СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ МУЖСКОГО БЕСПЛОДИЯ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ФРАГМЕНТАЦИИ ДНК СПЕРМАТОЗОИДОВ Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 A61B5/00 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к андрологии, лабораторным методам исследования в области биохимии, патологической физиологии, репродуктивной медицине, может быть использовано для уточнения причин мужского бесплодия, а также прогноза исхода процедуры ЭКО/ИКСИ в клиниках вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).

Увеличение случаев бесплодия, сопровождающегося снижением качества спермы, объясняет повышенный интерес научного сообщества к этой проблеме для поиска основных причин и разработки эффективных вариантов профилактики и лечения [Лебедев Г.С, 2019; Houston В. et al., 2021]. Мужское бесплодие - многофакторная форма патологии, включающая широкий спектр расстройств [Aitken R., 2020; Павлов В.Н. и др., 2020]. В большинстве случаев причины снижения фертильности у конкретного пациента остаются неизвестными и, по различным оценкам, от 20 до 75% диагностированного мужского бесплодия считаются идиопатическими [Agarwal A. et al., 2021]. Одним из факторов, способным снижать мужскую фертильность, - это гиперпродукция активных форм кислорода (АФК). Способность генерировать АФК - фундаментальное свойство сперматозоидов млекопитающих и основная причина окислительного стресса, ответственного за нарушение их функции. В небольших количествах АФК необходимы для нормальной регуляции функции сперматозоидов, их гиперактивации и акросомальной реакции. Избыточная продукция АФК приводит к повреждению мембраны сперматозоидов, снижению их подвижности и нарушению оплодотворяющей способности. Результатом гиперпродукции АФК является повреждение митохондрий, ДНК и инициация апоптоза, в результате чего сперматозоиды теряют подвижность и жизнеспособность. Этот путь приводит также к экстернализации фосфатидилсерина, который способствует фагоцитозу сперматозоидов после оплодотворения, что предопределяет иммунный ответ на спермальные антигены и прогноз фертильности [Божедомов В.А., Сухих Г.Т., 2017, Галимов Ш.Н., и др. 2020]. Окислительный стресс и фрагментация ДНК сперматозоидов непосредственно и тесно связаны с мужским фактором бесплодия, включая идиопатическое. Несмотря на чувствительность к окислительному стрессу, функция сперматозоидов зависит от генерации АФК, необходимых для активации сигнальных путей, связанных с капацитацией. Некоторая степень контролируемого разрыва ДНК необходима для адекватной компактизации ДНК, однако, чрезмерная фрагментация одно- или двухцепочечные ДНК, сопровождается снижением качества спермы, уменьшением числа оплодотворенных яйцеклеток и частоты наступления беременности, снижением качество эмбрионов, высокий риск развития самопроизвольных абортов и не эффективности выполнения ВРТ. Образование окисленных аддуктов ДНК, уровень которых коррелирует с плотностью упаковки, степенью протаминирования и фрагментации хроматина, - частое явление в сперматозоидах при различной патологии. В этой связи актуальна разработка и внедрение новых технологий, направленных на совершенствование методов лабораторной диагностики бесплодия. Качество сперматозоидов важно для формирования общей фертильности мужчины.

Одним из критериев диагностики мужского бесплодия является анализ спермограммы [WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 5th ed. WHO (Geneva), 2010. Vol. 270; Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека. Пер. с англ. Н.П. Макаровой под научн. ред. Л.Ф. Курило. 5-е изд. М.: Изд-во "Капитал принт", 2012]. Однако он имеет недостатки и не всегда по данному анализу можно оценить фертильность пациентов.

Недостатки классической спермограммы:

1. Анализ основан лишь на визуальном исследовании функционально-морфологических критериев сперматозоидов и не дает возможность выявить биохимические и патофизиологические нарушения в мужских половых клетках.

2. Имеет субъективный характер, зависящий от лабораторных навыков лаборанта.

3. От 30 до 50% анализов спермограммы соответствуют критериям ВОЗ, что не позволяет выявить патологию при идиопатическом бесплодии у мужчин.

4. Нормальные результаты спермограммы не гарантируют зачатие. Многочисленные данные указывают на роль фрагментации ДНК в развитии патоспермии [Ahmed Т. Alahmar et al., 2022; Aitken R.J. et al., 2021; Park Y.J., et al., 2021 и др.].

