СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ КУЛЬТУРАЛЬНОГО АНТИГЕНА ИЗ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОЙ АНЕМИИ ЛОШАДЕЙ И НАБОР ДЛЯ ИНДИКАЦИИ АНТИТЕЛ ИЛИ АНТИГЕНА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОЙ АНЕМИИ ЛОШАДЕЙ Российский патент 2000 года по МПК A61K39/21 G01N33/569 C12N7/06 C07K14/15 G01N33/531 G01N33/543 G01N33/558 G01N33/559 A61K39/42 C12N7/00 C07K16/08 C12N7/06 C12R1/93 

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной вирусологии, а именно к получению антигена и тест-систем для обнаружения антител к вирусу инфекционной анемии (ИНАН) лошадей, а также индикации и титрования вируса.

Известен способ получения антигена вируса ИНАН лошадей путем культивирования вируса на культуре эмбриона клеток почки лошадей. Культуру клеток инкубируют при 37^oC в течение 2 недель. Поддерживающая среда - среда Игла с добавлением 3%-ной телячьей сыворотки, антибиотиков и бикарбоната натрия. Околоклеточную культуральную жидкость сливают и исследуют на наличие вирусного материала (Orrego A. Et al. Virilence and in vitro growth of cell-adapteol strain of equine infections anemia virus afters serial passage in ponies // "Amer. J. Vet. Res.", 1982, v. 43, N 9, p. 1556-1560).

Однако известный способ нетехнологичен, дает невысокий выход вируссодержащего материала и используется только в лабораторных условиях, а получаемый антиген характеризуется низкой специфичностью и активностью.

Наиболее близким аналогом является способ получения антигена вируса ИНАН лошадей путем внутривенного введения 8-10 жеребятам освеженного штамма вируса ИНАН. На высоте температурной реакции жеребят убивают и извлекают селезенку. Антиген представляет собой экстракт из гомогенизированной селезенки. Известный набор для серодиагностики инфекционной анемии в реакции диффузной преципитации (РДП) содержит антиген вируса ИНАН, специфическую сыворотку, полученную гипериммунизацией лошадей специфическим вирусом, и отрицательную сыворотку ("Ветеринарные препараты". - Справочник под ред. Д.Ф.Осидзе, М., Колос, 1981, с.97-98).

Недостатком известного способа является то, что для изготовления антигена необходимо проводить вынужденный забой экспериментально зараженных лошадей, а получаемый антиген не стандартен и не обладает достаточно высокой чувствительностью
Задачей изобретения является разработка промышленной технологии получения антигена ИНАН, позволяющей нарабатывать большое количество вирусного материала в культуре клеток, исключающей вынужденный забой лошадей, и получении на его основе стандартных наборов для индикации антител и антигена.

Технический результат заключается в повышении чувствительности, стандартности и специфичности культурального антигена и наборов для индикации антител и антигена.

Сущность изобретения заключается в следующем. При изготовлении культурального антигена для индикации антител и антигена вируса инфекционной анемии лошадей используют штамм вируса инфекционной анемии лошадей N "3-К-ВНИИТИБП-ВИЭВ". Штамм выращивают в культуре клеток кожи и/или мышц, и/или легкого, и/или почек эмбриона лошади до накопления вируса в титре 10⁵ ИД, 50/мл, концентрируют ультрафильтрацией в 10-20 раз, отделяют липидную оболочку обработкой эфиром на холоду и получают целевой продукт, представляющий собой пептид с молекулярной массой (м.м.) 24-26 кД, несущий группоспецифические антигенные детерминанты.

После стадии концентрирования вирусный материал может быть дополнительно подвергнут очистке последовательно методами скоростного центрифугирования и ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Далее отделяют липидную оболочку обработкой эфиром на холоду, очищают аффинной хроматографией и получают целевой продукт, представляющий собой иммуноэлектрофоретически чистый пептид с м.м. 24-26 кД, несущий группоспецифические антигенные детерминанты.

Для изготовления культурального антигена используют новый культуральный штамм вируса инфекционной анемии лошадей "3-К-ВНИИТИБП-ВИЭВ". Штамм выделен от больной ИНАН лошади и адаптирован к культуре клеток эмбриона лошади.

