклеиновокислотных комплексов, по сравнению с иммунными комплексами, может быть полностью реализована высокочувствительная технология применения детектора затухания колебаний.

В качестве исследуемых образцов могут быть использованы природные материалы (например, свободные РНК- или ДНК-олигонуклеотиды), или материалы, заранее обработанные, например, путем клеточного лизиса, ДНК/РНК-концентрирования или амплификации (например, посредством полимеразно-цепной реакции с использованием Taq-полимеразы), или путем деградации с помощью рестрикционных ферментов (например, для получения олигонуклеотидов нужного размера).

Возможные применения способа, наборов и устройства настоящего изобретения проиллюстрированы в описанных ниже экспериментах и сопровождающих их рисунках, на основании которых любой специалист может найти и другие применения настоящему изобретению.

На фиг. 1 показаны главные элементы используемого в примерах детектора затухания колебаний; на фиг. 2 - график зависимости напряжения от времени, полученный после гибридизации меченного флуоресцеином 20-мера с комплементарной последовательностью, ковалентно связанной с волоконным световодом; на фиг. 3 - кривые зависимости "концентрация-ответ", иллюстрирующие специфическую гибридизацию комплементарного и контрольного олигонуклеотидов. Эти кривые построены в виде графиков зависимости сигнала (мВ/мин) от концентрации (нМ) олигомера; на фиг. 4 - влияние скорости потока раствора образца, проходящего через терморегулируемую камеру, содержащую световод, на сигнал гибридизации. Это влияние проиллюстрировано в виде кривой зависимости сигнала (мВ/мин) от скорости потока (мл/мин); на фиг. 5 - влияние температуры на скорость гибридизации; это влияние проиллюстрировано в виде кривой зависимости сигнала (мВ/мин) от температуры (^oC) для 50 нг/мл образца 20-мера, меченного флуоресцеином; на фиг. 6 - pH-профиль гибридизации нуклеотидов на оптическом волоконном волноводе, представленный в виде кривой зависимости сигнала (мВ/мин) от pH; на фиг. 7 - связывание (в 8 нМ-растворах) олигомеров, комплементарных проксимальному или дистальному концу ковалентно связанного олигонуклеотида, состоящего из 204 оснований; на фиг. 8, a-h - схема, иллюстрирующая на молекулярном уровне два варианта осуществления способа настоящего изобретения.

Методы.

Поскольку олигонуклеотиды являются длинноцепочечными молекулами, длина которых сравнима с глубиной зоны затухания, то для оценки влияния длины зонда на обнаружение использовали короткие, меченные флуоресцеином олигонуклеотиды, которые гибридизировали с любым концом олигомера из 204 оснований (фрагмента, амплифицированного из протективного антигенкодирующего гена (Bacillus anthracis), связанного своим другим концом с поверхностью волновода.

Материалы.

Глутаральдегид, 3-аминопропилтриэтоксисилан (APT); Твин-20; Фиколл; формамид; поливинилпирролидон; фракция V альбумина бычьей сыворотки (BSA); стрептавидин, меченный пероксидазой хрена (HRP-SA); 2,2-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота) (ABTS), хлорид натрия и тринатрийцитрат были получены от Sigma Chemical Company, Poole, UK. Мононатрийортофосфат, динатрийортофосфат, додецилсульфонат натрия (ДСН), перекись водорода, соляная кислота и ацетон представляли собой чистые химические реагенты (AR-стандарт) и поставлялись от BDH Polle, UK. Гидроксид аммония получали от Aldrich, Gillingham Dorset, UK, а этанол от Hayman Ltd., Witham, Essex, UK. Стрептавидин, иммобилизованный на агарозных гранулах, получали от Pierce и Warriner, Chester, UK. Синтетические ДНК-олигонуклеотиды с C₆-связанными, флуоресцеин-, амино-, или биотин-модифицированными концами, полученные от British Bio-Technology Ltd, Abingdon, UK, представлены в табл. 1.

