ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ АНТИАНЕМИЙНЫЙ И ИММУНОКОРРЕГИРУЮЩИЙ ДРОЖЖЕВОЙ ПРЕПАРАТ Российский патент 1998 года по МПК A61K35/72 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно, к производству лечебно-профилактических средств для человека.

Известен целый ряд препаратов, содержащих железо, применяемых для лечения железодефицитных анемий (ЖДА) различной этиологии [1,2]. Эти препараты представляют собой те или иные соли железа. Общей проблемой, связанной с их применением, является плохая всасываемость железа в желудочно-кишечном тракте. В связи с этим приходится назначать высокие дозы (по 100-200 мг, в пересчете на железо), что вызывает целый ряд побочных эффектов: пропадает аппетит, наблюдаются тошнота, рвота, диарея [1]. Возможно возникновение запоров, так как железо связывает в кишечнике сероводород, являющийся физиологическим стимулятором перистальтики [2]. Препараты железа могут вызывать потемнение (почернение) зубов, что связано с образованием нерастворимого сульфида железа при взаимодействии железа с сероводородом, который может содержаться в полости рта. Нередко эти препараты рекомендуют запивать разведенной соляной кислотой с целью улучшения всасываемости. Неприятный характерный вкус препаратов железа нередко, особенно у детей, создает сложности при приеме препаратов внутрь [2]. Отмечаются также аллергические реакции в виде кожных высыпаний и зуда [1].

В качестве прототипа нами был выбран гемофер пролангатум [1], препарат, выпускающийся в виде драже, содержащих по 105 мг Fe в виде соли FeSO₄. Производится в Польше. Рекомендуемые дозы: профилактическая - 105 мг в сутки, терапевтическая - 210 мг Fe [1]. Как и в случае многих других препаратов железа, прием гемофера зачастую сопровождается тошнотой, рвотой и другими диспепсическими расстройствами.

Прототипом на применение предлагаемого нами препарата являются хлебопекарные или пивные дрожжи (те и другие пренадлежат к роду Saccharomyces виду cerevisiae), традиционно применяемые в народной медицине в виде так называемых дрожжевых напитков с целью иммунокоррекции. Для приготовления напитков дрожжи суспендируют в воде, добавляют пищевой сахар, выдерживают в теплом месте 30-60 минут, затем греют на кипящей водяной бане 10-15 минут. После этого напиток охлаждают и выпивают. Обычно рекомендуемая ежедневная доза для взрослого составляет 30 г прессованных хлебопекарных дрожжей. Стандартный курс лечения - 1 месяц. Существенным недостатком таких напитков является их неприятные вкус и запах. Расы дрожжей, используемые в пивоварении и хлебопечении, а также методы их культивирования не ориентированы на удовлетворительные органолептические свойства продукта, изготовляемого по приведенному выше рецепту. Тепловая обработка на кипящей бане не только усиливает неприятные вкус и запах напитка, но и разрушает целый ряд витаминов и других биологически активных соединений, присутствующих в дрожжах. Однако, исключить тепловую обработку нельзя, так как хлебопекарные дрожжи, выпускаемые отечественными дрожжевыми заводами, согласно действующих ТУ, являются "технически чистыми". Они содержат значительное количество посторонних микроорганизмов и непригодны к употреблению внутрь без стерилизации. Сказанное можно отнести и к пивным осадочным дрожжам.

Цель изобретения: получение лечебно-профилактического дрожжевого препарата, являющегося эффективным источником алиментарного железа и при этом отличающегося удовлетворительными вкусовыми (позволяющими широко использовать его, в том числе, в детских учреждениях типа детских садов, оздоровительных лагерей, санаториев, профилакториев), отсутствием побочных эффектов, характерных для препаратов железа, и одновременно оказывающего благотворное влияние на обмен веществ и иммунный статус организма.

Сущность изобретения состоит в следующем.

