СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АНОМАЛИЙ УПАКОВКИ ХРОМАТИНА СПЕРМАТОЗОИДОВ ПРИ МУЖСКОМ БЕСПЛОДИИ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к области вспомогательных репродуктивных технологий, в частности, для увеличения частоты наступления беременности, и может быть использовано при лечении бесплодия в программах экстракорпорального оплодотворения и гомологичной инсеминации за счет отбраковки образцов спермы, содержащих клетки с нарушенной упаковкой хроматина, и диагностики необходимости специфической терапии или восстановительных процедур при неблагоприятном прогнозе относительно эффективности вспомогательных репродуктивных технологий.

В настоящее время принятые ВОЗ методы диагностики аномалий развития сперматозоидов, приводящих к мужскому бесплодию, основаны на оценке их количества, подвижности и выявлении разрывов ДНК. В тоже время показано, что одной из распространенных причин мужского бесплодия является аномальная или не полностью завершенная компактизация ДНК генома в сперматозоидах.

Известен (RU, заявка 2006130740) способ определения целостности хроматина/ДНК в сперматозоидах животных, включающий стадию обработки образца, содержащего сперматозоиды, денатурирующим ДНК раствором, одну стадию обработки лизирующим раствором для экстракции ядерных белков, стадию определения целостности хроматина/ДНК сперматозоидов, характеризующуюся тем, что лизирующий раствор не содержит денатурирующего белки детергента и не разрушает значительно хвостики сперматозоидов.

Недостатком известного способа следует признать, что оценивается целостность ДНК по наличию или отсутствию разрывов, а этот показатель не коррелирует с патологией, связанной с неполной или аномальной упаковкой хроматина.

Известен также (RU, патент 2262107) способ определения зрелости сперматозоидов путем оценки степени конденсации хроматина сперматозоидов при исследовании эякулята. В процессе определения сравнивают интенсивность флуоресценции ДНК сперматозоидов до и после насильственной деконденсации хроматина гепарином посредством статической обработки методом Колмогорова-Смирнова с определением индекса подобия кривых интенсивности флуоресценции n, при значении которого меньше 48,5 судят о незрелом состоянии сперматозоидов, а при значении n больше 48,5 судят о зрелости сперматозоидов.

Недостатком известного способа следует признать, что свойство хроматина деконденсироваться под действием гепарина лишь косвенно отражает аномалии в его упаковке.

Известен также (RU, 2118822) способ диагностики мужского бесплодия путем проточно-цитофлуориметрического анализа состояния хроматина сперматозоидов, отличающийся тем, что состояние хроматина оценивают по интенсивности флуоресценции ядер клеток, окрашенных бромистым этидием до и после обработки гепарином, и при наличии образца спермы, в котором интенсивность флуоресценции повышена исходно более чем у 30% клеток либо она возрастает более чем в 2 раза у более 50% клеток после обработки гепарином, диагностируют мужское бесплодие.

Недостатком известного способа следует признать, что метод не является строго количественным и, как и при использовании для деконденсации гепарина, лишь косвенно отражает аномалии в упаковке хроматина. Кроме того, этот метод требует сложного и дорогостоящего оборудования и не может использоваться для широкого скрининга.

Для выявления не полностью завершенной компактизаци ДНК генома в сперматозоидах предложено использовать (см. Методическая рекомендация «Электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов как функциональный тест при диагностике мужского бесплодия» (Москва, 2003 г.)) способ электронно-микроскопического анализа. Этот метод позволяет выявить в эякуляте инфертильных мужчин сперматозоиды с так называемым «незрелым хроматином», упаковка которого отличается от упаковки хроматина в сперматозоидах здорового донора.

Существенными недостатками метода следует признать трудоемкость и высокую стоимость, длительное время (около 2 недель) пробоподготовки и использование уникального дорогостоящего оборудования (электронный микроскоп, ультрамикротом). Принципиально важно, что метод электронной микроскопии не дает возможности дать точную количественную оценку доли сперматозоидов с нарушенной компактизацией ДНК и объективно охарактеризовать глубину данной патологии.

Техническая задача, решаемая посредством разработанного способа, состоит в создании диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии.