Штамм депонирован в коллекции вирусов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ), хранится в коллекции Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности (ВНИИТИБП) и имеет регистрационный номер "3-К-ВНИИТИБП-ВИЭВ".

Штамм вируса инфекционной анемии лошадей характеризуется следующими свойствами.

Морфология. РНК-содержащий вирус. Форма вирионов овальная, ассиметрическая, имеет липидную внешнюю оболочку, размер вирусных частиц 80-200 нм.

Характер образования по Дульбекке: бляшки не образует.

Чувствителен к эфиру, устойчив к температуре 50^oC в течение 30 мин; внутриядерные и внутриплазматические базофильные и эозинофильные включения не вызывает.

Преобладающий тропизм. Эпителиотропный.

Восприимчивые животные. Естественно восприимчивы лошади, ослы, мулы, зараженные подкожно, внутримышечно, внутривенно; инкубационный период от 4-7 дней до 90 дней.

Культуральные свойства. Штамм размножается в культуре клеток почки, кожи, мышц и легкого эмбриона лошади.

Серологическая характеристика штамма. Активен в реакциях гемагглютинации (РГА), диффузной преципитации (РДП), иммуноферментном анализе (ИФА). Титр вируса в РГА с эритроцитами лошади и морской свинки - 1:8-1:16, в РДП (после обработки эфиром) - 1:1 - 1:4, в ИФА (после обработки эфиром) - 1:32-1:128.

Иммуногенная активность. Не иммуногенен.

Наличие титра инфекционности: 1 •10⁵ ИД 50/мл для культуры клеток почки, кожи, мышц и легкого эмбриона лошади.

Эпизоотичность штамма. В естественных условиях может распространяться.

Стабильность. Штамм стабилен, при длительном хранении при -40^oC титр вируса не изменяется в течение 2 лет, антигенная активность сохраняется не менее 2 лет.

Штамм поддерживается путем заражения переживаемой культуры клеток почки эмбриона лошади один раз в 2 года.

Полученный культуральный антиген используют для составления наборов для индикации антител к вирусу ИНАН или антигена вируса ИНАН.

Наборы для индикации антител к вирусу инфекционной анемии лошадей предназначены для диагностики инфекционной анемии лошадей в РДП или ИФА.

Набор для индикации антигена предназначен для титрования антигена вируса ИНАН в ИФА в процессе культивирования, например, методом модифицированного конкурентного ИФА.

Набор для индикации антител к вирусу инфекционной анемии лошадей в РДП содержит культуральный антиген вируса ИНАН и специфическую преципитирующую сыворотку, полученную от экспериментально зараженных вирусом ИНАН лошадей.

Набор для индикации антител к вирусу инфекционной анемии лошадей в ИФА (непрямом ИФА) содержит культуральный антиген вируса ИНАН для иммобилизации на твердом носителе, полистироловый 96-ти луночный планшет и конъюгированный с пероксидазой хрена антивидовой иммуноглобулин класса G (lg G).

Набор для индикации антигена в ИФА содержит культуральный антиген вируса ИНАН для иммобилизации на твердом носителе, полистироловый 96-ти луночный планшет и конъюгированный с пероксидазой хрена lg G к вирусу ИНАН.

При комплектации наборов для индикации антител или антигена в ИФА предпочтительно используют дополнительно очищенный согласно изобретения иммуноэлектрофоретически чистый препарат культурального антигена вируса ИНАН.

Наборы для индикации антител или антигена в ИФА также содержат желатин, субстрат для проведения пероксидазной реакции, например, ортофенилендиамин и перекись водорода. Кроме того, в наборы включены детергент - тритон Х-100 или твин-80 и буферные растворы - фосфатно-солевой, натрий бикарбонатный и цитратный. Наборы могут также содержать положительный и отрицательный контроли.

В наборе для индикации антигена в ИФА в качестве положительного контроля используют иммуноэлектрофоретически чистый препарат антигена культурального вируса ИНАН с известной положительной преципитирующей активностью, определенной в РДП с референс-сывороткой. Отрицательный контроль - образцы среды культивирования неинфицированных вирусом клеток эмбриона лошади. Отрицательный контроль подвергают очистке, как и специфический антиген.