Предлагаемым препаратом с антианемийным и иммунокоррегирующим действиями являются нативные дрожжи Saccharomyces cerevisiae с высоким (2-3 мг/г сырого веса) содержанием депонированного железа, получаемые путем жидкофазного выращивания на среде с глюкозой, сахарозой или другими сбраживаемыми сахарами и их одновременным обогащением железом путем введения в питательную среду, содержащую не более 0,5-0,8 ммоль/л ионов Mg(II), соли железа (II) в концентрации 1-2 ммоль/л. Можно обогатить железом и уже выращенные обычным способом дрожжи путем их ресуспендирования и инкубации в течение нескольких часов в среде, содержащей сбраживаемый сахар и соль железа(II) в концентрации 1-2 ммоль/л. Обогащенные железом дрожжевые клетки отделяют от питательной среды, отмывают водой и концентрируют до влажности 80-85% центрифугированием или фильтрацией. Полученная биомасса является целевым продуктом и характеризуется следующим химическим составом, в массовых процентах от сухого вещества [3]:
Белки - 39-41,
Клетчатка - 27-29,
Нуклеиновые кислоты - 15 - 17,
Углеводы - 4 - 6,
Жиры - 4 - 5,
Калий - 2,2 - 3,7,
Фосфор - 1,7 - 1,9,
Железо - 1,0 - 1,5,
В качестве источника железа предпочтительнее всего использовать соль Мора: FeSO₄ • (NH₄)₂SO₄, которая характеризуется достаточно хорошей стабильностью и негигроскопична.

Концентрацию ионов Mg(II) в среде выращивания или инкубации следует ограничивать. Это связано с тем, что ионы Fe(II) (а именно в виде ионов Fe(II) железо поглощается дрожжами [4]) и ионы Mg(II) у дрожжей переносятся в клетку, по-видимому, одной и той же транспортной системой плазмалеммы. Об этом свидетельствуют проведенные нами исследования кинетики поглощения Fe(II) клетками, которые показали, что ионы Mg(II) конкурентно ингибируют транспорт Fe(II). Константа Михаэлиса поступления ионов Fe(II) K_M = 0,5 ммоль/л, константа ингибирования транспорта железа ионами Mg(II) K_I = 0,16 ммоль/л (неопубликованные данные). Поэтому, для увеличения содержания аккумулируемого дрожжами железа мы уменьшали количество вносимого в питательную среду сульфата магния по сравнению с традиционно принятым. Обычно в дрожжевые питательные среды вносят 1 г/л (8,3 ммоль/л) MgSO₄. Эта величина является, в сущности, избыточной. Так уменьшение вносимого количества MgSO₄ до 0,1 - 0,06 г/л (0,8 - 0,5 ммоль/л) в наших условиях выращивания не влияло ни на скорость роста, ни на выход биомассы. Однако такое уменьшение концентрации ионов Mg(II) более чем на порядок увеличивало содержание аккумулируемого дрожжами железа.

Ввиду того, что ионы Fe(II) при физиологических pH легко окисляются кислородом, превращаясь в ионы Fe(III), которые, взаимодействуя с кислородом, образуют нерастворимую гидроокись Fe(III), при обогащении дрожжей железом приходится решать технологическую проблему предотвращения загрязнения дрожжевой биомассы продуктами гидролиза солей железа. Во-первых, выращивание дрожжевой культуры следует производить в так называемых полуанаэробных условиях, при низких напряжениях O₂. Во-вторых, следует поддерживать достаточно низкий pH среды (от 3 до 5), поскольку при более высоких pH скорость окисления и гидролиза железа значительно выше. В-третьих, необходимо введение в жидкую питательную среду специального стабилизатора, в присутствии которого неизбежно образующаяся в среде гидроокись железа (III) образовала бы стабильный коллоидный раствор. Поддержание гидроокиси в коллоидном состоянии предотвращает загрязнение дрожжевой массы коагулировавшими продуктами гидролиза железа. В этом случае практически все железо, представленное в препарате, локализовано внутри дрожжевых клеток (а именно в клеточных вакуолях [3]), а не сорбировано в виде гидроокиси Fe(III) на клеточной поверхности. В качестве стабилизатора удобно использовать пищевую желатину в количестве 1 - 2 г на литр среды. Отметим, что поскольку ионы Fe(II) стабильны в водных растворах, а их окисление в Fe(III) происходит только в присутствии O₂, культивирование и обогащение дрожжей железом в анаэробных условиях снимает проблемы, связанные с гидролизом солей железа.

Выращенные и обогащенные железом дрожжи отделяют от питательной среды, отмывают и концентрируют центрифугированием или фильтрованием до влажности 80 - 85%. Полученная таким образом биомасса является целевым продуктом. Она расфасовывается в стерильную тару и хранится при 0 - 5^oC. Срок хранения 3 недели.

Дрожжи как источник алиментарного железа должны употребляться в нативном виде. Недопустима, в частности, их тепловая обработка (способ употребления см. ниже). Это обстоятельство ужесточает требования к микробиологической чистоте продукта и предусматривает стерильные условия при выращивании дрожжей и строгое соблюдение санитарных норм, установленных для пищевых предприятий, при расфасовке продукта.

