ШТАММ БАКТЕРИЙ BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM № 791/БАГ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИДКОГО КОНЦЕНТРАТА БИФИДОБАКТЕРИЙ, КИСЛОМОЛОЧНЫХ ЛЕЧЕБНО-ДИЕТИЧЕСКИХ ПРОДУКТОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК Российский патент 2001 года по МПК C12N1/20 A23C9/12 A61K35/74 

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской микробиологии и представляет собой штамм бифидобактерий вида Bifidobacterium bifidum, который может быть использован для получения жидкого концентрата бифидобактерий, и также для приготовления кисломолочных лечебно-диетических продуктов, бифидосодержащих биологически-активных добавок (БАД) и препаратов-пробиотиков на основе указанного жидкого концентрата бифидобактерий.

Функции нормальной микрофлоры в организме являются жизненно важными и очень обширными: синтезирующая, регуляторная, десенсибилизирующая, дезинтоксикационная, ферментативная, защитная и иммуностимулирующая. Препараты и продукты, содержащие в своем составе бифидобактерии, широко используются для профилактики и лечения дисбактериозов и нормализации микрофлоры кишечника людей, перенесших стрессовые воздействия, антибиотико- и химиотерапию.

За рубежом широко используют препараты-пробиотики и продукты лечебного питания на основе штаммов бифидобактерий видов B. bifidum, В. longum, В. adolescentis, В. breve, В. infantis (патент Франции N 2336886; патент Франции N/2411008; патент Швейцарии N 637297; патент ФРГ 2421066; патент Японии N 05227946; патент США N 4645667).

Однако штаммы бифидобактерий зарубежных фирм-разработчиков ориентированы на создание, преимущественно, лечебно-профилактических препаратов и БАД в сухой форме (таблетки, капсулы). Указанные штаммы имеют существенные недостатки, если их использовать для приготовление препаратов и кисломолочных продуктов в жидкой форме: малые сроки хранения указанных препаратов и продуктов, низкие органолептические качества, которые несущественны для препаратов в сухой форме.

Известен штамм вида B.bifidum N1, выделенный из кишечника грудного ребенка, который широко используется в России для изготовления препаратов на его основе: сухой и жидкий бифидумбактерин, кисломолочный бифидумбактерин.

Недостатком штамма B. bifidum N 1 является то, что наряду с медленной ферментативной активностью в отношении сквашивания молока без ростовых факторов штамм имеет также слабую антагонистическую активность в отношении патогенных микроорганизмов: золотистого стафилококка, шигелл, протея и патогенной кишечной палочки.

Наиболее близким аналогом (прототипом) предлагаемого изобретения является штамм B. bifidum N 791 (Патент РФ N 1347221, МПК A 61 K 35/74, опубл. 01.07.1991 г. ). Штамм Bifidobacterium bifidum N 791 выделен из кишечника здорового грудного ребенка, депонирован в центральном Музее промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика" под номеров ЦМПМ В-3300 и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки палочковидные с V-образными раздвоениями на одном или двух концах, неподвижные, в мазке образуют скопления грамположительные.

В 0,72%-ном печеночном и гидролизатно-молочном агарах образует колонии и виде гречишных зерен или дисков размером до 3 мм в диаметре. В жидких питательных средах растет по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза. Пигмента не образует.

Физиолого-биохимические признаки
Облигатиый анаэроб, оптимальная температура 37,5^oC, pH 7,2-7,4. Ферментирует лактозу с образованием уксусной и + молочной кислот, закисляя среду выращивания до pH 4,0. Арабинозу, ксилозу, маннозу, целлобиозу, инулин, маннит, сорбит, салицин не ферментирует.

Сбраживает молоко с образованием к 16-18 ч стабильного сгустка. Газообразующая способность, каталазообразующая способность, разжижение желатины отсутствует.

Кислотообразующая активность: к 24 ч - 70^o Тернера, к 72 ч - 90-100^o Тернера (на печеночной среде), на гидролизатно-молочной среде - до 100^o Тернера и 200^o Тернера соответственно.

