СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МУЖСКОГО БЕСПЛОДИЯ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к медицине и животноводству и может быть использовано в области вспомогательных репродуктивных технологий, в частности, для увеличения частоты наступления беременности при лечении бесплодия в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и гомологичной инсеминации за счет отбраковки образцов спермы, содержащих клетки с нарушенной упаковкой хроматина, и диагностики необходимости специфической терапии или восстановительных процедур при неблагоприятном прогнозе относительно эффективности вспомогательных репродуктивных технологий.

Изобретение позволяет диагностировать снижения эффективности репродуктивного процесса, связанные с нарушением упаковки генетического материала сперматозоидов.

Согласно приемам заявляемого способа с помощью техники проточной цитофлуориметрии определяется характер компактизации хроматина сперматозоидов по степени экранирования ДНК их ядер белками хроматина от связывания флуоресцентных красителей, при отклонении значения данного параметра от нормы диагностируют мужское бесплодие
В настоящее время при стандартном определении оплодотворяющей способности образцов спермы берутся в рассмотрение такие критерии как концентрация сперматозоидов, их подвижность и морфология (Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию сперты. Тбилиси. Мецниереба. 1987., Krueger T.F., et al. Sperm morphologic features as a prognostic factor in in vitro fertilization. Fertil. Steril. , 1986; 46: 1118-1123), а также нарушение способности к связыванию с блестящей оболочкой ооцитов (Burkman L.J.et al. The hemizona assay (HZA): development of a diagnostic test for the binding of human spermatozoa to the human hemizona pellucida to predict fertilization potential. Fertil. Steril., 1988; 49: 688-697),
Все эти критерии, несомненно практически важные и часто используемые при анализе образцов спермы, не касаются нарушений непосредственно главного компонента мужской половой клетки - генетического материала, которые могут проявляться на более поздних стадиях, после оплодотворения. В ряде работ описывается возможная связь нарушений генетического материала сперматозоидов и мужского бесплодия. Мелещенко А. Б. и др. с помощью проточной цитофлуориметрии обнаружили изменения количественного содержания ДНК в ядрах сперматозоидов мужчин, страдающих бесплодием (Мелещенко А.Б. и др. Проточная импульсная цитофлуориметрия сперматозоидов человека. Лабораторное дело. 1991; 2: 25-27).

Наши подходы к анализу состояния хроматина сперматозоидов наиболее близки к представлениям Д. Эвенсона, в работах которого показано наличие корреляции между характером окрашивания ядер сперматозоидов акридиновым оранжевым и их потенциальной фертильностью (Sailer B.L., Jost L.K., Evenson D.P. Bull sperm head morphometry related to abnormal chromatin structure and fertility. Cytometry, 1996; 24: 167-173). Однако методический подход Д. Эвенсона заключается в применении в качестве флуоресцентного красителя акридинового оранжевого и использования двухпараметровой проточной цитофлуориметрии, что представляет значительные методические трудности, трудоемко, дорогостоящие. К тому же, природа нарушений генетического материала, выявляемых таким образом, не вполне понятна, и часто связывается с наличием однонитевых участков ДНК в хроматине сперматозоидов, что, с нашей точки зрения, представляется маловероятным. В результате, степень корреляции изменений в окрашивании ядер сперматозоидов акридиновым оранжевым и нарушений оплодотворяющей способности сперматозоидов, выявляемая разными авторами, сильно варьирует от достаточно хорошей (Evenson D/P./ et al. Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Scienece, 1980; 210: 1131-1133) до весьма слабой (Claassens O.E.,et al. The acridine orange test: determing the relationship between sperm morphology and fertiilization in vitro, Human Reproduction, 1992; 7: 242-247).

Целью изобретения является разработка способа диагностики мужского бесплодия, обусловленного нарушением организации генетического материала мужских половых клеток, который позволил бы избежать недостатков вышеотмеченных способов диагностики этого параметра.

Для достижения цели и более четкой диагностики природы нарушений структуры хроматина используется флуорохром бромистый этидий, уровень интеркаляции которого между парами азотистых оснований молекулы ДНК отражает степень компактизации хроматина сперматозоидов. Для анализа результатов окрашивания не требуется использования более сложного оборудования для двухпараметровой проточной цитометрии. Процедура обработки образцов занимает значительно меньше времени, более экономична. В условиях модельной системы в программе ЭКО нами показано влияние структуры хроматина сперматозоидов на частоту наступления беременности у человека, в то время как в работе Д.Эвенсона взаимосвязь аномалий структуры хроматина и бесплодия анализируется на сельскохозяйственных животных.