Исключение тепловой обработки дрожжевого препарата перед его употреблением в значительной степени снимает проблему неприятного вкуса. Вкусовые качества препарата существенно зависят от расы используемых дрожжей. Нами была выбрана XII раса, не смотря на то, что она существенно уступает по выходе биомассы, к примеру, расам, обычно используемым в хлебопечении. Еще один прием, улучшающий вкус препарата, состоит в отказе от мелассы как источника углевода и органического азота. Вместо мелассы мы использовали пищевой сахар дрожжевой автолизат [5]. Применение дрожжевого автолизата является, вероятно, одним из важных факторов, обуславливающих высокую иммуномодулирующую активность препарата. Исключение мелассы улучшает также внешний вид препарата: получаемая биомасса имеет белый цвет со слегка кремовым оттенком.

Пример 1. Производство продукта дрожжи: S. cerevisiae, XII раса, штамм 15В-П4, гаплоид, или полученный от него штамм 00585. Среда выращивания: KH₂PO₄ - 2 г/л, (NH₄)₂SO₄ - 1 г/л, MgSO₄ - 80 мг/л, FeSO₄ • (NH₄)₂SO₄ - 200 мг/л, дрожжевой автолизат 30 - 50 г/л, пищевой сахар 20 - 30 г/л, желатина - 10 - 20 г/л.

Условия выращивания: дрожжи выращивали в ферментере емкостью 2 куб.м. с непрерывным перемешиванием, при температуре 28 - 30^oC. Время выращивания - одни сутки, до наступления стационарной фазы, обусловленной исчерпанием сахарозы.

После достижения стационарной фазы культуру охлаждали и дрожжи отстаивали не менее суток. Затем среду откачивали и густую суспензию клеток собирали, центрифугировали, промывали дистиллированной водой и расфасовывали в стерильные 100-граммовые баночки из-под детского питания. Продукт может хранится при 0 - 5^oC в течение трех недель без ухудшения потребительских свойств.

Сущность изобретения на применение состоит в том, что дрожжи S. cerevisiae, обогащенные железом применяют в качестве источника алиментарного железа для лечения и профилактики железодефицитных анемий, а также комплексного средства для лечения железо- и иммунодефицитных состояний.

Способ употребления препарата.

Препарат рекомендуется употреблять в виде дрожжевого напитка, приготавливаемого согласно прописи: 10 г дрожжевой массы (1 ч.л.) размешать в 0,5 стакана теплой кипяченой воды, добавить 0,5 ч.л. меда (или 0,5 ч.л. сахара, или 1 ч.л. сахарного сиропа). Поставить смесь в теплое место на 2 - 3 часа. Тщательно перемешать и выпить натощак за 0,5 - 2 часа до еды.

Во время инкубации дрожжей со сбраживаемыми сахарами депонированное в вакуолях дрожжевых клеток 3-валентное железо восстанавливается до 2-валентного состояния, сравнительно легко всасывающегося в желудочно-кишечном тракте, что способствует высокой усвояемости аккумулированного в дрожжах железа.

Нагревание препарата не только нецелесообразно, но и недопустимо, так как приводит к выходу железа из клеток, его окислению и гидролизу, то есть, переводит его в практически неусвояемую форму.

Применение препарата в качестве антианемийного средства.

Пример 2. В гематологическом отделении ОКБ г. Иркутска с января по май 1995 г. наблюдались с 25 больных с диагнозом "Хроническая железодефицитная амения (ЖДА) легкой степени тяжести, обусловленная полименореей". Все больные - лица женского пола.

Пациенток разделили на 2 группы:
I - 13 больных - получающие в качестве лечения предлагаемый препарат по 1 ч.л. 1 раз в день(20 мг Fe в сутки) в течение 3-х недель.

II - 12 больных - получающие в качестве лечения железосодержащий препарат гемофер пролангатум по 1 таблетке 2 раза в день (210 мг Fe в сутки) в течение 3-х недель.

Средний возраста пациентов в I группе 37 лет, во II группе - 38 лет.

Результаты лечения представлены в таблице.