Антагонистические свойства
Проявляет активность по отношению к шигеллам Зонне, Флекснера, энтеропатогенным кишечным палочкам, стафилококкам.

ДНК штамма относится к выраженному ГЦ-типу с коэффициентом специфичности 1,58, молярный процент содержания ГЦ в ДНК равен 61,35. Устойчив к канамицину, мономицину, чувствителен к антибиотикам пенициллинового ряда, кефзолу, гентамицину.

Однако штамм B.bifidum N 791 недостаточно устойчив к повреждающим факторам сред культивирования и агрессивных сред гастроинтестинального тракта (кислот, протеолитических ферментов) при продвижении бифидобактерий штамма в желудочно-кишечном тракте, а следовательно, недостаточна его жизнеспособность и колонизирующие свойства. Кроме того, к недостаткам штамма B.bifidum N 791 относится также то, что клетки этих бифидобактерий утилизируют преимущественно 4 аминокислоты (из 14): Пролин, Тирозин, Лизин, Триптофан и в реакциях переаминирования синтезируют из них другие аминокислоты, что энергетически неоправдано, так как те же самые аминокислоты находятся в свободной форме в питательной среде.

Задачей предлагаемого изобретения является создание такого штамма вида B. bifidum N 791/БАГ, который был бы более устойчив к повреждающим факторам сред культивирования и агрессивных сред гастроинтестинального тpaктa человека, обеспечивал бы утилизацию более широкого спектра аминокислот, т.е. обладал бы более высокой жизнеспособностью и колонизирующими свойствами, что обеспечивало бы получение препаратов и продуктов на его основе с более длительными сроками хранения и более высокими лечебно-профилактическими свойствами.

Для получения штамма B.bifidum N 791/БАГ была проведена селекция штамма B.bifidum N 791. Селекция проводилась без использования каких-либо химических и физических мутагенных агентов посредством длительного поочередного культивирования в двух различных питательных средах: среде Блаурокка и стерильном обезжиренном молоке без ростовых факторов в течение 50 пассажей по следующим морфо-культуральным критериям:
- характерная морфология для культур вида B.bifidum: в среде Блаурокка гр + палочки с бифуркацией, а в молоке без ростовых факторов - палочки;
- скорость свертывания стерильного молока не более 20-22 часов;
- достижение титра бифидобактерий должно быть не менее lg 10 за срок культивирования не более 24 час;
- срок хранения бифидобактерий в жидком виде должен быть не менее 2-х месяцев, в стерильном обезжиренном молоке без ростовых добавок.

Заявляемый штамм Bifidobacterium bifidum N 791 БАГ хранится в лиофилизированном виде и депонирован в коллекции НИИ коллекций культур микроорганизмов ГНЦ ВБ "Вектор" под N В-686 (справка депонента N 0599 от 14.10.1999 г прилагается к материалам заявки) и характеризуется следующими признаками:
Культурально-морфологические признаки
Клетки палочковидные однородной морфологии, V-образные раздвоения на одном или двух концах встречаются крайне редко, неподвижные, в мазке образуют скопления грамположительные.

В гидролизатно-молочной агаризованной среде образуют колонии в виде четких гвоздиков длиной 5-10 мм, толщиной 1 - 2 мм.

В жидких питательных средах растет по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза. Пигмента не образует. Физиолого-биохимические признаки: облигатный анаэроб, оптимальная температура 37,5^oC, pH 7,2-7,4. Ферментирует лактозу с образованием уксусной и + молочной кислот (закисляя среду выращивания до pH 4,0). Арабинозу, ксилозу, маннозу, целлобиозу, инулин, маннит, сорбит, салицин не ферментирует.

Сбраживает молоко без ростовых факторов с образованием к 16-18 ч стабильного сгустка. Газообразующая способность, каталазообразующая способность, разжижение желатины отсутствует:
Кислотообразующая активность: к 24 ч- 100^o Тернера, к 72 ч- 150-200^o Тернера (на печеночной среде), на гидролизатно-молочной среде - до 160^o Тернера и 250^o Тернера соответственно.