В наборе для индикации антител в ИФА в качестве положительного контроля используют специфическую сыворотку от экспериментально зараженной вирусом ИНАН лошади с известным титром; в качестве отрицательного контроля - сыворотку крови клинически здоровой лошади.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Для изготовления антигена культурального для индикации антител к вирусу ИНАН или антигена вируса ИНАН используют культуральный штамм N "3-К- ВНИИТИБП-ВИЭВ" вируса ИНАН лошадей, адаптированный к культурам клеток кожи, мышц, легкого и почек эмбриона лошади.

Вирусным материалом является среда культивирования инфицированных клеточных культур, полученная через 21-40 сут после заражения культуры клеток вирусом.

Для получения первичных культур клеток кожи, мышц, легкого и почек берут эмбрионы от вынужденно убитых или абортированных лошадей. Клетки получают из кусочков тканей (1-3 мм) по общепринятой методике трипсинизирования. Дезагрегацию проводят дробно: через каждые 10-15 мин сливают суспендированные клетки в центрифужные флаконы, куда добавляют для инактивации трипсина сыворотку крупного рогатого скота. Далее производят цетрифугирование, надосадочную жидкость сливают, а осадок клеток ресуспендируют в ростовой среде. Клетки высевают в клинские матрасы, производят смену питательной (ростовой) среды на вторые сутки и инкубируют в термостат до формирования полного монослоя (3-5 дней). После формирования полного монослоя культуру клеток используют для заражения вирусом, криоконсервирования или дальнейших пересевов.

Для заражения вирусом отбирают матрасы с полным монослоем клеток, удаляют питательную среду, вносят в каждый матрас по 20-25 мл вирусного материала. Инкубируют в термостате в течение 1,5-2 ч. После этого, не удаляя вирусный материал, вносят питательную среду в объеме 230-250 мл и культуру помещают в термостат. Все сливы вируссодержащей жидкости собирают (отдельно из каждого матраса и каждой культуры), отбирают пробы для определения титра в РДП и ИФА.

Пробы вируса концентрируют ультрафильтрацией в 10 раз. Далее полученные концентрированные вируссодержащие сливы обрабатывают охлажденным до 3-7^oC эфиром, встряхивают 10-20 мин, отстаивают в течение 15-20 мин, эфир сливают. Обработку повторяют дважды. После вторичной обработки эфиром вируссодержащей жидкости для более полного удаления эфира смесь замораживают, затем остатки эфира сливают. Для производства антигена используют вирусный материал со специфической активностью в РДП на +++ и ++++. Полученный антиген, представляющий собой пептид с м.м. 24-26 кД, несущий группоспецифические антигенные детерминанты, с соблюдением правил асептики и антисептики смешивают с защитной средой, расфасовывают, лиофильно высушивают и хранят при температуре 2-8^oC или в замороженном состоянии при температуре от -40 до -50^oC.

Пример 2. Сконцентрированный ультрафильтрацией вирусный материал штамма "3-К-ВНИИТИБП-ВИЭВ" вируса ИНАН лошадей получают аналогично примеру 1. Затем полученный вирус дополнительно очищают последовательно методами скоростного центрифугирования при 100 000 g в течение 3 часов и ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы при 100 000 g. Далее вируссодержащий материал обрабатывают эфиром по примеру 1 методом аффинной хроматографии и получают иммуноэлектрофоретически чистый препарат культурального антигена вируса ИНАН.

Пример 3. Для изготовления специфической сыворотки проводят заражение здоровых лошадей путем подкожного введения штамма N "3-К-ВНИИТИБП-ВИЭВ" вируса ИНАН лошадей. Через 6-8 недель после заражения у животных берут пробы крови на исследование активности и специфичности. При титре преципитирующих антител не ниже 1:4 проходят крововзятие и отделяют сыворотку. Каждую серию сыворотки доводят до рабочего разведения (до разведения, дающего с контрольным положительным антигеном линию преципитации), добавляют антибиотики или консерванты, прогревают, подвергают стерилизующей фильтрации, расфасовывают и лиофильно высушивают.

Пример 4. Составляют набор реагентов для диагностики инфекционной анемии лошадей (индикации антител) в РДП. Тест- система содержит специфический антиген для постановки РДП при ИНАН, полученный по примеру 1, и специфическую сыворотку, полученную по примеру 3. Набор предназначен для серодиагностики инфекционной анемии лошадей в РДП путем обнаружения в крови больных лошадей вирусспецифических преципитирующих антител.

