СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ТОЧЕЧНОГО ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА АНТИГЕНА ВИРУСА ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к технике лабораторных исследований, в частности к точечному твердофазному иммуноферментному анализу, предназначенному для лабораторной серологической диагностики вирусных заболеваний, в том числе вируса чумы плотоядных.

Предшествующий уровень техники.

Известны традиционные методы диагностики вируса чумы плотоядных ( В.Н. Сюрин, В. Н. Белоусова, Н.В.Фомина. Диагностика вирусных болезней животных: Справочник. - Агропромиздат. - М.: 1991, с. 228-235), например реакция гемагглютинации (РГА) или реакция торможения гемагглютинации (РТГА) и др.

Для постановки этих реакций в качестве вирусcодержащего материала используют суспензию ткани куриного эмбриона, зараженного вирусом чумы плотоядных, или суспензию органов тканей больных животных. РГА проводят с 1%-ной взвесью куриных эритроцитов при комнатной t^o, pH около 7,0 обычным методом двухкратных разведений. Учет реакции через 1 - 1,5 ч. Для РТГА используют гипериммунную кроличью сыворотку, реакцию ставят общепринятым методом.

Недостатком указанных способов диагностирования вируса чумы плотоядных является низкая чувствительность и специфичность, невысокая воспроизводимость результатов.

Известен иммунологический способ определения количества вируса чумы плотоядных в крови собак (Заявка Японии N 60-130600, кл. C 07 K 15/04, G 01 N 33/577, 14.11.85).

Изобретение основано на использовании моноклональных антител в способе Sandwich ELISA. Моноклональные антитела продуцируются культурой ткани гибридом, полученных слиянием клеток лимфомы крыс с клетками крыс.

Недостатком способа является высокая стоимость проведения анализа с использованием моноклональных антител, что ограничивает область его применения.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ проведения точечного твердофазного иммуноферментного анализа вирусных антигенов и антител (Патент США N 4774177, кл. G 01 N 33/53; 33/544, кл. 435-7, опубл. 27.09.88), который используется для диагностики вируса гриппа и вируса псевдочумы (ньюкастлской болезни) птиц и может быть использован для диагностики вируса чумы плотоядных, относящийся так же как и псевдочума птиц к парамиксовирусам. Способ включает получение образцов сыворотки крови, содержащего антиген определяемого вируса, а также специфичных связывающих антител к определяемому вирусу и вторых антител - конъюгата белка A с пероксидазой хрена. Антиген (АГ) прикрепляют к нитроцеллюлозной подложке и последовательно обрабатывают эту подложку с АГ первыми и вторыми антителами, инкубируют и промывают в буферном растворе с последующим окрашиванием иммунохимического комплекса хромогеном. По появлению цветных пятен на подложке в месте нанесения положительных образцов судят о наличии антигена в пробе.

К недостаткам способа-прототипа относят недостаточную специфичность определения антигена вируса в исследуемой пробе (т.к. образец представляет собой сыворотку крови) и длительность проведения анализа (около 2,0 ч).

Раскрытие изобретения. В основу изобретения поставлена задача создания такого способа проведения точечного твердофазного иммуноферментного анализа антигенов вируса чумы плотоядных, который обеспечивал бы повышение специфичности определения антигена и сокращение времени его определения.

Поставленная задача решается тем, что в способе проведения точечного твердофазного иммуноферментного анализа антигена вируса чумы плотоядных, включающем приготовление образцов материала, содержащего антиген определяемого вируса, получение специфичных связывающих антител к определяемому вирусу и вторых антител - конъюгата белка A с пероксидазой хрена, прикрепление антигена к нитроцеллюлозной подложке, обработку подложки с антигеном первыми и вторыми антителами и промывку в буферном растворе подложки с последующим окрашиванием иммунохимического комплекса хромогеном, согласно изобретению, образцы проб антигена вируса чумы плотоядных получают из водных смывов с конъюктивы и слизистой носа, которые обрабатывают экстрагирующей смесью хлороформ-спирт, приготовленной в соотношении 3:1, с последующим удалением липидных фракций центрифугированием, а обработку подложки с антигеном первыми и вторыми антителами производят смесью этих антител, приготовленной в соотношении не менее 20:1 в белково-буферном растворе.

Преимущество получения АГ из водных смывов с конъюктивы и слизистой носа по сравнению с получением АГ из сыворотки крови состоит в том, что предлагаемый способ по сравнению с прототипом является более простым, не требует специального обучения персонала и не травмирует животных, а само определение становится более специфичным ввиду отсутствия в пробе IgG и гема, дающих неспецифическую реакцию. При обработке водных смывов экстрагирующей смесью хлороформ-спирт в соотношении 3:1 обеспечивается более полное освобождение вириона от липидных оболочек. При ином соотношении компонентов экстрагирующей смеси значительно снижается степень очистки АГ.

Соотношение первых и вторых антител менее 20:1 не обеспечивают кинетические условия иммунохимического процесса образования комплекса. Эксперименты показывают, что наиболее удачным соотношением первых и вторых антител является 40:1, при которых создаются наиболее оптимальные условия для образования многослоя реагентов, обеспечивающих высокую чувствительность предлагаемому способу диагностики.

Предлагаемый способ проведения точечного твердофазного иммуноферментного анализа вируса чумы плотоядных осуществляется следующим образом.

