СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТЕРИЛЬНОЙ КОЛЛАГЕНОВОЙ ОСНОВЫ "ФИБРИКОЛЛ" Российский патент 1998 года по МПК A61K38/39 C08L89/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к способам получения препаратов для лечения ран, имплантации.

Известен способ получения мази на основе коллагена для лечения ран [1]. В высоковязкий раствор коллагена вводят лекарственные и вспомогательные вещества. Такие мази пригодны для наружного применения. Введение их внутрь организма требует стерилизации мази. Однако стерилизация готовой мази и жидкой коллагеновой основы весьма сложная и пока неразрешимая задача. Раствор коллагена при нагревании выше 37^oC денатурирует, при облучении дозой выше 0,3 Мрад превращается в нетекучий гель. Методы химической стерилизации готовой мази на коллагеновой основе неизвестны.

Известен способ получения пригодного для инъекций ферменторастворимого коллагена, смешиваемого с активатором полимеризации. Недостатком этого способа является наличие 2-х растворов - раствор коллагена и раствор активатора, которые смешиваются при пониженной температуре перед использованием. Для стерилизации раствора коллагена используют 1 М уксусную кислоту, для снижения кислотности которого затем используют повторной диализ против 0,001 М кислоты [2].

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения инъецируемого материала, состоящего из поперечно сшитых частиц реконструированных фибрилл коллагена [3]. Материал обладает повышенной устойчивостью и пригоден для введения в различные полости организма с помощью шприца. Но и в этом способе трудоемок процесс стерилизации исходного коллагенового субстрата, связанного с длительным диализом против 0,001 М и 1,0 М уксусной кислоты. Кроме того по данному способу используется ателопептидный коллаген, образующий фибриллы в нейтральном диапазоне pH 6,0-8,0. Щелочно обработанный коллаген при этих условиях стабилен и не образует фибрилл. Методы, используемые в патентах [2,3] непригодны для выделения фибриллярного коллагена из щелочнообработанного коллагена.

В настоящем изобретении предлагается способ получения стерильной коллагеновой основы "фибриколл" из уксуснокислого раствора щелочнообработанного коллагена, к которому при интенсивном перемешивании добавляют уротропин в соотношении коллаген-уротропин /2-10/:1 до pH 4,3-5,3 и промывают выпавшие фибриллы, удаляют избыток жидкой фазы до концентрации белка 1,20-3,50% и пастообразную фибриллярную основу расфасовывают в полимерную упаковку, стерилизуют γ -облучением дозой 20 - 25 кГр.

Сущность заявляемого изобретения состоит в том, что при смешивании кислого раствора коллагена и уротропина происходит разложение последнего с выделением аммиака и формальдегида, что приводит к повышению pH до изоэлектрического состояния, осаждению фибрилл коллагена с одновременным их структурированием присутствующими молекулами формальдегида. Осаждение фибрилл коллагена происходит при минимальном соотношении коллаген/уротропин 10 : 1. Повышение концентрации уротропина выше отношения 2 : 1 не влияет на процесс осаждения фибрилл. Для получения ультратонких фибрилл совмещение коллагена и уротропина проводят при интенсивном механическом перемешивании, например в гомогенизаторе РТ-1 при 4000 об/мин.

Образующиеся фибриллы нерастворимы в воде, поэтому можно полностью удалить продукты его разложения. Из промытой фибриллярной основы избыток влаги удаляют центрифугированием или ультрафильтрацией до концентрации белка 1,20-3,50%. Центрифугированием при 3000 об/мин получают основу с концентрацией 1,50%. Интенсивное центрифугирование повышает концентрацию основы. В результате получают гелеподобную коллагеновую основу, состоящую из тонких фибрилл без реактивных групп, сохраняющую свою текучесть при радиационной стерилизации.

Образование фибрилл происходит при повышении pH раствора до величины 4,30-5,30 добавлением щелочи при интенсивном перемешивании. Для придания нерастворимости фибриллы дополнительно структурируют 0,1% раствором глутарового альдегида. При добавлении глутарового альдегида происходит образование межмолекулярных мостиков, что придает им устойчивость к действию биожидкостей и клеток. По данным вязкости денатурация структурированных фибрилл происходит при 55^oC, неструктурированных - при 42^oC. Промывкой водой удаляют избыток альдегида из суспензии. Однако для полного удаления реактивных альдегидных групп проводят дополнительную обработку фибрилл окислителями. Раствор, например, перекиси водорода, периодата натрия и др. превращает альдегидные группы в карбоксильные, обладающие небольшим раздражающим действием. После обработки избыток влаги удаляют центрифугированием, основу расфасовывают в полимерную тару и стерилизуют γ -облучением.