Видно, что применение предлагаемого препарата, по крайней мере, для лечения ЖДА легкой степени тяжести, не менее эффективно, чем применение гемофера. Более того, дневная дозировка железа, получаемая пациентами в виде гемофера, составляла 210 мг (обычно назначаемая дозировка, объясняемая плохой всасываемостью железосодержащих препаратов). В то же время, пациентки, принимающие предлагаемый препарат, получали в сутки около 20 мг железа, "упрятанного" внутри дрожжевых клеток, не испытывая при этом никаких дискомфортных ощущений. Высокие дозы железосодержащих солей, обычно назначаемые при диагнозе ЖДА, нередко вызывают у больных тошноту и рвоту, раздражение слизистой желудка и кишечника, аллергические реакции. Неоспоримым достоинством предлагаемого препарата является полное отсутствие подобных эффектов. Представленный пример свидетельствует о высокой усвояемости находящегося в дрожжах железа в желудочно-кишечном тракте человека.

Применение препарата в качестве иммуно-корректора.

Пример 3. В течение 1994 - 95 гг. в Консультативной поликлинике Иркутской ОКБ с помощью предлагаемого препарата пролечено 86 амбулаторных больных, нуждающихся в иммунокоррекции. Курс лечения составлял 1 месяц, дозировка - 1 ч.л. раз в день (в виде дрожжевого напитка, натощак, за час до еды).

Препарат назначали, как правило, в комплексе с пищевыми продуктами, содержащими витамины A и E.

Препарат назначали при широком круге заболеваний:
- затяжных и хронических воспалительных заболеваниях мягких тканей и опорно-двигательного аппарата, сопровождающихся лейкопенией или снижением функции фагоцитирующих клеток:
- астенических состояниях, синдроме хронической усталости, сопровождающихся вторичными иммунодефицитами;
- длительно и частоболеющим ОРВИ детям;
- хр. тонзилите в стадии обострения и ремиссии;
- дифтерийных полиневритах, рассеянном склерозе в стадии неполной ремиссии;
- вторичных иммунодефицитах, сопровождающихся ЖДА.

В большинстве случаев больными субъективно отмечалось значительное улучшение общего состояния. Как правило это подтверждалось данными объективного осмотра больного и данными лабораторного обследования.

Объективным критерием эффективности лечения может служить иммунограмма больного. Приведены два примера.

Больной Соломатов С., 8 лет. Д-з: Хр. необструктивный бронхит. Длительно незаживающая рана мягких тканей.

Иммунограмма от 20.10.94:
Л: 5,3 • 10⁹/л, п - 2, сс-42, э - 16, м - 4, л - 36, Е-РОК 50%,
Е_тр-РОК 48%, Е_тч-РОК 2%, Е_м-РОК - 2%, lg G 9,5 г/л,
lg A 0,44 г/л, lg M 1,04 г/л, АФ 56%, НСТ_сп 4%, НСТ_ст 4%.

После 28-дневного курса лечения предлагаемым препаратом отмечена эпителизация раны.

Иммунограмма от 1.12.94 (после лечения):
Л: 6,5 • 10⁹/л, п - 2, с - 45, э - 11, м - 4, л - 38, Е-РОК 54%,
Е_тр-РОК 40%, Е_тч-РОК 14%, Е_м-РОК - 4%, lg G 10,5 г/л,
lg A 1,88 г/л, lg M 1,04 г/л, АФ 74%, НСТ_сп 4%, НСТ_ст 15%.

Таким образом, в динамике иммунограммы отмечено: увеличение количества лейкоцитов, нормализация хелперно-супрессорного равновесия, увеличение активности фагоцитоза, нормализация резервной функции фагоцитов.

Больной Макушин Г. Н., 39 лет. Д-з: Острая правосторонняя нижнедолевая пневмония, затяжное лечение. ЖДА.

Иммунограмма от 21.02.95.

Л: 6,5 • 10⁹/л, п - 4, с - 40, э - 4, м - 4, л - 48. Е-РОК 48%, Е_тр-РОК 40%, Е_тч-РОК 4%, Е_м-РОК 2%, О-лф 54%, lg G 8,07 г/л, lg A 1,46 г/л, lg M 1,3 г/л, АФ 50%, НСТ_сп 68%, НСТ_инд 32%.

Предлагаемый препарат назначен на фоне лечения антибиотиками и сульфаниламидами, не дававшими значительного улучшения.

Иммунограмма от 9.03.95.

Л: 7,1 • 10⁹/л, п - 2, с - 60, э - 2, м - 2, л - 34. Е-РОК 68%, Е_тр-РОК 60%, Е_тч-РОК 8%, Е_м-РОК 16%, О-лф 16%, lg G 8,07 г/л, lg A 1,24 г/л, lg M 1,25 гл, АФ 84%, НСТ_сп 12%, НСТ_инд 20%.