Оптический волоконный детектор затухания колебаний (прототип N 19) и кварцевое оптическое волокно (1 х 65 мм) получали от ORD, Nоrth Salem, New Hampshire, USA (см. фиг. 1). Свет от источника 1 в виде вольфрамовой нити в 6 Вт проходит через три коллиматорные линзы 2, между которыми находится синий фильтр 3 (485 мм) и маска с точечным проколом 4 (0,8 мм), и попадает на устройство для разделения луча (50:50) 5, которое периодически направляет луч через фокусирующую линзу 6 в олигонуклеотиднесущий волновод 7. Флуоресцентное излучение от любого связанного (например, гибридизированного или интеркалированного) флуоресцирующего материала, возбуждаемое попадающим на него светом, идет в обратном направлении из волновода 7, через линзу 6, и проходя через устройство для разделения луча, попадает на зеленый фильтр (530 нм) 8, из которого это излучение проходит через устройство для прерывания потока 9 и фокусирующую линзу 10, попадает, наконец, в детекторное устройство 11, подключенное к измерительному прибору, такому, как вольтметр (не показан).

Выходное напряжение от вольтметра подается, как правило, на регистрирующее устройство (Pharmacia model 482). Оптическое волокно держали в проточной кювете, снабженной рубашкой, и изготовленной из стеклянной капиллярной трубки, концы которой снабжены крышками из нержавеющей стали и силиконовыми прокладками. Температуру регулировали путем пропускания воды из водяной бани через стеклянную рубашку. Слежение за температурой осуществляли с помощью термопары. Оптические волокна очищали, а затем проводили ковалентное связывание с глутаральдегидом по методу, описанному Tijssen (1985), "Practice and Theory of enzyme immunoassays": pp 322-323, vol 15 Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Ed: Burdon and van Knippenburg: Pub. Elsevier.

Волокна силанизировали в 2%-ном растворе APTS в ацетоне в течение 24 ч при комнатной температуре, промывали ацетоном, осушали при 50^oC, погружали на 1 ч в 1% глутаральдегид в воде, промывали в PBS, и наконец, оставляли на ночь при 4^oC в 10 мкг/мл раствора олигонуклеотида с аминоконцом. Для проведения анализа оптическое волокно с иммобилизованным олигонуклеотидом промывали в деионизованной воде, осушали путем промокания, вносили в проточную кювету. Для оптимизации использовали условия, адаптированные из метода Anderson & Young (1985), нуклеиновокислотную гибридизацию проводили по методу Hames и Higgins, Ed. IRL Press, Oxford, стр. 73-111. Температуру воды в рубашке доводили до 65^oC.

Раствор для предгибридизации (250 мл 20 х SSC + 50 мл 100-х раствора Денхардта, 50 мл 0,1 M фосфатного буфера и 1 мл Твина-20 добавляли в 600 мл стерильной деионизованной воды, конечное значение pH 6,8) накачивали с помощью перистальтического насоса на волокна, находящиеся в проточной кювете (25 мкл) при 0,5 мл/мин до тех пор, пока не будет получена устойчивая базовая линия. Затем с той же самой скоростью потока вводили целевой, меченный по концу флуоресцеином олигонуклеотид в предгибридизационном растворе и следили за гибридизацией, которая фиксировалась как увеличение выходного сигнала на регистрирующем устройстве. Через пять минут предгибридизационный раствор снова направляли в проточную кювету и повышали температуру до 80^oC. Через 10-15 мин весь связанный олигонуклеотид десорбировался, после чего температуру снижали до 65^oC для проведения другого цикла.

Сначала с волокнами связывали лишь короткие (16-20-меры) олигонуклеотиды. Для исследования возможности использования более длинных зондов синтезировали амино-концевой 204-мер посредством PCR, проводимой на целевой последовательности с использованием одного праймера (20-мера), меченного по концу аминогруппой (олиго. 5453), и другого праймера (также 20-мера), меченного по концу биотином (олиго. 1222). Несвязавшийся аминомеченый праймер удаляли с использованием стрептавидина, иммобилизованного на агарозных гранулах, для того, чтобы отделить двухцепочечный PCR-продукт от несвязавшегося аминоконцевого праймера. Аминомеченую цепь из 204 оснований освобождали от комплементарной цепи и гранул путем нагревания в течение 10 мин при 95^oC с последующим быстрым охлаждением в смеси воды со льдом, после чего гранулы удаляли путем центрифугирования. Количество продуцированного таким образом 204-мера было достаточно для получения 0,85 мкг/мл-раствора, используемого для связывания с волокнами.

