СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АНОМАЛИЙ УПАКОВКИ ХРОМАТИНА СПЕРМАТОЗОИДОВ ПРИ МУЖСКОМ БЕСПЛОДИИ И ДИАГНОСТИКУМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУЖСКОГО БЕСПЛОДИЯ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к области вспомогательных репродуктивных технологий, в частности для увеличения частоты наступления беременности, и может быть использовано при лечении бесплодия в программах экстракорпорального оплодотворения и гомологичной инсеминации за счет отбраковки образцов спермы, содержащих клетки с нарушенной упаковкой хроматина, и диагностики необходимости специфической терапии или восстановительных процедур при неблагоприятном прогнозе относительно эффективности вспомогательных репродуктивных технологий.

Известно, что снижение качества спермы обуславливает мужское бесплодие. В последние пятьдесят лет в большинстве развитых стран мира отмечено снижение качества спермы у мужчин фертильного возраста. Бесплодие мужчин приводит к росту бесплодных браков, малодетных семей, разводов и, в конечном итоге, к ухудшению демографических показателей. Удельный вес бесплодных браков в мире достигает 15%. При этом мужское бесплодие в структуре бесплодных супружеских пар составляет от 30% до 50%.

Основным способом диагностики мужского бесплодия является (Лабораторная диагностика мужского бесплодия: Метод, рекомендации. - М., 1979. - 20 с.) макро- и микроскопическое исследования спермы. Этот способ позволяет провести подсчет сперматозоидов в 1 мл во всем эякуляте, определить количество подвижных сперматозоидов, процент морфологически измененных форм сперматозоидов и концентрацию лейкоцитов. Данный способ позволяет сделать вывод о видимой патологии спермы - наличии повышенного содержания лейкоцитов и эритроцитов, указывающих на воспалительные и инфекционные заболевания половых путей; наличии малого количества сперматозоидов или их полного отсутствия; наличии аномальных (патологических, дегенеративных) форм сперматозоидов; снижении процента подвижных сперматозоидов.

При использовании данного способа причины патологических изменений в сперме выявить не удается, следовательно, провести назначение адекватного лечения мужского бесплодия крайне затруднено.

Известен (RU, патент 2118822, опубл. 1998) способ диагностики мужского бесплодия путем проточно-цитофлуориметрического анализа состояния хроматина сперматозоидов, причем состояние хроматина оценивают по интенсивности флуоресценции ядер клеток, окрашенных бромистым этидием до и после обработки гепарином, и при наличии образца спермы, в котором интенсивность флуоресценции повышена исходно более чем у 30% клеток, либо она возрастает более чем в 2 раза у более 50% клеток после обработки гепарином, диагностируют мужское бесплодие.

Недостатком известного способа следует признать его недостаточную точность.

Известен (RU, патент 2437100, опубл. 2011) способ диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии, включающий исследование состояния хроматина с использованием флуоресцентного микроскопа и красителя. При реализации способа определяют количество сперматозоидов в 1 мл раствора, концентрацию сперматозоидов доводят до 10-50 млн/мл буфером PBS, покровные стекла покрывают слоем полилизина, проводят иммобилизацию сперматозоидов на подготовленных покровных стеклах площадью около 3×5 мм², фиксируют и окрашивают ядра иммобилизированных сперматозоидов ДНК-связывающим флуорохромом DAPI с получением контрольных образцов, вторую часть иммобилизированных сперматозоидов обрабатывают микрококковой нуклеазой, проводят фиксацию и окрашивание ядер сперматозоидов, обработанных микрококковой нуклеазой, ДНК-связывающим флуорохромом DAPI, окрашенные препараты контрольных сперматозоидов и сперматозоидов, обработанных микрококковой нуклеазой, фотографируют с использованием микроскопа и анализируют полученные изображения путем сравнения яркости изображений сперматозоидов, причем об аномалии упаковки хроматина сперматозоида судят по количеству ДНК, расщепленной нуклеазой, относительно общего количества ДНК в контроле.

Недостатком известного способа следует признать его недостаточную точность.