Технический результат, получаемый при реализации разработанного способа, состоит в упрощении и удешевлении метода при одновременном повышении информативности исследования.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать разработанный способ диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии. При реализации разработанного способа образец спермы очищают от сопутствующих соматических и недифференцированных клеток, очищенные сперматозоиды осаждают центрифугированием, промывают в буферном растворе с pH 7,6÷8,0, осадок ресуспендируют в буферном растворе с pH 7,8÷8,2 в присутствии 10÷15 мМ Трис-HCl, инкубируют при охлаждении, клетки осаждают центрифугированием с последующим промыванием осадка, промытый осадок ресуспендируют в растворе с pH 7,8÷8,2 в присутствии 8,0÷12 мМ Трис-HCl, к полученной суспензии добавляют микрококковую нуклеазу, образцы инкубируют при температуре от 10 до 40°С, останавливают гидролиз с последующей гомогенизацией и повторным центрифугированием образцов с получением осадка, содержащего нерастворимый хроматин, и супернатанта, содержащего растворимый хроматин, в полученных осадке и супернатанте раздельно определяют содержание ДНК и по процентному содержанию ДНК в осадке диагностируют наличие аномалии упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии. Предпочтительно образец спермы очищают по стандартному методу. Осаждение сперматозоидов осуществляют обычно при скорости центрифугирования 4000÷6000 об/мин. При меньшей скорости не происходит полноты отделения, а при большей скорости может происходить повреждение сперматозоидов. Предпочтительно при ресуспендировании используют 1% раствор Тритон Х-100. Кроме того, могут быть использованы другие неионные детергенты. Обычно инкубирование осуществляют в течении 5-10 минут на льду. Это обусловлено тем, что при более высокой температуре структура хроматина может подвергаться необратимым изменениям. Осадок предпочтительно промывают, по меньшей мере, один раз буферным раствором. Обычно осадок ресуспендируют в растворе, содержащем 20 мМ Трис-HCl (pH 8), 2 мМ CaCl₂, 2 мМ MgCl₂. Преимущественно микрококковую нуклеазу добавляют в диапазоне концентраций от 10 ед/мг до 50 ед/мг. Это обусловлено эмпирическим подбором. Обычно гидролиз останавливают добавлением ЭДТА до 10 мМ во льду. Однако возможны и другие варианты остановки гидролиза. Гомогенизацию образцов обычно осуществляют энергичным встряхиванием или в приборе «Вортекс». Обычно образцы повторно центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5-10 минут. Это обусловлено необходимостью полностью разделить фракции. Предпочтительно для определения количества ДНК в осадке к осадку добавляют 0,5 мл 0,5 н. NaOH, суспензию инкубируют 20 минут при 60°С, образцы переносят на лед, после чего добавляют HClO₄ до 5%, образцы центрифугируют при 5000 об/мин в течении 5 минут для отделения РНК, к осадку добавляют 5% HClO₄, суспензию кипятят 15 минут, центрифугируют при 5000-8000 об/мин в течение 5-7 мин, после центрифугирования концентрацию ДНК определяют на спектрофотометре. Однако возможны и другие варианты. Предпочтительно для определения количества ДНК во фракции растворимого хроматина к супернатанту добавляют 57% HClO₄ до конечной концентрации 5%, инкубируют на льду в течении 10 минут и центрифугируют суспензию, отделяют осадок, к осадку, содержащему растворимый хроматин, добавляют 5% HClO₄, суспензию кипятят 15 минут с последующим центрифугированием, после центрифугирования концентрацию ДНК определяют на спектрофотометре. Однако возможны и другие варианты. Иногда для получения дополнительной информации для оценки глубины гидролиза ДНК в супернатанте, содержащем кислоторастворимый хроматин, измеряют концентрацию ДНК на спектрофотометре.

В дальнейшем сущность разработанного метода будет рассмотрена более подробно.

Суть предлагаемого метода - в определении аномалий упаковки хроматина сперматозоидов по его доступности для гидролиза микрококковой нуклеазой.

Метод состоит в количественной оценке глубины гидролиза хроматина микрококковой нуклеазой. После гидролиза хроматина производят разделение материала гидролизата на 2 фракции: растворимого хроматина, нерастворимого хроматина (и иногда - кислоторастворимого хроматина). Контролем при этом является характер гидролизата хроматина сперматозоидов доноров с показателями спермограммы, соответствующими норме.

Метод осуществляют следующим образом.

Образцы спермы, взятой у здоровых доноров и инфертильных пациентов, размораживают при комнатной температуре, очищают от сопутствующих соматических и недифференцированных клеток по стандартному методу, очищенные сперматозоиды осаждают центрифугированием при 5000 об/мин, 2 раза промывают в фосфатном буфере (PBS) с 5 мМ PMSF. На этом этапе можно обойтись однократной промывкой, а вместо PBS можно использовать другой буфер с соответствующими значениями рН и ионной силы. Осадок ресуспендируют в фосфатном буфере (PBS) с 5 мМ фенилметилсульфанилфторида (PMSF) и 1% Тритоном Х-100, инкубируют 5-10 минут на льду, клетки осаждают центрифугированием, осадок промывают 2 раза PBS с 5 мМ PMSF без Тритона Х-100. Полученный осадок ресуспендируют в растворе 20 мМ Трис-HCl (pH 8), 2 мМ CaCl₂, 2 мМ MgCl₂. Можно использовать 10 мМ Трис-HCl, однако в этом случае концентрация CaCl₂, и MgCl₂ должна составлять 1 мМ. К полученной суспензии добавляют микрококковую нуклеазу в диапазоне концентраций от 10 ед/мг до 50 ед/мг. Образцы инкубируют 3 минуты при температуре не ниже 10 и не выше 40°С. Реакцию гидролиза останавливают добавлением ЭДТА до 10 мМ во льду, образцы гомогенизируют энергичным встряхиванием или в приборе «Вортекс» и затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5-10 минут.