Анализ олигомеров.

В первоначальном эксперименте с 20-мером были использованы высокие уровни целевого и контрольного олигонуклеотидов. Раствор (200 нМ, 1 мкг/мл) меченного флуоресцеином контрольного олигонуклеотида (олиго. 4950) вводили со скоростью потока 1 мл/мин и при температуре 60^o С в проточную кювету, содержащую волокно с иммобилизованным олигонуклеотидом (олиго. 4946). Сразу после введения наблюдался сдвиг в базовой линии 80 мВ, после чего выходной сигнал оставался постоянным до тех пор, пока снова не был введен предгибридизационный раствор, в результате чего выходной сигнал возвращался к своему предыдущему уровню. В противоположность этому, при введении олиго. 4947, который является комплементарным олиго. 4946, иммобилизованному на волокне, в концентрации 160 нМ (также со скоростью 1 мгк/мл), наблюдалось постепенное увеличение сигнала с исходной крутизной около 350 мВ/мин. Через 14 мин достигалось плато при сигнале на 1,140 мВ выше базового уровня. При пропускании предгибридизационного раствора при 90^oC через проточную кювету снова наблюдалось падение сигнала. Для того, чтобы подтвердить специфичность связывания, было показано, что контрольный олиго. 4950 связывается на оптическом волокне со своим комплементом (олиго. 4949), ковалентно связанным с поверхностью этого волокна.

Процесс гибридизации 8 нМ меченного флуоресцеином олиго. 4947 с иммобилизованным олиго 4946 в зависимости от времени показан на фиг. 2, а на фиг. З показаны кривые зависимости "концентрация-ответ", иллюстрирующие гибридизацию меченного флуоресцеином олиго. 4950 с иммобилизованным олиго. 4949, где в качестве контрольного олигонуклеотида использовали олиго. 4947. Наклоны кривых измеряли через 1 мин после введения образца в проточную кювету.

Результаты оптимизации условий проиллюстрированы на фиг. 4-6. Влияние скорости потока оценивали с использованием растворов (50 нг/мл) олиго. 4047. Данные этого исследования представлены на фиг. 4. Оценивали также зависимость скорости гибридизации от температуры и pH и результаты этой оценки представлены на фиг. 5 и 6 соответственно. Максимальная скорость связывания наблюдалась при 65^oC и при pH 6,8.

На фиг. 7 показаны кривые связывания меченных флуоресцеином олигонуклеотидов (в 50 нМ-растворах) либо с проксимальным, либо с дистальным концом олигонуклеотида из 204 оснований, который одним своим концом ковалентно связан с поверхностью волновода. Как видно из фиг. 7, кривые, построенные для двух указанных случаев, показали небольшое расхождение в ответах, оба из которых проиллюстрировали быстрый подъем до уровня плато 48 мВ (проксимальный конец) или 56 мВ (дистальный конец) примерно через три минуты после введения, с последующим очень небольшим спадом после повторного введение предгибридизационного раствора в проточную кювету. Кривые "концентрация-ответ", построенные с использованием исходных градиентов для гибридизации двух олигонуклеотидов, показали небольшое расхождение между собой (результаты не показаны). Олиго. 4947 при 500 нМ (используемый как контрольный) не связывался с 204-мером.

Детектирование осуществляли в наномолярном диапазоне с линейной зависимостью между ответом и концентрацией; аналогичные результаты были получены для иммуноанализа с использованием указанного биодатчика.

Для проведения анализов, требующих высокой чувствительности, могут быть введены некоторые усовершенствования в методах проведения анализа и оборудовании.