Для исследования специфичности и активности тест-системы используют пробы сыворотки крови от 550 лошадей-продуцентов сыворотки жеребых кобыл (СЖК), от 132 лошадей карантина, от 18 жеребят, заготовленных для биопробы и пробы положительных референс-сывороток (N 1-10), содержащих преципитирующие антитела против антигена вируса ИНАН, полученные от экспериментально зараженных вирусом ИНАН лошадей. Всего исследовано 710 проб крови лошадей. Испытание проводят в сравнении с известным набором диагностикумов ИНАН для РДП, изготовленным из гомогената селезенки.

Исследование проводят в соответствии с "Методикой постановки реакции диффузной преципитации (РДП) для серологической диагностики инфекционной анемии лошадей", рекомендованной ГУВ 05.05.77г.

В результате проведенных исследований установлено:
- испытуемые сыворотки крови от 700 лошадей отрицательны в РДП при ИНАН как с известными диагностикумами, так и с диагностикумами, изготовленными из культурального вируса ИНАН;
- антиген культурального вируса ИНАН формировал линии преципитации с положительными референс-сыворотками (N 1-10), идентичные линиям преципитации, образованными известным антигеном, но в большем разведении, что свидетельствует о более высокой чувствительности.

Пример 5. Полученный по примеру 2 антиген используют при комплектовании набора реагентов для индикации антигена в модифицированном конкурентном ИФА для адсорбции на планшеты, например, полистироловые 96-ти луночные. Кроме специфического культурального антигена вируса ИНАН для иммобилизации на твердом носителе, тест-система содержит конъюгированный с пероксидазой хрена Ig G к вирусу ИНАН, и субстрат для проведения пероксидазной реакции, например, ортофенилендиамин и перекись водорода. Кроме того, в набор включены детергент - тритон Х-100 или твин-80 и буферные растворы - фосфатно-солевой, натрий бикарбонатный и/или цитратный. Набор содержит положительный и отрицательный контроли, а также желатин.

В качестве положительного контроля используют иммуноэлектрофоретически чистый препарат антигена культурального вируса ИНАН с известной положительной преципитирующей активностью, определенной в РДП с референс-сывороткой. Отрицательный контроль - образцы среды культивирования неинфицированных вирусом клеток эмбриона лошади. Отрицательный контроль подвергают очистке, как и специфический антиген.

Принцип модифицированного конкурентного ИФА основан на конкурентной реакции между антигеном, иммобилизированным на планшетах, и антигеном в исследуемой пробе за связь с иммунопероксидазным конъюгатом.

Анализ проводят по следующей схеме. Исследуемую пробу, содержащую определяемый антиген, смешивают в соотношении 1:1 со специфическими антителами, меченными ферментом. Смесь добавляют к антигену, иммобилизированному на планшетах. После добавления в аналитическую систему субстрата образуется окраска раствора. Разница в интенсивности окраски раствора "нулевой пробы" (отрицательный контроль) и опытной пробы, содержащей антиген, пропорциональна количеству антигена в исследуемой пробе.

Для исследования чувствительности набора реагентов для индикации антигена в качестве аналитической системы используют:
иммуноэлектрофоретически чистый препарат культурального антигена вируса ИНАН для адсорбции на платы и построения стандартной кривой с титром преципитирующей активности 1:8-1:16 и содержанием белка 2,5 мг/мл;
иммуноглобулин класса G, конъюгированный с пероксидазой из хрена, окисленной перйодатом натрия (содержание пероксидазы в конъюгате - 58856 нг/мл);
образцы неинфицированной и инфицированной вирусом ИНАН среды культивирования клеток почки лошади, зашифрованные под номерами 1-15;
контрольные образцы N 16-18 инфицированной вирусом ИНАН среды культивирования клеток почки лошади, в которой антиген вируса ИНАН был определен в РДП (титр преципитирующей активности 1:8);
в качестве контроля антигена на специфичность используют среду культивирования неинфицированных вирусом клеток почки, которую подвергают очистке, как и специфический антиген.