Максимальный титр бифидобактерий через 24 ч роста в гидролизатно-молочной агаризованной среде составляет 1-5·10¹⁰.

Максимальный титр бифидобактерий в молочной среде с ростовыми факторами: гидролизатом молока и автолизатом дрожжей через 24 ч роста составляет - (5-10)·10¹⁰, через 30 дней хранения в этой среде - 2-5·10¹⁰.

Максимальный титр бифидобактерий в молочной среде (стерильное обезжиренное молоко) без ростовых факторов через 24 ч роста составляет - 1-2 · 10¹⁰, через 30 дней хранения в этой среде - 1-2 · 10⁸.

Бифидобактерии штамма полностью утилизируют 9 свободных аминокислот в стерильном обезжиренном молоке без ростовых добавок: глицин, аланин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, гистидин, аргинин.

ДНК штамма относится к выраженному ГЦ-типу с коэффициентом специфичности 1,58, молярный процент содержания ГЦ в ДНК равен 61,35.

Антагонистические свойства, устойчивость к антибиотикам:
Проявляет активность по отношению к шигеллам Зонне, Флекснера, энтеропатогенным кишечным палочкам, стафилококкам.

Устойчив к кананицину, мономицину, чувствителен к антибиотикам пенициллинового ряда, кефзолу, гентамицину (см. таблицу 1).

Анализ таблицы 1 показывает, что заявляемый штамм и штамм-прототип в равной степени обладают устойчивостью к антибиотикам.

Условия хранения (консервации и расконсервации) заявляемого штамма.

Штамм В.bifidum N 791БАГ 1-2-3 пассажей культивируют в молочной ростовой среде при 37,5 - 38^oC в течение 16-18 ч до формирования сгустка, кислотность 100 - 120^oC Тернера. К выращенной биомассе добавляют защитную среду высушивания с pH 7,4 (сахароза 10%, желатин 7 - 10%, пептон 1- 3%, аскорбиновая кислота) в количестве 25% от объема биомассы и обезжиренное молоко в количестве 25% биомассы. Полученную суспензию разливают по 5 мл в пенициллиновые флаконы, замораживают при температуре минус 40 - 45^oC и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах в течение 24 - 36 часов. Полученный препарат содержит 0,5-1·10⁹ живых клеток бифидобактерий. Согласно НТД на сухой бифидумбактерин (ФС 42-132 ВС-94) допускается содержание в 1 дозе препарата не менее 10⁷ живых клеток бифидобактерий.

Лиофилизированный штамм B.bifidum N 791БАГ в пенницилиновых флаконах отличается хорошей сохранностью при 6 - 8^oC (в течение 3 - 4 лет без потери титра бифидобактерий).

Поддержание жизнеспособности штамма производится из лиофилизированного препарата через 6-12 месяцев путем 5 пересевов (пассажей) в пробирках на печеночной среде Блаурокка. На 6-ом пасаже пересев делается в молочную ростовую среду с ростовыми добавками вышеуказанного состава с целью получения биомассы для последующей лиофильной сушки и хранения в высушенном состоянии.

Маркерными признаками штамма B.bifidum N 791БАГ, отличающими его от штамма-прототипа B.bifidum N 791 (ЦМПМ В-3300), являются следующие:
- клетки палочковидные однородной морфологии;
- в гидролизатно-молочной агаризованной среде образуют колонии в виде четких гвоздиков длинной 5-10 мм, толщиной 1 - 2 мм;
- кислотообразующая активность: к 24 ч - 100^o Тернера, к 72 ч - 150-200^o Тернера (на печеночной среде), на гидролизатно-молочной среде - до 160^o Тернера и 250^o Тернера соответственно;
- максимальный титр бифидобактерий через 24 ч роста в гидролизатно-молочной агаризованной среде составляет 1-5·10¹⁰;
- максимальный титр бифидобактерий в молочной среде с ростовыми факторами: гидролизатом молока и автолизатом дрожжей через 24 ч роста составляет - (5-10)·10¹⁰, через 30 дней хранения в этой среде - 2-5 · 10¹⁰;
- максимальный титр бифидобактерий в молочной среде (стерильное обезжиренное молоко) без ростовых факторов через 24 ч роста составляет - 1-2 · 10¹⁰, через 30 дней хранения в этой среде - 1-2·10⁸;
- бифидобактерии заявляемого штамма полностью утилизируют 9 свободных аминокислот в стерильном обезжиренном молоке без ростовых добавок: глицин, аланин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, гистидин, аргинин.