Известен способ диагностики мужского бесплодия, включающий изучение степени компактизации хроматина сперматозоидов, относительного содержания дефектных клеток в эякуляте, уровня ингибина В в сыворотке крови. На основании полученных данных вычисляют диагностический индекс DI, исходя из значения которого, диагностируют бесплодие у мужчин или отсутствие патологии [патент RU 2362167, 2009]. Степень компактизации хроматина сперматозоидов оценивают на основании сравнения гистограмм распределения клеток до и после насильственной деконденсации гепарином по уровню специфической флуоресценции, используя статистический метод Колмогорова-Смирнова с определением индекса подобия двух кривых п. 1. характеризует нарушение компактизации хроматина и незрелое состояние сперматозоидов. Относительное содержание дефектных клеток определяют по уровню неспецифической флуоресценции (М).

Недостатки данного способа: 1) демонстрирует только совокупность полученных лабораторных показателей;

2) эффективность данного метода не достигает 100% (84,5%);

3) нет качественного показателя оценки фрагментации сперматозоидов при бесплодии.

Известен способ прогнозирования высокой степени фрагментации ДНК и невынашивания беременности в паре, включающий сбор и исследование эякулята на содержание триклозана, с использованием метода газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. При обнаружении концентрации триклозана >0,11 нг/мл в семенной жидкости прогнозируют высокий риск фрагментации ДНК сперматозоидов и невынашивания беременности в паре [патент RU 2703455, 2019]. Недостатками данного технического решения являются:

1) предлагаемый способ является косвенным с определением точки разделения (cut-off) для концентраций триклозана в семенной жидкости у мужчин с фрагментацией ДНК сперматозоидов;

2) данный способ реализуется методом газовой хроматографии с масс-спектрометрией. Метод дорогостоящий и не является экспресс-методом;

3) чувствительность и специфичность прототипа не достигает значений 100%, и составила 85% и 77% соответственно.

Наиболее близким аналогом изобретения является способ определения индекса фрагментации ДНК, заключающийся в том, что проводят окрашивание эякулята акридиновым оранжевым, определяют количество поврежденных сперматозоидов: с фрагментированными ДНК и с незрелым ядром. Способ основан на метахроматических свойствах акридинового оранжевого, который изменяет флуоресценцию с зеленого на красный при связывании с одно цепочечной ДНК или РНК [Schlegel P.N., Paduch D.A., 2005 [Yet another test of sperm chromatin structure. Fertil Steril 2005; 84: 4: 854-859]. В качестве показателя фертильности мужчины указано значение степени фрагментации ДНК сперматозоидов ниже 15%.

Недостатком данного исследования является отсутствие диапазона показателей фрагментации ДНК сперматозоида и оценки вероятности наступления беременности у партнерши.

Задачей изобретения является разработка способа диагностики мужского бесплодия на основе выявления наличия фрагментации ДНК сперматозоидов у бесплодных мужчин.

Технический результат при использовании изобретения - повышение точности прогноза бесплодия за счет определения степеней фрагментации ДНК сперматозоидов.

Предлагаемый способ оценки фертильности при мужском бесплодии осуществляется следующим образом: проводят окрашивание мазков эякулята на стекле. В качестве красителя используют витальный краситель отечественного производителя трипановый синий (Trypan blue 0,05%-ный буферизированный краситель), разработанный ЗАО «Оптимедсервис» (Россия). Витальные красители являются эффективным инструментом для визуализации и контрастирования различных биологических тканей, в том числе мужских гамет.Витальный краситель обеспечивает оптимальную визуализацию как патологически фрагментированных сперматозоидов, так и не измененных мужских гамет. Проводят сбор эякулята, полученного путем мастурбации. В образцы спермы добавляют терминальную трансферазу в объеме 0,5 мкл фермента с активностью 20-40 ед./мкл для связывания с «порванными», именными участками ДНК. Полученную смесь инкубируют в термостате при +37°С в течение 60 мин. После завершения инкубации добавляют 0,1 мл 0,05%-ного буферизированного красителя Trypan blue, обладающего высокой окрашивающей способностью. В состав Trypan blue 0,05%-ный буферизированный входят следующие компоненты в соотношении на 1 мл раствора: (краситель Trypan blue - 1,3 мг; краситель BBG - 0,2 мг; динатрий фосфат - 3,1 мг; дигидрофосфат натрия - 0,3 мг; натрий хлористый - 7,6 мг; полиэтиленгликоль (ПЭГ) - 20 мг; гиалуронат натрия - 3 мг; Дистиллированная вода - до 1 мл. Соотношения компонентов на 1 мл раствора получены в результате экспериментального подбора и протестированы испытаниями. Данный раствор витального красителя создан ЗАО «Оптимедсервис», Россия по ТУ 9393-019-29792921-2015. Подсчет результата идет с помощью универсального инвертированного микроскопа Olympus СКХ53 с флуоресцентным осветителем U-HGTGPS с программным обеспечением для ввода и анализа изображения в чашках Петри. Для каждого образца считают 2000 сперматозоидов. Из них определяют % сперматозоидов, имеющих нарушения в виде фрагментации ДНК. Сперматозоиды, имеющие нарушения в виде фрагментации ДНК, окрашиваются и подсвечиваются в мерцающий зелено-голубоватый цвет, здоровые сперматозоиды с целым ДНК не прокрашиваются витальным красителем.