Принцип получения стерильной основы из кислых растворов коллагена пригоден для получения пролонгированных лекарственных форм биологически активных веществ. Соосаждение коллагена, кислых гликозамингликанов, гликопротеинов, хитозана и др. способствует иммобилизации БАВ в структуру коллагеновых фибрилл и последующая поперечная сшивка замедляют биорезорбцию коллагена и высвобождение БАВ, лекарственных веществ. При взаимодействии кислого раствора коллагена с гепарином, хондроитинсульфатом и др. в интервале pH 4,30-5,00 осаждает фибриллярные ассоциаты, которые после обработки 0,5% формальдегидом или 0,15% глутаровым альдегидом, наблюдается постепенное высвобождение гепарина в течение 30 дней в плазме крови.

В фибриллярную основу дополнительно можно включать лекарственные препараты с различными фармакологическим действием и получать мягкие лекарственные формы для наружного и внутреннего применения. Лекарственные препараты должны быть устойчивыми к действию радиационной стерилизации.

В фибриллярную основу можно включать минеральные компоненты; при добавлении в основу до 50% порошкообразного гидросиаппатита (гидроксиапола) получают вязкотекучую пасту стабильную после радиационной стерилизации. Паста используется для стимулирования процессов остеосинтеза.

В фибриллярной основе тонкие фибриллы коллагена находятся в набухшем состоянии, обладают большой текучестью и легко проходят через иглу шприца с диаметром 0,5-2,0 мм. Они используются в различных областях пластической хирургии для заполнения полостей и дефектов соединительной ткани (теннова пространства, фиксировать положение голосовых связок, разглаживать морщины и т. д. ). Фибриллярная основа может использоваться для приготовления мазей, линиментов, суспензий различных лекарственных препаратов. Она может также использоваться для изготовления сухих композитных материалов, губок пленок после соответствующей сушки и т.д.

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. 1. К 1 л 0,6% раствора коллагена в 0,2 М уксусной кислоте /гомогенизатор РТ 1/ добавляют при перемешивании постепенно 1,5 г уротропина, растворенного в 100 мл воды. Смесь гомогенизируют в течение 1 ч.

2. Через 1 ч отделяют фибриллы центрифугированием.

3. Фибриллярную основу снова суспендируют в 500 мл воды и снова удаляют избыток воды центрифугированием. Эту процедуру повторяют 3 раза до полного удаления уротропина и продуктов его разложения.

4. Промытую фибриллярную основу подвергают центрифугированию при 6000 об/мин в течение 30 мин до получения концентрации белка 18-22 мг/мл, расфасовывают в полимерные тубы и стерилизуют γ -облучением дозой 25 кГр.

Пример 2. 1. К 1 л уксуснокислого раствора коллагена в 0,2 М кислоте в смесителе РТ-1 добавляют 2% раствор 2-х замещенного натрия фосфата до pH смеси 5,0 и через 10 мин раствор глутарового альдегида до концентрации его в смеси 0,10%. После инкубации в течение ночи при комнатной температуре отделяют фибриллярную основу центрифугированием.

2. Тщательная 3-х кратная промывка 500 мл воды основы до отсутствия в промывных водах глутарового альдегида.

3. Обработка фибриллярной основы 3% раствором перекиси водорода в течение 2 ч при комнатной температуре.

4. 2-х кратная промывка фибриллярной основы для удаления избытка перекиси водорода.

5. Фибриллярная основа подвергается центрифугированию при 4000 об/мин в течение 30 мин до концентрации 15 мг/мл.

6. В 300 г основы вводят постепенно 1,5 г порошка гидроксиаппатита и перемешивают до получения однородной пастообразной массы белого цвета /паста с гидроксиаппатитом/.

7. Расфасовка пасты в полимерную тару и стерилизация γ -облучением дохой 25 кГр.

Пример 3. 1. К 0,5 л 0,40% раствора коллагена в 0,3% уксусной кислоте в смесителе РТ-1 добавляют 0,1 г хондроитинсульфата в 50 мл воды и повышают pH смеси 2-х замещенным фосфатом натрия /5% раствор/ до величины 4,4. Через 10 мин в смесь добавляют раствор глутарового альдегида до 0,10% концентрации и выдерживают при комнатной температуре в течение ночи.