Пример 1. Для выявления технологических особенностей и свойств заявляемого штамма проведены исследования штаммов B.bifidum N 791 и B.bifiduin N 791 БАГ в молочной среде без ростовых факторов.

Ниже (таблица 2) приведены ростовые и технологические характеристики штаммов Bifidumbifidum 791 и Bifidumbifidum 791 БАГ в молочной среде без ростовых факторов.

Анализ таблицы 2 показывает, что заявляемый штамм по сравнению с прототипом наиболее полно использует ростовые ресурсы относительно бедной ростовой среды (обезжиренное молоко без ростовых факторов), имеет более высокие ростовые и технологические характеристики по сравнению со штаммом-прототипом, а именно: сокращено время сквашивания на 4 ч, повысился на порядок титр в готовом продукте, а по истечении 30 суток хранения в условиях холодильной камеры биологическая активность заявляемого штамма выше на два порядка. Кроме того, заявляемый штамм по сравнению с прототипом имеет высокую активность кислотообразования, что способствует накоплению летучих кислот в концентрате бифидобактерий и, следовательно, повышенную антагонистическую активность продуктов, полученных с использованием данного штамма. При этом, как видно из табл.2, заявляемый штамм является более устойчивым к действию летучих жирных кислот, поскольку длительное время сохраняет высокое количество жизнеспособных клеток при хранении (в 100 раз более высокое, чем штамм-прототип). Это очень важно при производстве лечебно-диетических кисломолочных продуктов, которые содержат ацидофильные бактерии или болгарскую палочку, являющиеся очень активными кислотообразователями.

Кроме того, исследовались ростовые свойства штаммов B.bifidum 791 и B. bifidum 791 БАГ и гидролизатно-молочной агаризованной среде. Данные приведены в таблице 3.

Таким образом, из таблицы 3 видно, что ростовая активность штамма 791 БАГ в гидролизатно-молочной агаризованной среде заметно выше при меньшей конечной кислотности (135 Т) вместо (159 Т). При одинаковой кислотности титр у штамма 791 БАГ на 1 порядок выше
Пример 2. Использование штамма B.bifidum N 791 БАГ для приготовления жидкого концентрата бифидобактерий (ЖКБ)
Штамм B. bifidum 791/БАШ выращивают в обезжиренном молоке, обогащенном гидролизатно-молочной и автолизатной ростовой добавкой, при 37.5 - 38^oC в течение 16-18 ч до кислотности 100 - 130^o Теpнера. К 16-18 ч культивирования титр активных клеток бифидобактерий в 1 мл среды составляет lg 10,5-11 (с использованием штамма B.bifidum 791 накопление биомассы происходит к 18-24 ч и составляет lg. 9,0-9,3).

Биологически активную добавку (БАД) "жидкий концентрат бифидобактерий" используют в качестве самостоятельного лечебно-профилактического средства, в качестве биологически-активной добавки, а также в качестве закваски для изготовления бифидосодержащих кисломолочных продуктов.

Новые полезные биосинтетические и анаболические свойства отселектированного штамма позволили получить жидкий концентрат бифидобактерий с повышенными биологическими характеристиками:
- титр бифидобактерий в продукте увеличился с 1·10⁹ до 3 - 5·10¹⁰ КОЕ/мл;
- сбалансировано потребление и содержание аминокислот в конечном продукте.

Пример. 3. Исследование аминокислотного состава продуктов, приготовленных на основе штамма B.bifidum 791 БАГ
Исследования аминокислотного состава продуктов, приготовленных на основе штамма B.bifidum 791 БАГ проводились на аминокислотном анализаторе "Biotromik" производства США.