При значении степени фрагментации 15% и менее определяют низкую степень фрагментации ДНК и прогнозируют мужскую фертильность с высоким шансом оплодотворения естественным путем, при данных лабораторных показателях лечение не требуется.

От 16 до 30% - определяют среднюю степень фрагментации ДНК, прогнозируют мужскую фертильность со сниженным шансом оплодотворения естественным путем и повышенной вероятностью возникновения выкидышей.

Более 30% - определяют высокую степень фрагментации ДНК, прогнозируют мужское бесплодие. Наступление беременности естественным путем практически невозможно, успех проведения ЭКО под вопросом.

Оценку показателей фрагментации ДНК сперматозоидов проводили в когорте бесплодных мужчин с нормоспермией и патоспермией. Разброс значений фрагментации ДНК сперматозоидов в группе пациентов с нормоспермией колебался от 6%> до 15%>, в группе пациентов с патоспермией от 16% до 49%>, т.е. фрагментация ДНК сперматозоидов в обеих группах колебалась в интервале от 6% до 49%. Средний показатель составил 28,9±8,4%. При сравнительном анализе в изучаемых группах пациентов с патоспермией, по показателю уровня фрагментации ДНК сперматозоидов достоверных различий между ними не выявлено. У пациентов с патоспермией фрагментация ДНК сперматозоидов встречалась значительно чаще (таблица).

При значении степени фрагментации 15% и менее определяют количество сперматозоидов с поврежденной ДНК минимальным, низкую степень фрагментации ДНК и прогнозируют мужскую фертильность с высоким шансом оплодотворения естественным путем, лечение не требуется. От 16 до 30% - средняя степень фрагментации ДНК, снижены шансы оплодотворения естественным путем, повышенная вероятность

возникновения выкидышей. Более 30% - высокая степень фрагментации. Наступление беременности естественным путем практически невозможна, успех проведения ЭКО под вопросом.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1

Пациент В., возраст 34 лет, супруга А., возраст 29 лет, состояли в бесплодном браке в течение 5 лет, обратились в клинику ВРТ «Семья» г. Уфы по поводу бесплодия. При обследовании супруги патологических нарушений со стороны репродуктивной системы выявлено не было. При проведении обследования эякулята супруга выявлена астенотерато-зооспермия. Время разжижения эякулята составило 13 минут. Объем эякулята 6,4 мл. Концентрация сперматозоидов - 14,5 млн/мл, подвижных сперматозоидов 27,0%, нежизнеспособных 25,6%, атипичных форм 47,4%. У пациента проведен анализ на выявления наличия фрагментации ДНК сперматозоидов методом окраски витальным красителем трипановый синий. Степень фрагментации ДНК в пределах 16%.

Заключение: Показатели спермограммы соответствуют предъявляемым экспертной группой ВОЗ к фертильной сперме, за исключением снижения показателей подвижности сперматозоидов. Женский фактор без патологии. У пациента средняя степень дефрагментации ДНК, предложена схема лечения. Через год после проведенной терапии произошло оплодотворение, и наступила беременность.

Пример 2

Пациент С., возраст 30 лет, в браке состоит в течение 2-х лет, обратился в клинику ВРТ «Семья» г. Уфы по поводу первичного профилактического осмотра и запланировать рождение малыша. При проведении обследования эякулята - время разжижения 15 минут. Объем эякулята - 4,2 мл, общее количество сперматозоидов 44 млн, концентрация - 14,3 млн/мл, подвижных сперматозоидов 43,9%, нежизнеспособных 26,4%, атипичных форм 29,7%. Проведен анализ на выявления наличия фрагментации ДНК сперматозоидов методом окраски витальным красителем трипановый синий. Степень фрагментации ДНК в пределах 15%.

Заключение: Показатели спермограммы соответствуют критериям, предъявляемым экспертной группой ВОЗ к фертильной сперме. Параметры проведенного анализа спермограммы в пределах нормы. Низкая степень фрагментации ДНК. Сделан прогноз на реализацию нормальной фертильной функции. Нарушений не выявлено. В течение года произошло зачатие у супруги с последующим нормальным течением беременности.