Способ осуществляется следующим образом.

Образцы спермы анализируют не ранее чем через два часа после получения эякулята. Сперматозоиды освобождают от семенной жидкости путем центрифугирования с последующей двухкратной отмывкой в стандартном буфере. Затем клетки переводят в фосфатный буфер, содержащий 0,2% неионного детергента тритона Х-100 для разрушения клеточной мембраны, и 20 мкг/мл бромистого этидия для флуоресцентного окрашивания ДНК. Образец делят на две части, в одной из которых добавляют гепарин до концентрации 200 ед/мл для экстракции ковалентно несвязанных с хроматином белков. После 10 минутной инкубации при температуре 22^oC с помощью проточного цитофлуориметра проводят измерение связывания красителя с индивидуальными клетками в обеих пробах. Гистрограммы распределения клеток по способности связывать краситель до и после обработки гепарином характеризуют степень компактизации хроматина сперматозоидов. В норме почти все клетки окрашиваются одинакового и имеют низкую интенсивность флуоресценции, которая после обработки гепарином увеличивается примерно в два раза. Если у значительной части клеток (более 30%) интенсивность флуоресценции повышена исходно, либо после экстракции ковалентно несвязанных белков хроматина гепарином она возрастает более чем в два раза у более чем 50% клеток, то такие образцы спермы считают дефектными, так как вероятность наступления беременности при оплодотворении ими низка
Пример. Проведен анализ 179 образцов спермы, использованной в процедуре экстракорпорального оплодотворения. Полученные данные сопоставлены с результатами лечения бесплодия в программе ЭКО. 99 образцов сперты (или 55%) имели нормальную организацию хроматина, как определено нашим методом, а в 80 случаях (45%) были выявлены нарушения, превышающие установленный предел. Всего в результате процедуры ЭКО наблюдалось 30 случаев наступления беременности, при этом в 27 из них (90%) предварительный анализ выявил нормальную организацию хроматина сперматозоидов. В группе пациентов, у которых в результате лечения бесплодия методом ЭКО беременность не наступала (группа 1), частота встречаемости нормальной структуры хроматина сперматозоидов составила 48%, что достоверно ниже, чем в группе беременных (группа 2, P< 0,01).

Влияние структуры хроматина ядер сперматозоидов на результаты программы ЭКО приведены в таблице, где a- al - P < 0,01(x ²).

Таким образом, предложенный нами метод позволяет с меньшими материальными затратами и более адекватно диагностировать формы мужского бесплодия, обусловленные нарушениями структурной организации генетического материала мужских половых клеток.

Способ может быть использован в медицине и животноводстве и может применяться в вспомогательных репродуктивных технологиях, в частности, для увеличения частоты наступления берменности при лечении бесплодия в программах экстракорпорального оплодотворения и гомологичной инсеминации за счет отбраковки образцов спермы, содержащих клетки с нарушенной упаковкой хроматина, и диагностики необходимости специфической терапии или восстановительных процедур при неблагоприятном прогнозе относительно эффективности вспомогательных репродуктивных технологий. Определяют цитофлуориметрически состояние хроматина сперматозоидов. Оценивают интенсивность флуоренсценции ядер клеток, окрашенных бромистым этидием, до и после обработки гепарином. При наличии интенсивности флуоресценции исходно более чем у 30% клеток или возврастает более чем в 2 раза у 50% клеток после обработки гепарином диагностируют мужское бесплодие. Способ позволяет с меньшим материальными затратами и более адекватно диагностировать мужское бесплодие. 1 табл.

Способ диагностики мужского бесплодия путем проточно-цитофлуориметрического анализа состояния хроматина сперматозоидов, отличающийся тем, что состояние хроматина оценивают по интенсивности флуоресценции ядер клеток, окрашенных бромистым этидием до и после обработки гепарином, и при наличии образца спермы, в котором интенсивность флуоресценции повышена исходно более чем у 30% клеток, либо она возрастает более чем в 2 раза у более 50% клеток после обработки гепарином, диагностируют мужское бесплодие.