Для детектирования гибридизации могут быть использованы меченые олигомеры, полученные с применением олигонуклеотидов, меченных несколькими флуорофорами, либо флуоресцентных гранул, либо флуоресцентных интеркалирующих красителей.

Биосенсорный анализ может быть скомбинирован с техникой ДНК- амплификации, например PCR, которую проводят перед стадией гибридизации на волноводе, предпочтительно с использованием меченных флуорофором праймеров (как в одном из предпочтительных вариантов способа настоящего изобретения, описанного выше), что способствует улучшению детектирования продукта. Это позволяет также осуществлять непосредственный мониторинг PCR-реакций с использованием биосенсора. Для проведения биосенсорного анализа требуется всего 60 с или около того, что на несколько порядков быстрее, чем это необходимо для проведения стандартного анализа с использованием генных зондов, и гораздо быстрее, чем время проведения обычных экспресс-тестов, для осуществления которых требуется около 1 ч (Engleberg, 1991, ASM News 57 (4) 183-186).

Быстрая регенерация детекторной поверхности посредством удаления связанных нуклеиновых кислот путем нагревания позволяет решить одну из проблем, с которой сталкиваются специалисты при проведении иммуноанализов на подобных системах, и позволяет получить результат уже через 60 с, что может оказаться очень важным в военных условиях или в других экстремальных условиях, требующих быстрой идентификации. Некоторые оптические волокна, как уже было установлено, могут быть использованы в течение нескольких дней, не обнаруживая, при этом, каких-либо потерь в чувствительности.

Были использованы оба 5' и 3' B-меченных олигонуклеотида; причем, этот фактор не оказывал какого-либо заметного влияния на результаты анализа. Было проведено также связывание олигонуклеотидов с проксимальным и дистальным концами олигонуклеотида из 204 оснований. Общая длина их составляла от 70 нм (исходя из того, что один шаг двухцепочечной спирали ДНК, которая имеет 10 оснований на спираль, составляет 3,4 нм) до 200 нм (с учетом расстояний промежуточных связей для повторов -O-P-O-C-C-C вдоль каркаса молекулы). Глубина зоны затухания, определяемая как расстояние, за которое интенсивность излучения падает до 1/e от своего первоначального значения, составляла примерно 100 нм, что сравнимо с длиной 204-мера. Поскольку для гибридизации меченных флуоресцеином дистальных и проксимальных олигонуклеотидов были получены сходные сигналы (для дистального олигонуклеотида были получены чуть большие сигналы), то можно предположить, что ориентация длинных олигонуклеотидных цепей была не перпендикулярна поверхности волновода.

Лишь ограниченное количество 2204-мера, который был генерирован с помощью PCR из более крупной целевой последовательности, могло связываться с оптическими волокнами, чем, очевидно, была обусловлена его относительно низкая концентрация на поверхности волновода. Этим фактором можно объяснить быстрое достижение участка плато у кривых зависимости сигнала от времени на фиг. 7 по сравнению с эквивалентными кривыми на фиг. 2 (где иммобилизованные генные зонды, будучи ковалентно связанными из > 100-х-концентрированного раствора, имели более высокую концентрацию). Если в качестве критерия связывания брать не скорость изменения сигнала, а высоту плато, то ограничение количества иммобилизованных зондов, дающего насыщение, может быть достигнуто быстрее.

Осуществление настоящего изобретения на молекулярном уровне проиллюстрировано на фиг. 8, где a-c и d-f относятся к первому и второму предпочтительным вариантам настоящего изобретения соответственно. В а олигонуклеотидная последовательность (A), которая комплементарна части олигонуклеотидной последовательности, характерной для целевой ДНК-последовательности (B), была иммобилизована на запредельном волноводе детекторного устройства с помощью вышеописанных методов. В b иммобилизованный олигонуклеотид обрабатывали в условиях гибридизации раствором исследуемого образца или целевой ДНК-последовательности (B), где этот характеристический олигонуклеотид гибридизировался с последовательностью (A). В c указанный раствор образца заменяли (также в гибридизирующих условиях) раствором, содержащим меченный флуоресцеином олигонуклеотид (C), который является комплементарным оставшейся негибридизированной части целевого олигонуклеотида, и который аналогичным образом гибридизировался. После гибридизации флуоресцеин дает излучение в зоне затухания волновода.