Полученный осадок (фракция 1) содержит нерастворимый хроматин (НРХ), супернатант (фракция 2) содержит растворимый хроматин (РХ).

Для определения количества ДНК к осадку (фракция 1) добавляют 0,5 мл 0,5 н. NaOH, суспензию инкубируют 20 минут при 60°С, образцы переносят на лед, после чего добавляют HClO₄ до 5%. Образцы центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 минут для отделения РНК (супернатант). К осадку добавляют 5% HClO₄, суспензию кипятят 15 минут, центрифугируют при 5000-8000 об/мин в течение 5-7 мин. После центрифугирования концентрацию ДНК определяют на спектрофотометре. Для определения количества ДНК во фракции растворимого хроматина к супернатанту (фракция 2) добавляют 57% HClO₄ до конечной концентрации 5%. Можно использовать 25% HClO₄, но конечная концентрация кислоты должна составлять не менее 5%. После инкубации на льду в течение 10 минут суспензию центрифугируют. В супернатанте, содержащем кислоторастворимый хроматин, измеряют концентрация ДНК на спектрофотометре. К осадку, содержащему растворимый хроматин, добавляют 5% HClO₄, суспензию кипятят 15 минут и центрифугируют. Можно кипятить суспензию 10 минут. После центрифугирования концентрацию ДНК определяют на спектрофотометре.

Затем рассчитывают концентрацию нуклеиновых кислот.

Метод был проверен на образцах спермы здоровых доноров и на образцах спермы инфертильных пациентов, предоставленных Центром планирования семьи.

1. Примеры здоровых доноров

№№ доноров Нерастворимый хроматин (%) Растворимый хроматин (%) 1613 98 0,3 210 94,4 2,3 2008 93,4 3,1

2. Примеры инфертильных пациентов

№№ пациентов Нерастворимый хроматин (%) Растворимый хроматин (%) 1 68,8 28,5 2 65,7 32 3 81,4 18,4

Следовательно, для спермы, взятой у здоровых доноров, содержание растворимого хроматина от общего количества хроматина не превышает 3%, а для спермы, взятой у инфертильных пациентов, содержание растворимого хроматина от общего количества хроматина, как правило, увеличивается в 10-20 раз и в некоторых случаях достигает 60% и выше.

Полученные данные коррелируют с электрономикроскопическими исследованиями тех же доноров и пациентов и представляют собой точную количественную оценку содержания в эякуляте инфертильных пациентов аномальных сперматозоидов.

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и может быть использовано при лечении бесплодия в программах экстракорпорального оплодотворения и гомологичной инсеминации. При реализации способа определяют аномалии упаковки хроматина сперматозоидов по его доступности для гидролиза микрококковой нуклеазой. Способ основан на количественной оценке глубины гидролиза хроматина микрококковой нуклеазой. После гидролиза хроматина производят разделение материала гидролизата на 2 фракции: растворимого хроматина и нерастворимого хроматина. Контролем при этом является характер гидролизата хроматина сперматозоидов доноров с показателями спермограммы, соответствующими норме. 9 з.п. ф-лы.

1. Способ диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии, характеризуемый тем, что образец спермы очищают от сопутствующих соматических и недифференцированных клеток, очищенные сперматозоиды осаждают центрифугированием, промывают в буферном растворе с рН 7,6÷8,0, осадок ресуспендируют в буферном растворе с рН 7,8÷8,2 в присутствии 10÷15 мМ Трис-HCl, инкубируют при охлаждении, клетки осаждают центрифугированием с последующим промыванием осадка, промытый осадок ресуспендируют в растворе с рН 7,8÷8,2 в присутствии 8,0÷12 мМ Трис-HCl, к полученной суспензии добавляют микрококковую нуклеазу, образцы инкубируют при температуре от 10 до 40°С, останавливают гидролиз, с последующей гомогенизацией и повторным центрифугированием образцов с получением осадка, содержащего нерастворимый хроматин, и супернатанта, содержащего растворимый хроматин, и по процентному содержанию растворимого хроматина не менее 18,4% и растворимого хроматина не выше 81,4% диагностируют наличие аномалии упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что образец спермы очищают по стандартному методу.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что сперматозоиды осаждают при скорости центрифугирования 4000÷6000 об/мин.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при ресуспендировании используют 1%-ный раствор Тритон Х-100.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что инкубирование осуществляют в течение 5-10 мин на льду.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что осадок ресуспендируют в растворе, содержащем 20 мМ Трис-HCl (рН 8), 2 мМ Са Cl₂, 2 мМ MgCl₂.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что микрококковую нуклеазу добавляют в диапазоне концентраций от 10 до 50 ед/мг.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что останавливают гидролиз добавлением ЭДТА до 10 мМ во льду.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что образцы гомогенизируют энергичным встряхиванием или в приборе «Вортекс».

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что образцы повторно центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5-10 мин.