Наиболее близким аналогом разработанного способа можно признать (RU, патент 2426993, опубл. 2011) способ диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии, характеризуемый тем, что образец спермы очищают от сопутствующих соматических и недифференцированных клеток, очищенные сперматозоиды осаждают центрифугированием, промывают в буферном растворе с рН 7,6÷8,0, осадок ресуспендируют в буферном растворе с рН 7,8÷8,2 в присутствии 10÷15 мМ Трис-HCl, инкубируют при охлаждении, клетки осаждают центрифугированием с последующим промыванием осадка, промытый осадок ресуспендируют в растворе с рН 7,8-8,2 в присутствии 8,0-12 мМ Трис-HCl, к полученной суспензии добавляют микрококковую нуклеазу, образцы инкубируют при температуре от 10 до 40°С, останавливают гидролиз, с последующей гомогенизацией и повторным центрифугированием образцов с получением осадка, содержащего нерастворимый хроматин, и супернатанта, содержащего растворимый хроматин, и по процентному содержанию растворимого хроматина не менее 18,4% и нерастворимого хроматина не выше 81,4% диагностируют наличие аномалии упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии.

В данном случае критерием при определения мужского бесплодия является упаковка хроматин, хотя и измеренный со значительной ошибкой.

Недостатком ближайшего аналога следует признать его невысокую точность из-за малой точности определения количества сперматозоидов в исходной нативной сперме.

Техническая задача, решаемая посредством разработанного способа, состоит в создании диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии.

Технический результат, достигаемый при реализации разработанного изобретения, состоит в повышении точности определения аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии.

Для достижения указанного технического результата предложено в известном способе определения аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии использовать разработанный метод точного определения концентрации ДНК в эякуляте.

Реакция гидролиза ДНК экзогенной нуклеазой концентрационно зависима и изначально требует выбора соотношении ДНК : фермент, удовлетворяющего ряду условии: достоверность отбора пробы для гидролиза, достаточность количества ДНК (сперматозоидов) для корректного определения фракций после гидролиза и достаточного количества ДНК для спектрофотометрического определения. К сожалению, зачастую точность определения количества сперматозоидов в рутинных спермаграммах низкая. При подсчете концентрации клеток в микроскопической камере (типа камеры Горяева) велика ошибка при подсчете образцов с высоким содержанием клеток, что затрудняет подсчет подвижность сперматозоидов в нативной (не фиксированной) сперме.

Разработанный способ определения концентрации ДНК в эякуляте реализуют следующим образом.

В коническую микроцентрифужную пробирку с крышкой вносят 50 мкл эякулята и осаждают сперматозоиды в микроцентрифуге в течение 30 с при скорости вращения 3000-5000 об/мин, осадок промывают 1 раз однократным натрий-фосфатным буфером (1xPBS), затем повторно центрифугируют на микроцентрифуге в течение 30 с при скорости вращения 3000-5000 об/мин, удаляют супернатант, к осадку добавляют 1 мл 5% хлорной кислоты, кипятят на водяной бане в течение 9-11 мин с последующим осаждением материала на микроцентрифуге при скорости вращения 3000-5000 об/мин в течение 30 с. В отделенном супернатанте спектрофотометрически определяют концентрацию ДНК.

В дальнейшем диагностику аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии проводят известным из ближайшего аналога образом.