Условия эксперимента
1. Подготовка пробы: осаждение общего белка сульфосалициловой кислотой; удаление белков центрифугированием.

2. Определение содержания свободных аминокислот в пробе выполнялось на аминокислотном анализаторе "Biotronik LC 5001" при следующих параметрах:
- Колонка 3.2х385 мм "Biotronik resin 2710",
- Подвижная фаза: последовательность из пяти цитратных буферных растворов различной кислотности и ионной силы;
- Скорость потока: буфер - 0.3 мл/мин, реагент - 0.55 мл/мин;
- Объем пробы: 50 мкл.

- Количественное определение с использованием калибровочного раствора аминокислот "Hamilton" (USA).

- Детектирование: постколоночное окрашивание раствором нингидрина в ДМСО, L_vis - 570 нм.

Результаты анализа аминокислотного состава жидкого концентрата бифидобактерий приведены в таблице 4.

В жидком концентрате бифидобактерий на основе штамма В. bifidum 791 БАГ повышено содержание свободных аминокислот и достигает порядка 14.7%, из которых доля незаменимых аминокислот достигает 50.01%.

Повышенное количество незаменимых аминокислот из общей суммы свободных аминокислот, особенно таких как: валин - 8.3%, лейцин - 13.4%, лизин - 7.7%, а также метионин - 3.1%, аминокислот с "разветвленной цепью", имеет важное физиологическое значение, поскольку эти аминокислоты наиболее активно участвуют в процессах синтеза белка. Так, недостаток валина приводит к расстройству координации движений, недостаток лейцина вызывает изменения в почках и щитовидной железе, недостаток лизина приводит к нарушению процессов кровообразования. В жидком концентрате бифидобактерий содержание аргинина повышено до 7.7%. Повышенное содержание аргинина биологически важно, поскольку свободный аргинин способствует стимуляции иммунной системы организма, кроме того, он обладает антиоксидантными свойствами, что благоприятно сказывается на увеличении срока хранения жидкого концентрата бифидобактерий.

Несмотря на повышенную утилизацию штаммов B.bifidum 791/БАГ свободных аминокислот во время роста бифидобактерий в молочной ростовой среде, обогащенной ростовыми факторами, в конечном продукте - жидком концентрате бифидобактерий, остается достаточно большое количество свободных аминокислот - 418,39 мг/л, особенно незаменимых. Кроме того, набор свободных аминокислот физиологичен, что подтверждается отношением концентраций аминокислот метионина/изолейцина, равным коэффициенту 0,83, достаточно близкому к коэффициенту 1 (оптимальное физиологическое соотношение).

В таблице 5 приведены данные аминокислотного анализа в молочной среде культивирования (обезжиренное молоко 11% СОМ без ростовых факторов) после 24 ч культивирования штаммов B.bifidum N 791 и B.bifidum N 791 БАГ.

Содержание свободных аминокислот в гидролизатно-молочной среде культивирования после 24 ч культивирования штаммов В. bifidum 791 и В.bifidum 791 БАГ приведены в таблице 6.

Анализ таблицы 5 показывает, что заявляемый штамм по сравнению с прототипом наиболее полно использует ростовые ресурсы относительно бедной молочной среды (обезжиренное молоко без ростовых факторов), максимально полно используя набор аминокислот, некоторые аминокислоты утилизируются в 15-20 раз лучше, чем у штамма-прототипа (за исключением пролина). Таким образом, заявляемый штамм имеет хорошие технологические характеристики при росте на простых молочных средах без добавления специализированных ростовых добавок, что дает возможность удешевить производство жидкого концентрата бифидобактерий.

Из таблицы 6 следует, что отмеченная высокая утилизирующая способность аминокислот из простой молочной среды (в обезжиренном молоке без ростовых добавок) практически не влияет на аминокислотный состав продуктов, полученных с использованием гидролизатов молока и автолизатов дрожжей. Это позволяет получать обогащенные витаминами и аминокислотами биологически активные добавки и продукты питания на основе данного штамма так же, как и с использованием штамма-прототипа.