Таким образом, отмечается увеличение количества лейкоцитов, уменьшение количества незрелых T-клеток, увеличение активности фагоцитоза, нормализация функциональной активности фагоцитирующих лейкоцитов. Динамика иммунограммы согласуется с положительной клинической динамикой.

Представленные примеры свидетельствуют о высокой иммунокорректирующей эффективности предлагаемого препарата. Никаких побочных эффектов от применения препарата не отмечено.

Литература
1. Регистр лекарственных средств России/Крылов Ю.Ф. М.: Инфармхим, 1993. - 1006 с.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Медицина, 1986. Т.2. - 575 с.

3. Семихатова Н.М., Малыгина М.В. Микробиология дрожжевого производства. - М.: Пищевая промышленность, 1970 - 150с.

4. Ковалев Л.М., Козлов Ю.П., Кругликовская Л.И., Янова В.М. Аккумуляция железа дрожжами-сахаромицетами при росте на средах с повышенным содержанием железа // Биологические науки. - 1985. - N 2. - С. 93 - 99.

5. Захаров И.А. и др. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. - Л.: Наука, 1976. - 112 с.

Изобретение относится к медицине и касается лечебно-профилактического антианемийного и иммунокоррегирующего дрожжевого препарата. Сущность изобретения заключается в том, что получают препарат с помощью жидкофазного выращивания дрожжей Saccharomyces cerevisiae, обогощения дрожжевых клеток железом и последующего отделения биомассы, являющейся целевым продуктом, от питательной среды, при этом препарат содержит 1 - 1,5% железа от сухого вещества и обладает способностью нормализовать уровень сывороточного железа в крови и улучшать иммунный статус организма. Дрожжевые клетки обогощают железом путем введения в питательную среду 1 - 2 ммоль/л соли Мора при концентрации Mg(II) в среде 0,5 - 0,8 ммоль/л. С целью предотвращения загрязнения биомассы продуктами окисления и гидролиза ионов Fe(II), в питательную среду в качестве коллоидного стабилизатора добавляют 0,1 - 0,2% пищевой желантины. Предложенный препарат является эффективным источником железа, отличается удолетворительным видом, отсутствием побочных эффектов. 10 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Лечебно-профилактический антианемийный и иммунокоррегирующий дрожжевой препарат, характеризующийся тем, что он получен с помощью жидкофазного выращивания дрожжей Saccharomyces cerevisiae, обогащение дрожжевых клеток железом и последующего отделения биомассы, являющейся целевым продуктом, от питательной среды, при этом препарат характеризуется следующим составом, мас.% от сухого вещества:
Белки - 39,0 - 41,0
Клетчатка - 27,0 - 29,0
Нуклеиновые кислоты - 15,07 - 17,0
Углеводы - 4,0 - 6,0
Жиры - 4,0 - 5,0
Калий - 2,2 - 3,7
Фосфор - 1,7 - 1,9
Железо - 1,0 - 1,5
2. Препарат по п.1, отличающийся тем, что дрожжевые клетки обогащают железом путем введения в среду выращивания соли Fe(II) в количестве 1 - 2 моль/л и соли Mg(II) в количестве 0,5 - 0,8 ммоль/л. 3. Препарат по п. 1, отличающийся тем, что дрожжевые клетки обогащают железом после отделения от среды выращивания путем их инкубации в течение 3 - 5 ч в среде, содержащей сбраживаемый сахар и соль Fe(II) в количестве 1 - 2 ммоль/л. 4. Препарат по пп.1 - 3, отличающийся тем, что соли Fe(II) вводят совместно с коллоидным стабилизатором. 5. Препарат по пп.1 - 3, отличающийся тем, что обогащение дрожжей железом проводят в анаэробных условиях. 6. Препарат по пп.1 - 5, отличающийся тем, что в качестве источника железа используют соль Мора. 7. Препарат по пп.1 - 4 и 6, отличающийся тем, что в качестве коллоидного стабилизатора используют желатину в количестве 1 - 2 г на 1 л среды. 8. Препарат по пп.1 - 4, отличающийся тем, что для его производства используют XII расу дрожжей. 9. Препарат по пп.1 - 8, отличающийся тем, что дрожжи после отделения от питательной среды отмывают. 10. Препарат по пп.1 - 9, отличающийся тем, что после отмывки биомассу концентрируют до 80 - 85% влажности. 11. Препарат по пп.1 - 2 и 4 - 10, отличающийся тем, что при выращивании дрожжей в качестве источника углерода используют пищевой сахар 20 - 30 г/л, а в качестве источника органического азота, витаминов и микроэлементов дрожжевой автолизат 30 - 50 мл/л.