В d комплементарная последовательность (A) была иммобилизована на запредельном волноводе детектора, как описано выше; в e раствор образца обрабатывали в условиях PCR, двумя праймерами (D) и (E), каждый из которых соответствует характеристической последовательности одного из двух концов целевой характеристической последовательности (B). Праймер для конца последовательности, противоположного тому концу, который гибридизируется с иммобилизованным олигонуклеотидом (A), метили флуоресцеином, в результате чего получали меченную флуоресцеином целевую последовательность (F). В f иммобилизованную последовательность (A) обрабатывали раствором образца в гибридизирующих условиях, в результате чего меченная флуоресцеином целевая последовательность (F) гибридизировалась с последовательностью (A), и могла быть обнаружена детектором благодаря индуцированной флуоресценции.

В предпочтительном варианте осуществления способа настоящего изобретения, иллюстрируемого фиг. 8, а особенно при использовании PCR или других методов специфической амплификации, иммобилизованный олигонуклеотид (A) выбирают таким образом, чтобы он был неспособен связываться с праймерами (D) и (E), в результате чего избыточное количество этих праймеров не будет приводить к блокированию иммобилизованного участка. Так, например, в этом варианте метода, олигонуклеотид (A') будет гибридизироваться с участком (F), который занимает более центральное положение в последовательности (B), чем праймер (D), в результате чего конец (F), не несущий флуорофор, будет таким, как показано на фиг. 8,g.

Вариант способа настоящего изобретения с использованием интеркалирующего красителя, хотя и не отражен в конкретных примерах данного описания, однако его осуществление наилучшим образом может быть проиллюстрировано фиг. 8, a и b, где указанные стадии могут быть проведены в присутствии этого красителя или с его последующим добавлением. Подходящие для этой цели красители, а также условия их применения описаны в литературе, см., например, Latt и Wohileb; Chromosoma (Berl) 52, 297-316 (1975), Jorgenson et al., Chromosoma (Beri. ) 68, 287-3-2 (1978) и Jennings и Ridler; Biophysics of Structure and Mechanism, 10, 71 - 79 (1983).

Изобретение относится к генной инженерии, а именно к способу проведения анализов с помощью генных зондов и с использованием биосенсора, включающего детектор затухания колебаний. Изобретение позволяет усилить чувствительность анализа и ускорить его проведение. Получают олигонуклеотид, комплементарный всей или части олигонуклеотидной последовательности, характерной для РНК иди ДНК исследуемого материала, и иммобилизованный на поверхности волновода детектора затухания колебаний. Содержание характерной последовательности обогащают путем амплификации специфических последовательностей, которую осуществляют в присутствии иммобилизованного олигонуклеотида. Полученный иммобилизованный олигонуклеотид обрабатывают раствором образца материала или ДНК, или РНК, полученных из этого материала в условиях, позволяющих ДНК или РНК гибридизоваться с иммобилизованным олигонуклеотидом. Проводят связывание иммобилизованного олигонуклеотида с флуоресцентно детектируемым агентом. Условия подбирают таким образом, чтобы флуоресцентно детектируемый агент связывался с продуктом гибридизации. Измеряют количество флуоресцентного детектируемого агента, используя детектор затухания колебаний. Устанавливают взаимосвязь между измеренным количеством и присутствием, идентичностью и/или количеством исследуемого материала. Набор для анализа включает олигонуклеотид, комплементарный части олигонуклеотидной последовательности, характерной для РНК или ДНК оцениваемого материала, и флуоресцентно детектируемый агент. Олигонуклеотид иммобилизован на поверхности детектора затухания колебаний на оптическом волноводе. 4 с. и 22 з.п. ф-лы, 1 табл., 8 ил.