Пример 4. Исследование антагонистической активности штамма B.bifidiim 791/БАГ
Антагонистическая активность штамма B.bifidum 791/БАГ была изучена методом in vitro при совместном выращивании с патогенными тест-штаммами по зоне задержки роста тест-микробов методом штриховых кодов.

Антагонистическая активность штамма B.bifidum791 БАГ и его колонизационная активность наиболее полно были изучены in vivo на организменно-популяционной модели - лабораторных мышах в хроническом эксперименте.

Исследования были проведены на племенных мышах обоего пола колонии ICR в течение 3 лет на 18 поколениях рандомбринга в количестве 900 самок и 450 самцов.

Жидкий концентрат бифидобактерий производился ни основе штамма B.bifidum 791 БАГ на молочной среде с добавлением ростовых факторов.

Концентрат бифидобактерий применялся в дозе 0,1 мл на голову в сутки в течение 1 месяца ежедневно.

Бактериологические исследования фекалиев мышей проводились в соответствии с методическими указаниями "Дисбактериоз кишечника и методы его лабораторной диагностики".

Проводилось наблюдение за выживаемостью, весом мышей.

На основании данных о числе желтых тел и мест имплантации живых и мертвых эмбрионов определяли пост- и преимплантационную смертность зародышей.

Результаты бактериологического исследования молодняка 1 поколения, полученного от родителей, получавших жидкий концентрат бифидобактерий, показали, что произошло не только значительное снижение уровня патогенной и условно-патогенной микрофлоры, но и увеличение бифидо- и лактобактерий почти в равной степени с 10⁵ до 10⁸-10⁹ микробных тел в 1 г фекалий (табл.8).

Бактериологические исследования фекалий племенного молодняка следующих поколений показали наличие сформировавшегося барьерного эффекта гастро-инстестинальной микрофлоры по отношению к таким патогенным микроорганизмам, как Salmonella, Staphylococcus aureus, Clostridium digficile, грибы Candida, Proteus и др. Это является результатом колонизирующей способности кишечника мышей штаммом B.bifidum 791 БАГ. Более раннее становление микрофлоры новорожденных мышат через коррекцию микрофлоры родителей обеспечило хорошую защищенность организма и возможность противостоять инфекции извне.

Было исследовано влияние жидкого концентрата бифидобактерий на плодовитость животных (табл. 9). Величина помета мышей определяется количеством овулированных яйцеклеток, гибелью эмбрионов до и после имплантации. Гибель эмбрионов на ранней стадии до имплантации может увеличиваться с нарастанием степени инбридинга. Поздняя эмбриональная смертность - показатель состояния организма и проявляется на поздних сроках беременности. Как видно из табл.9, прием концентрата бифидобактерий на основе нового штамма привела к полному исключению поздней эмбриональной смертности спустя 3 года, тогда как в начале экспериментов (1 год) она составляла 14,9%.

Анализ таблиц 8 и 9 показывает, что применение жидкого концентрата бифидобактерий в течение 3-х лет, изготовленного на основе заявляемого штамма бифидобактерий B.Bifidum N 791 БАГ, привело к элиминации из кишечника мышей патогенной микрофлоры и устойчивой колонизации бифидобактериями, что в итоге позволило значительно уменьшить падеж и позднюю эмбриональную смертность у мышей.

Пример 5. Исследование длительности хранения штамма бифидобактерий
B.bifldum 791/БАГ в жидком концентрате бифидобактерий
Увеличение сроков хранения жидкого концентрата бифидобактерий связано с решением проблемы нейтрализации активной кислотности препарата, наблюдающейся при хранении препарата, что приводит к отмиранию клеток бифидобактерий и, следовательно, к снижению их титра в препарате. Решением данной проблемы является выполнение по крайней мере двух условий:
- снижение начальной кислотности в готовом концентрате бифидобактерий до величин порядка 140^oТ;
- получение исходного титра бифидобактерий (не ниже 3-5·10¹⁰ КОЕ/мл).

