СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОБОГАЩЕННОГО ИЗОФЛАВОНАМИ РАСТИТЕЛЬНОГО БЕЛКОВОГО ИЗОЛЯТА Российский патент 1999 года по МПК A61K35/78 A23L1/20 

Изобретение относится к способам получения обогащенного изофлавонами растительного белкового изолята.

Изофлавоны встречаются в различных бобовых растениях, включая такие растительные белковые материалы, как соевые бобы.

Эти соединения, извлекаемые по изобретению, обычно включают дайдзин, 60АC-дайдзин, дайдзеин, генистин, 6OAC-генистин, генистеин, глицитин, биоханин-А, формононетин и куместрол. Как правило, эти соединения связаны с присущим соевым бобам горьким вкусом, при получении коммерческих продуктов, таких как изоляты и концентраты, основной проблемой является удаление этих соединений. Например, при стандартном способе получения соевого белкового изолята, в котором соевые хлопья экстрагируются с помощью щелочной водной среды, большая часть изофлавонов растворяется в экстракте и остается растворенной в сыворотке, которую после кислотного осаждения белка в форму изолята обычно выбрасывают. Остаточные изофлавоны, перешедшие в кислотоосажденный белковый изолят, обычно удаляют избыточной промывкой изолята.

Недавно было установлено, что изофлавоны, содержащиеся в таких растительных белках, как соевые бобы, могут ингибировать рост раковых клеток человека, как, например, рост раковых клеток молочной или предстательной желез, как описано в следующих статьях: "Генистеиновое ингибирование раковых клеток молочной железы человека: независимость от экстрогеновых рецепторов и гена устойчивости к многообразным лекарственным препаратам Петерсона и Барнеса (Peterson and Barnes) в журнале Biochemical and Biophysical Research communications том 179 N 1, страницы 661-667, август 30, 1991; "Генистеин и биоханин - ингибиторы раковых клеток простаты человека, но не рецептора эпидермального фактора роста тирозинового самофосфорилирования Петерсона и Барнеса (Peterson and Barnes) в журнале Prostate, том 22, страницы 335-345, 1993 г. и "Угнетение соевыми бобами грудных опухолей на моделях рака молочной железы" Барнеса и др. (Barnes et al.), в журнале Mutagens and Carcinogens in the Diet, страницы 239-253, 1990 г.

Отмеченный выше интерес к изофлавонам указывает на потребность в пригодных для приема в пищу белковых материалах, обогащенных этими соединениями, хотя в предыдущих способах получения коммерческих белковых материалов прилагались огромные усилия для их удаления.

Таким образом, предметом настоящего изобретения является обогащенный изофлавоном белковый изолят и способ его получения. Эта и другие задачи, достигаемые изобретением, а также их достижение подробно описываются ниже.

Настоящее изобретение относится к способам получения растительного белкового изолята, обогащенного изофлавонами, включающими экстракцию растительного белкового материала водным экстрагирующим раствором, имеющим pH около изоэлектрической точки белкового материала (для получения водного экстракта белка и изофлавонов). Затем для того, чтобы осадить белковый материал, pH водного экстракта доводят до значения, близкого к изоэлектрической точке белкового материала. Осажденный белковый материал затем отделяют и либо избегают дальнейшей промывки осадка, либо сводят ее к минимуму (для предотвращения удаления изофлавонов и обеспечения насыщения ими изолята). Дополнительно, после того, как изофлавоны легко растворятся в экстрагирующем растворе, применяемом для растворения белка, для предельного увеличения растворения изофлавонов в процессе экстракции используется определенное весовое соотношение белкового материала к воде.

По настоящему изобретению изофлавоны, представляющие интерес, имеют следующую общую формулу:

где
R₁, R₂, R₃ и R₄ могут быть выбраны из групп, состоящих из н, OH, и OCH₃, также как и глюкозидов этих соединений. В частности, эти соединения и их глюкозиды, которые были выделены из растительного белкового материала, включают дайдзин, 6OAC-дайдзин, дайдзеин, генистин, 6OAC-гинистин, генистеин, глицитин, биоханин-A, формононетин и куместрол. В настоящем изобретении с целью получения обогащенных изолятов предпочитались изофлавоны, включающие дайдзин, 6OAC-дайдзин, дайдзеин, генистин, 6OAC-генистин и генистеин.