1. Способ обнаружения идентификации и/или количественной оценки материала, выбранного из тканей растений или животных, микроорганизмов, или освобожденных из клеток РНК или ДНК, предусматривающий:
(I) получение олигонуклеотида, комплементарного всей или части олигонуклеотидной последовательности, характерной для РНК или ДНК данного материала, и иммобилизованного на поверхности волновода детектора затухания колебаний;
(II) обработку иммобилизованного олигонуклеотида, полученного в стадии (I), раствором образца материала, или ДНК, или РНК, полученных из этого материала, в условиях, при которых ДНК или РНК, имеющие характерную олигонуклеотидную последовательность, будут гибридизироваться с иммобилизованным олигонуклеотидом;
(III) связывание иммобилизованного олигонуклеотида, полученного в стадии (I), или нуклеиновокислотного материала, полученного из образца, с флуоресцентно детектируемым агентом до, в течение или после гибридизации с ДНК или РНК в условиях, указанных в стадии (II), таким образом, чтобы этот флуоресцентно детектируемый агент связывался с продуктом гибридизации и не связывался с негибридизированным иммобилизованным олигонуклеотидом;
(IV) измерение количества флуоресцентно детектируемого агента, связанного как описано в стадии (III), используя детектор затухания колебаний и установление взаимосвязи между этим измеренным количеством и присутствием, идентичностью и/или количеством исследуемого материала, отличающийся тем, что содержание характерной последовательности обогащают путем амплификации специфических последовательностей, которую осуществляют в присутствии иммобилизованного олигонуклеотида стадии (I). 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что амплификацию специфической последовательности осуществляют в растворе в контакте с волноводом детектора затухания колебаний. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что флуоресцентно детектируемым агентом является флуоресцентно детектируемый интеркалирующий краситель, способный встраиваться в дуплекс продукта гибридизации, причем указанный носитель не связывается с негибридизированными иммобилизованными олигонуклеотидами. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что амплификация специфической последовательности представляет собой реакцию амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (PCR) или лигазной цепной реакции (LCR). 5. Способ по пп.1, 3 или 4, отличающийся тем, что флуоресцентно детектируемым агентом является флуоресцентно детектируемый олигонуклеотид, который способен гибридизироваться с гибридизированной характерной последовательностью стадии (II). 6. Способ по п.1, или 3, или 4, или 5, отличающийся тем, что для реакции амплификации специфической последовательности в качестве праймера используют флуоресцентно детектируемый агент. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что праймером для амплификации специфической последовательности является праймер для полимерной цепной реакции. 8. Способ по п.1 или 5, отличающийся тем, что осуществляют
(I) получение олигонуклеотида, комплементарного части олигонуклеотидной последовательности, характерной для РНК или ДНК исследуемого материала, иммобилизованного на поверхности волновода детектора затухания колебаний;
(II) получение флуоресцентно детектируемого олигонуклеотида, который является комплементарным всей или части остальной характерной последовательности;
(III) обработку иммобилизованного олигонуклеотида, полученного в стадии (I), раствором, содержащим исследуемый материал, или ДНК, или РНК, полученную из этого материала, в условиях, при которых характерная олигонуклеотидная последовательность будет гибридизироваться с иммобилизованным олигонуклеотидом;
(IV) замену раствора материала из стадии (III) раствором, содержащим флуоресцентно детектируемый комплементарный олигонуклеотид из стадии (II); и
(V) измерение количества связанного флуоресцентно детектируемого олигонуклеотида, используя детектор затухания колебаний и установление соотношения между этим измеренным количеством и присутствием, идентичностью и/или количеством целевого материала в образце. 9. Способ по пп.1, 6 или 7, отличающийся тем, осуществляют
(I) получение олигонуклеотида, комплементарного части олигонуклеотидной последовательности, характерной для РНК или ДНК исследуемого материала, и иммобилизованного на поверхности волновода детектора затухания колебаний;