Однако одновременное выполнение этих двух условий сталкивается с противоречием, поскольку увеличение титра бифидобактерий приводит к естественному повышению продуктов их метаболизма - молочной и уксусной кислот, следовательно, к повышению кислотности концентрата бифидобактерий (если не прибегать к искусственной коррекции pH продукта, нейтрализуя кислоты щелочными растворами).

Указанные выше проблемы решены методом селекции при получении заявляемого штамма B. bifidum 791/БАГ, что подтверждается данными, приведенными в таблице 10.

Как показали эксперименты, проведенные на концентрате бифидобактерий, полученных с использование штамма B.bifidum N 791/БАГ, нейтрализация активной кислотности от pH 5.6 ед до pH 7.0 ед (при помощи 10% раствора NaHCO₃) существенно не влияет на сохранность бифидобактерий штамма B.bifidum N 791/БАГ (см. табл. 10). Однако добавление соды резко снижает органолептические показатели, создавая горький привкус. Разница в титрах бифидобактерий в экспериментальных образцах концентратов бифидобактерий, приготовленных с использованием заявляемого штамма, незначительно различается в процессе хранения, что свидетельствует о значительной кислотоустойчивости штамма. Это свойство позволяет использовать заявляемый штамм для производства продукции с длительным сроком хранения без гашения кислотности щелочными агентами.

Пример 6. Применение жидкого концентрата бифидобактерий в качестве БАД для иммунокоррекции организма человека
У вида бифидобактерий В. bifidum обнаружено наличие некоторых иммуностимулирующих и противовирусных свойств при вирусной (гриппозной) инфекции у детей дошкольного возраста. Снижение заболеваемости острой вирусной диареей (ротавирусы) также было отмечено у грудных детей в США после обогащения пищи бифидобактериями вида В. bifidum (Biotechnol. News, 1994, N 14, с. 3).

В этой связи применение препарата ЖКБ на основе штамма B.bifidum N 791 БАГ в условиях клиники на волонтерах проводилось в отделениях раннего детского возраста и эндокринном отделении Областной больницы г. Новосибирска. Концентрат бифидобактерий назначался не только с целью нормализации микрофлоры кишечника, но также в качестве иммуномодулятора.

Обоснование лечебных доз концентрата бифидобактерий для человека, а также длительности их применения было проведено экспериментально на животных и на основе анализа литературных данных, касающихся применения указанных продуктов.

Курс лечения составлял 4 недели. Бифидоконцентрат вводили перорально в организм детей в дозе lg 10 КОЕ/кг веса. У 80% больных отделения раннего детского возраста наблюдалась ликвидация дистрофического синдрома (10 человек из 15). У 60% больных отмечена тенденция увеличения содержания альбумина в сыворотке крови на 10 - 13%. Это свидетельствует о нормализации работы печени и селезенки, усилении их защитных функций.

Причем жидкий концентрат бифидобактерий на основе штамма В. bifidum N 791 БАГ обладал свойствами иммунокоррекции. У одной больной из 12 наступила полная нормализация иммунологических показателей (по IgG) крови. Снижение уровня гликемии от 5,0 до 9,6 ммоль/л наблюдалось у всех больных. У 4 больных из 12 отмечена нормализация общего количества кишечных палочек. У 4 больных из 12 уменьшилось количество лактозонегативных энтеробактерий. У 8 больных из 12 нормализовалось количество бифидобактерий.

Экспериментальные исследования на животных, профилактика и лечение больных людей в условиях стационара и амбулаторно показывают, что концентрат бифидобактерий, изготовленный на основе заявляемого штамма, обладает высокой антагонистической активностью и повышенным сроком сохранности при высоком титре, что позволяет использовать ЖКБ как серийный препарат для иммунокоррекции организма, лечить дисбактериозы бактериального и вирусного происхождения, диспепсию и дизентерию без применения антибиотиков.