Пример 3

Пациент М., возраст 34 год, супруга А., возраст 24 лет, состояли в бесплодном браке в течение 3 лет, обратились в клинику ВРТ «Семья» г. Уфы. При обследовании патологических нарушений со стороны репродуктивной системы супруги выявлено не было. Время разжижения эякулята составило 10 минут. Объем эякулята 6 мл. Концентрация сперматозоидов - 10 млн/мл, подвижных сперматозоидов 30,0%, нежизнеспособных 29,5%, атипичных форм 40,5%. Была диагностирована олигоастенотератоспермия. У пациента проведен анализ фрагментации ДНК - 31%. Через год при повторном обращении беременность в браке не наступила, несмотря на проведенную терапию.

Заключение: Прогноз высокого риска бесплодия в виде олигоастенотератоспермии. Выявленный вариант анализа фрагментации ДНК коррелировал с развитием олигоастенотератоспермии.

Пример 4

Пациент К., возраст 40 лет, в браке состоит 4 года, обратился в клинику ВРТ «Семья» г. Уфы по поводу первичного профилактического осмотра. Детей в браке нет. При проведении обследования эякулята - время разжижения 15 минут. Объем эякулята - 3,4 мл, общее количество сперматозоидов 42 млн, концентрация - 14,2 млн/мл, подвижных сперматозоидов 46,9%), нежизнеспособных 25,3%, атипичных форм 27,8%. У пациента проведен анализ фрагментации ДНК - 30%. После проведенной терапии произошло зачатие у супруги с последующим нормальным течением беременности.

Заключение: Показатели спермограммы соответствуют критериям, предъявляемым экспертной группой ВОЗ к фертильной сперме. Параметры проведенного анализа спермограммы в пределах нормы. У пациента средняя степень дефрагментации ДНК, предложена схема лечения. Через 6 месяцев после проведенной терапии произошло оплодотворение, и наступила беременность.

Преимущества заявляемого способа:

1. Применение анализа степени фрагментации ДНК в качестве биомаркера риска развития идиопатического бесплодия может быть использовано в андрологии и репродуктивной медицине.

2. Предлагаемый способ прогнозирования является перспективным методом раннего выявления репродуктивной патологии с возможностью его использования для коррекции нарушений гаметогенеза и оплодотворения.

3. Определение степени фрагментации ДНК является надежным и важным способом для выявления прогноза наступления беременности естественным путем.

Изобретение относится к медицине, а именно к андрологии, лабораторным методам исследования в области биохимии, патологической физиологии, репродуктивной медицине, может быть использовано для уточнения причин мужского бесплодия, а также прогноза исхода процедуры ЭКО/ИКСИ в клиниках вспомогательных репродуктивных технологий. Проводят окрашивание эякулята, полученного путем мастурбации. К эякуляту добавляют терминальную трансферазу в объеме 0,5 мкл с активностью 20-40 ед./мкл, смесь инкубируют в термостате при +37°С в течение 60 минут, затем добавляют 0,1 мл 0,05%-ного буферизированного красителя Trypan blue. Затем методом флуоресцентной микроскопии определяют степень фрагментации ДНК сперматозоидов путем подсчета количества неповрежденных сперматозоидов и сперматозоидов, имеющих нарушения в виде фрагментации ДНК, вычисления соотношения поврежденных сперматозоидов к неповрежденным в %. При значении степени фрагментации 15% и менее определяют низкую степень фрагментации ДНК и прогнозируют мужскую фертильность с высоким шансом оплодотворения естественным путем, от 16 до 30% - определяют среднюю степень дефрагментации ДНК, прогнозируют мужскую фертильность со сниженным шансом оплодотворения естественным путем, более 30% - определяют высокую степень дефрагментации ДНК, прогнозируют мужское бесплодие. Использование изобретения обеспечивает повышение точности прогноза бесплодия за счет определения степеней фрагментации ДНК сперматозоидов. 1 табл., 4 пр.

Способ прогнозирования мужского бесплодия, включающий сбор эякулята, полученного путем мастурбации, окрашивание его и определение методом флуоресцентной микроскопии степени фрагментации ДНК сперматозоидов путем подсчета количества неповрежденных сперматозоидов и сперматозоидов, имеющих нарушения в виде фрагментации ДНК, вычисления соотношения поврежденных сперматозоидов к неповрежденным в %, отличающийся тем, что к эякуляту добавляют терминальную трансферазу в объеме 0,5 мкл с активностью 20-40 ед./мкл, смесь инкубируют в термостате при +37°С в течение 60 минут, затем добавляют 0,1 мл 0,05%-ного буферизированного красителя Trypan blue, при значении степени фрагментации 15% и менее определяют низкую степень фрагментации ДНК и прогнозируют мужскую фертильность с высоким шансом оплодотворения естественным путем, от 16 до 30% – определяют среднюю степень дефрагментации ДНК, прогнозируют мужскую фертильность со сниженным шансом оплодотворения естественным путем, более 30% – определяют высокую степень дефрагментации ДНК, прогнозируют мужское бесплодие.