2. Тщательно промывают смесь водой с удалением избытка влаги центрифугированием.

3. Далее по п.п. 3-7 примера 2.

Пример 4. 1. Фибриллярная основа, получаемая по примерам 1, 2 и 3 разбавляется водой до концентрации 7-9 мг/мл и ее разливают в плоские кюветы с толщиной слоя 3 или 6 мм, замораживают и подвергают сублимационной сушке в вакууме.

2. Сухие пластины материала разрезают на образцы соответствующих размеров /например 5х10 см/, упаковывают в полимерные пакеты и стерилизуют γ -облучением дозой 25 кГр.

Пример 5. 1. К 1 л 0,40% раствора коллагена в 0,2 уксусной кислоте в смесителе РТ 1 добавляют 200 мг (5%) хондроитинсульфата, растворенного в 100 мл воды, а затем 2% раствор 2-х замещенного натрия фосфата до pH 4,7 и через 10 мин раствор глутарового альдегида до концентрации 0,10%.

После инкубации в течение 8 ч, как в пп. 2-5 примера 2, отделяют фибриллярную массу, промывают водой, обрабатывают перекисью водорода, снова промывают водой и отделяют центрифугированием фибриллярную массу.

2. К 300 г фибриллярной основы 2% концентрации постепенно при постоянном перемешивании добавляют до 0,36 г (до 60%) костной муки или порошка яичной скорлупы до получения однородной пастообразной массы белого цвета.

3. Расфасовка в полимерные тубы и стерилизация гамма-облучением дозой 25 кГр.

Пример 6. 1. К 300 г фибриллярной основы с концентрацией белка 2%, получаемой в соответствии с примером 1, 2 или 3 при перемешивании постепенно добавляют 0,3 г (5% от массы белка) метилурацила, устойчивого к действию облучения, до получения однородной пастообразной массы.

2. Расфасовка в полимерные тубы и стерилизация облучением дозой 25 кГр.

Литература
1. Рум. патент, N 88838, A 61 K 31/13, 31.03.86/25.11.83
2. Пат. США, N 3949073, 424/177, 18.11.74/06.04.78.

3. Пат. США, N 4582640, 260/123.7, 08.03.82/15.04.86.

Изобретение относится к медицине, в частности к способам получения стерильной коллагеновой основы для лечения ран, имплантации. К уксуснокислому раствору щелочнообработанного коллагена добавляют при перемешивании уротропин или раствор солей щелочных металлов до рН смеси 4,3 - 5,3. Выпавшие фибриллы промывают водой. Удаляют избыток жидкой фазы до содержания белка 1,20 - 3,50%. Пастообразную субстанцию стабилизируют глутаровым альдегидом, обрабатывают раствором перекиси водорода, промывают, удаляют избыток жидкой фазы и стерилизуют облучением дозой 15 - 20 кГр. Выделение фибрилл коллагена можно производить в присутствии до 10% от коллагена гликозамингликанов. В состав основы возможно включение лекарственных веществ, устойчивых к действию радиационного облучения, порошка гидроксиаппатита или костной муки. Способ позволяет выделять фибриллярный коллаген из щелочнообработанного коллагена. 4 з.п.ф-лы, 6 пр.

\ \ \ 1 1. Способ получения коллагеновой основы из кислого раствора коллагена, отличающийся тем, что используют уксуснокислый раствор щелочнообработанного коллагена, к которому при интенсивном перемешивании добавляют уротропин или раствор солей щелочных металлов до pH смеси 4,3 - 5,3, промывают водой выпавшие фибриллы, удаляют избыток жидкой фазы до концентрации белка 1,20 - 3,50%, расфасовывают пастообразную гелеобразную основу в полимерную упаковку, стерилизуют гамма-облучением дозой 25 кГр. \\\2 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что до стадии промывки водой выделенные фибриллы обрабатывают 0,10%-ным раствором глутарового альдегида, после промывки водой обрабатывают раствором перекиси водорода, промывают и удаляют избыток жидкой фазы. \\\2 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что выделение фибрилл коллагена производят в присутствии до 10% от коллагена кислых гликозамингликанов - хондроитин сульфата, гепарина или хитозана. \\\2 4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что фибриллярную основу вводят до 60% порошка гидроксиаппатита или костной муки. \\\2 5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что в состав фибриллярной основы вводят до 20% лекарственных препаратов, устойчивых к стерилизации гамма-облучением.