Аликвоту эякулята(10-20×10⁶ сперматозоидов, 30-60 мкг по ДНК) переносим в коническую микроцентрифужную пробирку с крышкой, центрифугируем в микроцентрифуге 30 с при скорости 5000 об/мин. Осадок ресуспендируют в фосфатном буфере (PBS) с 5 мМ фенилметилсульфанилфторида (PMSF) и 1% Тритоном Х-100, инкубируют 5-10 мин на льду, клетки осаждают центрифугированием, осадок промывают 2 раза PBS с 5 мМ PMSF без Тритона Х-100. Полученный осадок ресуспендируют в растворе 20 мМ Трис-HCl (рН 8), 2 мМ CaCl₂, 2 мМ MgCl₂. Можно использовать 10 мМ Трис-HCl, однако в этом случае концентрация CaCl₂, и MgCl₂ должна составлять 1 мМ. К полученной суспензии добавляют микрококковую нуклеазу в диапазоне концентраций от 10 ед./мг до 50 ед./мг. Образцы инкубируют 3 мин при температуре не ниже 10 и не выше 40°С. Реакцию гидролиза останавливают добавлением ЭДТА до 10 мМ во льду, образцы гомогенизируют энергичным встряхиванием или в приборе «Вортекс» и затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5-10 мин. Полученный осадок (фракция 1) содержит нерастворимый хроматин, супернатант (фракция 2) содержит растворимый хроматин, содержание нерастворимого хроматина и растворимого хроматина определяют известными методами.

В супернатанте можно дополнительно выделить кислоторастворимый хроматин путем добавления к супернатанту, содержащему растворимый хроматин, 5% HClO₄. Полученную суспензию кипятят 15 мин и центрифугируют. Можно кипятить суспензию 10 мин. После центрифугирования концентрацию ДНК, характеризующую кислоторастворимый хроматин, определяют на спектрофотометре.

Используемый при реализации способа эякулят должен быть или свежим, или быть замороженным с криопротектором, или хранимый в холодильнике непосредственно после забора не свыше одних суток.

При наличии в семенной жидкости соматических клеток более 5% желательно предварительно провести очистку эякулята. Эта операция может быть проведена с использованием буфера, содержащего 0,5% SDS.

Экспериментально установлено, что использование нового приема определения концентрации сперматозоидов позволяет повысить точность разработанного способа примерно на 30-40%.

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к области вспомогательных репродуктивных технологий, в частности для увеличения частоты наступления беременности, и может быть использовано при лечении бесплодия в программах экстракорпорального оплодотворения и гомологичной инсеминации. Изобретение представляет собой способ диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии. При реализации способа согласно изобретению для определения количества сперматозоидов аликвоту эякулята вносят в пробирку с крышкой, осаждают сперматозоиды центрифугированием, промывают осадок однократным натрий-фосфатным буфером, центрифугированием отделяют осадок, подкисляют его действием разбавленной хлорной кислоты, кипятят на водяной бане и осаждают материал центрифугированием с последующим определением в осадке концентрации ДНК. Технический результат, достигаемый при реализации разработанного изобретения, состоит в повышении точности определения аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии, включающий осаждение сперматозоидов центрифугированием, промывку их в буферном растворе с рН 7,6÷8,0, ресуспендирование осадка в буферном растворе с рН 7,8÷8,2 в присутствии 10÷15 мМ Трис-HCl, инкубирование при охлаждении, осаждение клеток центрифугированием с последующим промыванием осадка, ресуспендированием промытого осадка в растворе с рН 7,8÷8,2 в присутствии 8,0÷12 мМ Трис-HCl, добавление к полученной суспензии микрококковой нуклеазы, инкубирование образцов при температуре от 10 до 40°С, остановку гидролиза с последующей гомогенизацией и повторным центрифугированием образцов с получением осадка, содержащего нерастворимый хроматин, и супернатанта, содержащего растворимый хроматин, и по процентному содержанию растворимого хроматина не менее 18,4% и растворимого хроматина не выше 81,4% диагностируют наличие аномалии упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии, отличающийся тем, что для определения количества сперматозоидов в эякуляте предварительно аликвоту эякулята вносят в пробирку с крышкой, осаждают сперматозоиды центрифугированием, промывают осадок однократным натрий-фосфатным буфером, центрифугированием отделяют осадок, подкисляют его действием разбавленной хлорной кислоты, кипятят на водяной бане и осаждают материал центрифугированием с последующим определением в осадке концентрации ДНК, при этом для диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии используют аликвоту эякулята, содержащую 10-20×10⁶ сперматозоидов, 30-60 мкг по ДНК.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно в аликвоте эякулята измеряют спектрофотометрически концентрацию ДНК, характеризующую содержание кислоторастворимой фракции хроматина.