(II) получение флуоресцентно детектируемого олигонуклеотида, который является идентичным всей или части остальной характерной последовательности;
(III) осуществление реакции амплификации специфической последовательности на образце исследуемого материала, где в качестве одного из праймеров используется флуоресцентно детектируемый олигонуклеотид стадии (II), причем в результате этой реакции амплифицируется любая присутствующая характерная последовательность, в которую вводится флуоресцентно детектируемый агент;
(IV) обработку иммобилизованного на волноводе комплементарного олигонуклеотида стадии (I) реакционной смесью из стадии (III) в условиях, при которых может происходить гибридизация амплифицированного продукта с указанным иммобилизованным олигонуклеотидом;
(V) оценку флуоресцентно детектируемого олигонуклеотида, гибридизированного с иммобилизованным олигонуклеотидом, при помощи детектора затухания колебаний и установление соотношения между этой оценкой и количеством амплифицированного материала, первоначально присутствовавшего в образце. 10. Способ по любому из пп.1 - 9, отличающийся тем, что волновод изготавливают в виде призмы, пластины или волокна. 11. Способ по любому из пп.1 - 10, отличающийся тем, что волновод находится в термоконтролируемых условиях. 12. Способ по пп.11, отличающийся тем, что термоконтролируемые условия достигаются в камере с терморегулированием. 13. Способ по любому из пп.1 - 12, отличающийся тем, что флуоресцентно детектируемые комплементарные олигонуклеотиды получают путем мечения соответствующих олигонуклеотидов флуоресцирующей меткой либо группой, с которой может связываться флуоресцирующий материал, либо ферментом или катализатором, способным генерировать флуоресцирующий материал. 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что комплементарный олигонуклеотид метят флуоресцеином. 15. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид метят ферментом или катализатором, способным генерировать флуоресцентное излучение, и перед измерением флуоресценции с помощью детектора затухания колебаний добавляют субстрат для этого фермента или катализатора. 16. Способ по пп.1 - 15, отличающийся тем, что исследуемый материал обрабатывают рестриктирующими эндонуклеазами для расщепления его РНК или ДНК. 17. Способ по пп.1 - 16, отличающийся тем, что комлементарные или идентичные олигонуклеотиды выбирают из олигонуклеотидов с длиной от 5 до 30 оснований. 18. Способ по п.17, отличающийся тем, что олигонуклеотиды имеют длины от 10 до 25 оснований. 19. Способ по п.18, отличающийся тем, что олигонуклеотиды имеют длины от 15 до 20 оснований. 20. Набор для анализа, включающий олигонуклеотид, комплементарный части олигонуклеотидной последовательности, характерной для РНК или ДНК детектируемого, идентифицируемого и/или количественно оцениваемого материала, отличающийся тем, что он дополнительно содержит флуоресцентно детектируемый агент, при этом олигонуклеотид иммобилизован на поверхности детектора затухания колебаний на оптическом волноводе. 21. Набор по п.20, отличающийся тем, что в качестве флуоресцентно детектируемого агента используют интеркалирующий краситель. 22. Набор по п.20, отличающийся тем, что в качестве флуоресцентно детектируемого агента используют олигонуклеотид, комплементарный всей или части остальной характерной последовательности. 23. Набор по любому из пп. 20 - 22, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид не иммобилизован на поверхности волновода и дополнительно содержит реагенты, пригодные для иммобилизации на волноводе. 24. Оптический волновод, содержащий оптический детектор затухания волн и световод, отличающийся тем, что на всей поверхности световода иммобилизован олигонуклеотид, являющийся комплементарным всей или части олигонуклеотидной последовательности, характеризующей РНК- или ДНК-последовательности, являющейся объектом исследования. 25. Биосенсор, содержащий оптический детектор затухания волн и световод, отличающийся тем, что световод помещен в термостатируемую среду, способную регулировать жесткость гибридизации и/или проведение термоциклов полимеразной цепной реакции. 26. Биосенсор по п.22, отличающийся тем, что на всей поверхности световода иммобилизован олигонуклеотид, являющийся комплементарным всей или части олигонуклеотидной последовательности, характеризующей РНК- или ДНК-последовательности, являющейся объектом исследования.