В ходе испытаний были получены следующие результаты:
- иммунопероксидазный конъюгат не давал неспецифической реакции с контрольным антигеном: Д 492 равна 0,055-0,098;
- антиген культурального вируса ИНАН был обнаружен в пробах N 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 12, 16, 17, 18, что соответствовало образцам инфицированной вирусом ИНАН среды культивирования клеток почки;
- антиген культурального вируса ИНАН не был обнаружен в пробах N 3, 6, 10, 13, 14, 15, что соответствовало образцам неинфицированной вирусом ИНАН среды культивирования клеток почки;
- максимальное разведение, при котором был определен антиген вируса ИНАН, равно 1:256 - 1:512.

Пример 6. Полученный по примерам 1 или 2 антиген используют при комплектовании набора для индикации антител (диагностики инфекционной анемии) в непрямом ИФА для адсорбции на полистироловые планшеты.

Кроме иммобилизированного на твердом носителе культурального антигена вируса ИНАН тест-система содержит конъюгат антивидового иммуноглобулина класса G (Ig G) с пероксидазой хрена, субстрат для проведения пероксидазной реакции (например, ортофенилендиамин и перекись водорода), детергент (тритон Х-100 или твин-80) и буферные растворы - фосфатно-солевой, натрий бикарбонатный и/или цитратный. Набор содержит также положительный и отрицательный контроли и желатин. В качестве положительного контроля используют специфическую сыворотку от экспериментально зараженной вирусом ИНАН лошади с известным титром; в качестве отрицательного контроля - сыворотку крови клинически здоровой лошади.

Принцип непрямого ИФА заключается в том, что исследуемую пробу, содержащую антитела, добавляют к специфическому антигену, иммобилизированному на планшетах, затем последовательно добавляют иммунопероксидазный конъюгат антивидовых Ig G и субстратный раствор ортофенилендиамина и перекиси водорода. После прибавления субстрата образуется окраска раствора, интенсивность которой пропорциональна количеству антител в исследуемой пробе. За титр исследуемой сыворотки считают ее последовательное разведение, дающее Д 492 (Оп) - Д 492 (К) = 0,200.

Для исследования чувствительности и специфичности набора реагентов для индикации антител в качестве аналитической системы используют:
иммуноэлектрофоретически чистый препарат культурального антигена вируса ИНАН для адсорбции на платы;
антивидовой иммуноглобулин класса G, конъюгированный с пероксидазой из хрена;
образцы сывороток крови от неинфицированных и инфицированных вирусом ИНАН лошадей, зашифрованные под номерами 1-15;
контрольные образцы сывороток крови от инфицированных вирусом ИНАН лошадей (N 16-18), в которых антитела были обнаружены в РДП;
в качестве контроля специфичности сывороток используют среду культивирования неинфицированных вирусом клеток почки, которую подвергают очистке, как и специфический антиген.

В ходе испытаний были получены следующие результаты:
- специфические преципитирующие сыворотки проявляли специфическую активность по отношению к иммобилизированному на твердом носителе культуральному антигену вируса ИНАН;
- специфические преципитирующие антитела были обнаружены в пробах N 1, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 16, 17, 18, что соответствовало сывороткам, полученным от инфицированных вирусом ИНАН лошадей;
- специфические преципитирующие антитела не были обнаружены в пробах N 2, 3, 9, 10, 14, 15, что соответствовало сывороткам, полученным от здоровых лошадей;
- максимальное разведение, при котором обнаруживались специфические преципитирующие антитела в сыворотках крови, было равно 1:2560 - 1:5120.

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной вирусологии. Для изготовления антигена используют новый штамм вируса инфекционной анемии лошадей (ИНАН) "3-К-ВНИИТИБП-ВИЭВ". Штамм выращивают в культуре клеток кожи и/или мышц, и/или легкого, и/или почек эмбриона лошади до накопления вируса в титре 10⁵ ИД 50/мл. Концентрируют ультрафильтрацией в 10-20 раз. Отделяют липидную оболочку обработкой эфиром на холоду. Получают целевой продукт, представляющий собой пептид с м.м. 24-26 кД, несущий группоспецифические антигенные детерминанты. После стадии концентрирования вирусный материал может быть дополнительно подвергнут очистке скоростным центрифугированием и ультрацентрифугированием. После отделения липидной оболочки полученный антиген повторно очищают аффинной хроматографией. В этом случае целевой продукт представляет собой иммуноэлектрофоретически чистый пептид. Полученный культуральный антиген используют для составления наборов для индикации антител или антигена вируса ИНАН. Наборы для индикации антител предназначены для диагностики инфекционной анемии лошадей в РДП или ИФА. Набор для индикации антигена предназначен для титрования антигена вируса ИНАН в процессе культивирования. Набор для индикации антител в РДП содержит культуральный антиген и специфическую преципитирующую сыворотку. Набор для индикации антител в ИФА содержит культуральный антиген для иммобилизации на твердом носителе, полистироловый планшет и конъюгированный с пероксидазой хрена антивидовой иммуноглобулин класса G(IgG). Набор для индикации антигена содержит культуральный антиген для иммобилизации на твердом носителе, полистироловый планшет и конъюгированный с пероксидазой хрена IgG к вирусу ИНАН. Наборы для ИФА также содержат желатин, субстрат для проведения пероксидазной реакции, детергент и буферные растворы. Наборы могут также содержать положительный и отрицательный контроли. Изобретение повышает чувствительность, стандартность и специфичность культурального антигена и наборов для индикации антител и антигена. 2 с. и 16 з.п.ф-лы.