Антигены вируса чумы плотоядных определяют из водных смывов со слизистой носа и конъюктива собак. Водный смыв смешивают 1:1 с экстрагирующей смесью хлороформ-спирт, приготовленной в соотношении (3:1), перемешивают и центрифугируют 2 мин при 1500 об/мин. Смесь расслаивается на 2 слоя. 2 мкл водного раствора АГ из верхнего слоя наносят на нитроцеллюлозную подложку для сорбции в течение 2-3 мин. Подложку с АГ помещают в смесь первых и вторых антител, приготовленных в соотношении не менее 20:1, разведенных белково-буферным раствором (0,5% - желатина, 10% - сыворотка крупного рогатого скота, 0,1% - тритон X-100 на 0,1М NaHCO₃). Первые антитела представляют собой кроличью сыворотку против вируса чумы плотоядных (Штамм Snyder Hill), полученную иммунизацией кроликов хроматографически очищенным вирусом чумы плотоядных из органных гомогенатов инфицированных хорьков. Схема иммунизации - стандартная. Вторые антитела - конъюгат белка A с пероксидазой хрена.

Инкубацию проводят при 37^oC в течение 30 минут. После окончания инкубации нитроцеллюлозную подложку с иммунохимическим комплексом промывают в растворе 0,1% тритона X-100 на 0,1М NaHCO₃. Далее иммунохимический комплекс на подложке окрашивают красителем-хромогеном. В качестве хромогена используют 3,3-диаминобензидин тетрагидрохлорид (ДАБ. 4HCl и H₂O₂). Краситель готовят на буфере трис•HCl 0,05М, pH 7,4. После окрашивания через 3 мин определяют визуально результат: по появлению коричневых пятен в месте нанесения антигена вируса чумы плотоядных.

Контрольный положительный образец (K⁺) получают из инактивированного формалином органного гомогената хорька, зараженного штаммом вируса чумы плотоядных (Shyder Hill), полученным из ВГНИ контроля, стандартизации и сертификации ветпрепаратов г. Москва. Для этой цели хорькам вводили внутримышечно вирусный материал в дозе 1000-10000 ЛД₅₀. Через 10-14 дней при появлении четких клинических симптомов животных забивали и готовили 20% гомогенат печени и селезенки на растворе Эрла, который затем осветляли и добавляли раствор формалина до конечной концентрации 0,1%. Смесь выдерживали в течение 2 суток в термостате при 37^oC и затем в течение 5 суток при комнатной температуре. Полученный т.о. материал использовали в качестве референс-образца для определения специфической активности сыворотки и конъюгата и K⁺.

В качестве отрицательного контрольного образца используют осветленный низкоскоростным центрифугированием гомогенат печени и селезенки здоровых животных, приготовленных аналогично.

Для оценки чувствительности и специфичности метода исследовали смывы 278 собак различных пород с клиническими диагнозами "ринит", "конъюктивит" и "чума", отслеживая дальнейшее течение болезни (в таблице 1).

Исследования смывов от собак, имеющих клинический диагноз "ринит", "конъюктивит", "чума", показало некоторое несоответствие с результатами лабораторной диагностики предложенным способом, что может быть вызвано неточностью клинического диагноза на ранних стадиях заболевания в группах "ринит" и "конъюктивит". Развитие в дальнейшем клиники чумы полностью подтверждает результаты лабораторных исследований предложенным способом диагностики. В группе собак с клиническим диагнозом "чума" в результате лабораторных исследований получено значительно большее число положительных реакций, но их количество не соответствует числу последующего развития клиники чумы. Это связано с тем, что большая часть собак с первоначальным диагнозом "чума" своевременно получили соответствующее лечение, которое в ряде случаев было специфическим, с использованием лечебных сывороток и иммуноглобулинов.

По оценочным данным специфичность предлагаемого способа определения возрастает в 2-3 раза по сравнению с прототипом вследствие того, что в водных смывах полностью отсутствуют гем и IgG, дающие значительное количество неспецифических реакций в ходе определения с использованием белка A, конъюгированного с пероксидазой (вторые антитела).

Время определения антигенов вируса чумы плотоядных предлагаемым способом уменьшено в 2,5 раза по сравнению со способом-прототипом.

Промышленная применимость.

Изобретение может быть использовано в ветеринарной и вирусологической практике и научных исследованиях.

Использование: медицина, ветеринария, техника лабораторных исследований, для проведения точечного твердофазного иммуноферментного анализа, предзначенного для лабораторной серологической диагностики вирусных заболеваний, в том числе вируса чумы плотоядных. Сущность изобретения: способ включает приготовление образцов материала из водных смывов с конъюктивы и слизистой носа, содержащего антиген вируса чумы плотоядных и обработанного экстрагирующей смесью хлороформ - спирт в соотношении 3:1, получение специфичных связывающих антител к определяемому вирусу и вторых антител - конъюгата белка А с пероксидазой хрена, прикрепление антигена к нитроцеллюлозной подложке, обработку подложки с антигеном смесью первых и вторых антител, приготовленную в соотношении не менее 20:1 в белково-буферном растворе. Полученный на подложке иммунохимический комплекс окрашивают хромогеном.

Способ проведения точечного твердофазного иммуноферментного анализа антигена вируса чумы плотоядных, включающий приготовление образцов материала, содержащего антиген определяемого вируса, получение специфичных связывающих антител к определяемому вирусу и вторых антител - конъюгата белка А с пероксидазой хрена, прикрепление антигена к нитроцеллюлозной подложке, обработку подложки с антигеном первыми и вторыми антителами и промывку подложки в буферном растворе с последующим окрашиванием иммунохимического комплекса хромогеном, отличающийся тем, что образцы проб антигена вируса чумы плотоядных получают из водных смывов конъюктивы и слизистой носа, которые обрабатывают экстрагирующей смесью хлороформ - спирт, приготовленной в соотношении 3 : 1 с последующим удалением липидных фракций центрифугированием, а обработку подложки с антигеном первыми и вторыми антителами производят смесью этих антител, приготовленной в соотношении не менее 20 : 1 в белково-буферном растворе.