Пример 7. Получение лечебно-диетического кисломолочною продукта на основе концентрата бифидобактерий B.bifidum N 791/БАГ
Закваска - основная часть первичной микрофлоры кисломолочных продуктов, обогащает молоко микроорганизмами более чем в 100 раз. От ее свойств зависит процесс выработки и качество кисломолочных продуктов. Жидкий концентрат бифидобактерий, приготовленный на основе нового штамма B.bifidum N 791/БАГ, был использован для приготовления бифидосодержащих кисломолочных продуктов лечебно-диетического питания.

В качестве основы используют молоко, которое нормализуют по массовой доле жира. Затем молоко подвергают "глубокой" пастеризации при температуре (92±2)^oC с выдержкой не менее 15 мин и охлаждают до температуры заквашивания - 35^oC. Сквашивают молоко в резервуарах для кисломолочных напитков с охлаждаемой рубашкой, снабженных специальными мешалками для равномерного перемешивания молочного сгустка. В молоко вносят производственную закваску на основе жидкого концентрата бифидобактерий (штамм B.bifidum N 791/БАГ) в количестве 2-5% от массы нормализованной смеси. Полученную смесь сквашивают при температуре 35 ± 1^oC в течение 4-5 ч. Окончание сквашивания определяют по образованию достаточно прочного сгустка и кислотности, которая должна быть не более 80^oТ. По окончании сквашивания продукт охлаждают до 25-30^oC, подавая в межстенное пространство резервуара ледяную волу. Затем сгусток перемешивают 10-15 мин. Перемешанный сгусток сразу же подают на розлив, а затем доохлаждают до (6±2)^oC в холодильной камере в упакованном виде. Срок годности кисломолочного продукта, упакованного в тару с герметичной укупоркой - 5 суток. Продукт прошел сертификацию в Центре сертификации пищевых продуктов Департамента Госсанэпиднадзора Минздрава РФ, на него получен Гигиенический Сертификат, согласованый ТУ и ТИ. Таким образом, из вышеизложенного следует, что для патентования предлагается новый отселектированный штамм бифидобактерий Bifidobacterium bifidum N 791 БАГ, обладающий устойчивым проявлением вышеперечисленных свойств при последующем пассировании музейной культуры штамма на печеночной среде Блаурокка. Всего заявляемый штамм прошел 70 пассажей без изменения отселектированных свойств. Предлагаемый штамм бифидобактерий Bifidobacterium bifidum N 791 БАГ по сравнению со штаммом-прототипом обладает более высокой биосинтетической и ростовой активностью, повышенной утилизацией свободных аминокислот молочных питательных сред, которая возросла в 9-13 раз в отношении большинства свободных аминокислот. Сохранность живых бифидобактерий в молочной среде культивирования увеличилась на 1 - 2 порядка. Заявляемый штамм обладает более высокими лечебно- профилактическими свойствами и более длительными сроками хранения в жидком концентрате бифидобактерий.

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской микробиологии и может быть использовано для получения жидкого концентрата бифидобактерий, а также для приготовления кисломолочных лечебно-диетических продуктов и бифидосодержащих биологически активных добавок (БАД) на основе жидкого концентрата бифидобактерий. Штамм Bifidobacterium bifidum 791/БАГ получен селекцией штамма В. bifidum 791. Селекция проводилась без использования каких-либо химических и физических мутагенных агентов посредством длительного поочередного культивирования в двух различных питательных средах - среде Блаурокка и стерильном обезжиренном молоке без ростовых факторов в течение 50 пассажей по морфокультуральным критериям. Штамм более устойчив к повреждающим факторам сред культивирования и агрессивных сред гастроинтестинального тракта человека, обеспечивает утилизацию более широкого спектра аминокислот, т. е. обладает более высокой жизнеспособностью и колонизирующими свойствами, что обеспечивает получение препаратов и продуктов на его основе с более длительными сроками хранения и более высокими лечебно-профилактическими свойствами. 10 табл.

Штамм Bifidobacterium bifidum 791/БАГ (коллекционный В-686 НИИ коллекций культур микроорганизмов ГНЦВБ "Вектор"), используемый для получения жидкого концентрата бифидобактерий, кисломолочных лечебно-профилактических продуктов и биологически активных добавок.