1. Способ изготовления культурального антигена из вируса инфекционной анемии лошадей, отличающийся тем, что штамм вируса инфекционной анемии лошадей N 3-К- ВНИИТИБП-ВИЭВ выращивают в культуре клеток кожи, и/или мышц, и/или легкого, и/или почек эмбриона лошади до накопления вируса в титре 10⁵ ИД 50/мл, концентрируют ультрафильтрацией в 10 - 20 раз, отделяют липидную оболочку обработкой эфиром на холоду и получают целевой продукт, представляющий собой пептид с м.м. 24 - 26 кД, несущий группоспецифические антигенные детерминанты. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что после концентрирования ультрафильтрацией вирусный материал дополнительно подвергают очистке методами скоростного центрифугирования и ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы, а после отделения липидной оболочки его повторно очищают аффинной хроматографией. 3. Набор для индикации антител или антигена вируса инфекционной анемии лошадей, отличающийся тем, что содержит культуральный антиген, полученный из штамма вируса инфекционной анемии лошадей N 3-К- ВНИИТИБП-ВИЭВ, и положительный контроль. 4. Набор по п.3, отличающийся тем, что при индикации антител в качестве положительного контроля содержит специфическую преципитирующую сыворотку, полученную от экспериментально заряженных вирусом инфекционной анемии лошадей с известным титром. 5. Набор по п.3, отличающийся тем, что при индикации антител или антигена в иммуноферментном анализе содержит антиген для иммобилизации на твердом носителе, полистироловый планшет и конъюгат иммуноглобулинов класса G с пероксидазой хрена. 6. Набор по п.5, отличающийся тем, что при индикации антител в качестве конъюгата содержит конъюгат антивидового иммуноглобулина класса G с пероксидазой хрена. 7. Набор по п.5, отличающийся тем, что при индикации антигена в качестве конъюгата содержит конъюгат иммуноглобулина класса G к вирусу инфекционной анемии лошадей с пероксидазой хрена. 8. Набор по п.5, отличающийся тем, что дополнительно содержит субстрат для проведения пероксидазной реакции. 9. Набор по п.8, отличающийся тем, что содержит ортофенилендиамин и перекись водорода. 10. Набор по п.5, отличающийся тем, что дополнительно содержит детергент. 11. Набор по п. 10, отличающийся тем, что содержит тритон Х-100 или твин-80. 12. Набор по п.5, отличающийся тем, что дополнительно содержит буферный раствор. 13. Набор по п. 12, отличающийся тем, что содержит фосфатно-солевой, и/или натрий бикарбонатный, и/или цитратный буферный раствор. 14. Набор по п.5, отличающийся тем, что дополнительно содержит отрицательный контроль. 15. Набор по п.14, отличающийся тем, что при индикации антител в качестве отрицательного контроля содержит сыворотку крови клинически здоровой лошади. 16. Набор по п.14, отличающийся тем, что при индикации антигена в качестве отрицательного контроля содержит образцы среды культивирования неинфицированных вирусом клеток эмбриона лошади. 17. Набор по п.5, отличающийся тем, что при индикации антител в качестве положительного контроля содержит культуральный антиген, очищенный по п.2, с известной положительной преципитирующей активностью, определенной в РДП с референс-сывороткой. 18. Набор по п.5, отличающийся тем, что дополнительно содержит желатин.