Предпочтительный вариант выполнения изобретения
Хотя описание настоящего изобретения будет касаться продуктов из соевых бобов, и, в частности, способа, особенно пригодного для получения обогащенного изофлавоном соевого изолята, тем не менее, настоящий способ в целом также применим для получения белковых изолятов из других растительных белковых источников, содержащих изофлавоны.

В настоящем изобретении в качестве исходного сырья использованы хлопья соевых бобов, из которых масло было удалено растворяющей экстракцией. Хлопья экстрагировали с помощью водного экстрагирующего раствора, имеющего pH, близкое к значению изоэлектрической точки белкового материала (предпочтительно, pH около 6-10 и лучше всего pH 6,7 - 9,7). В случае необходимости для увеличения значения pH водного экстрагирующего раствора могут быть использованы обычные щелочные реактивы, такие как гидроксид натрия, калия или кальция. Требуемые изофлавоновые соединения обычно растворяются в водном экстрагирующем растворе и для того, чтобы достичь максимального выделения этих соединений из хлопьев в водный экстракт и получить как можно более обогащенный изофлавонами белковый материал, весовое соотношение хлопьев к водному экстракту поддерживают на определенном уровне.

Экстракция белков и изофлавонов может быть проведена различными способами, включающими противоточную экстракцию хлопьев при весовом соотношении хлопьев к водному экстрагирующему раствору от 5:1 до 12:1, в которой начальный экстракт используется для реэкстракции хлопьев и обеспечения водного экстракта белками и изофлавонами. Кроме того, может быть использован метод двухстадийной экстракции, в котором весовое соотношение хлопьев к экстрагирующему раствору на начальных стадиях составляет 8:1. Затем вторую экстракцию хлопьев проводят свежим экстрагирующим раствором при весовом соотношении от 3:1 до 6:1 таким образом, чтобы комбинированное весовое соотношение хлопьев к экстрагирующему раствору на обеих стадиях не превышало бы суммарного весового соотношения от 11:1 до 14:1.

Хотя экстракция может быть проведена при температуре до 120^o F (около 50^oC) в течение 5-60 минут, и это не является обязательным условием, предпочтительнее проводить ее в течение 15 минут. pH описанного выше водного белкового экстракта, содержащего изофлавоны, затем доводят до изоэлектрической точки белка посредством добавления кислоты, такой как, например, уксусная, серная, фосфорная, соляная, или какими-либо другими подходящими кислотными реагентами. Изоэлектрическая точка белка соевых бобов обычно составляет от 4 до 5, предпочтительнее от 4,4 до 4,6. При приближении pH к изоэлектрической точке белок осаждается в виде творожистого осадка. Обычно при получении изолята стандартного белкового изолята кислоосажденный белок отделяют от остаточного водного экстракта, называемого сывороткой, и затем промывают или обрабатывают для удаления остаточных привкусов. Затем отмытый изолят обезвоживают до образования сухого изолята, в котором содержание белка по отношению к сухому остатку превышает 90%. Обильная промывка часто используется для удаления нежелательных запахов, которые присущи различным "фенольным" соединениям в соевых бобах, как и изофлавонам.

В настоящем изобретении промывка осажденного белкового материала либо полностью исключается, либо минимизируется для того, чтобы существенного уменьшить удаление изофлавонов из белкового осадка, посредством чего и обеспечивается получение обогащенного изофлавоном изолята. Например, исключением или минимизацией отмывки осажденного белкового материала, выход изофлавонов в сухом белковом изоляте может быть увеличен более чем вдвое. Поэтому отмывка кислоосажденного белка водой либо полностью исключается, либо ограничивается единственной отмывкой, при которой весовое соотношение воды к исходному белковому материалу составляет от 2:1 до 4:1. Эта недостаточная промывка кислоосажденного творожистого осадка обеспечивает изолят, обогащенный требуемыми изофлавонами. Кислоосажденный белок затем обезвоживают комбинированием центрифугирования или концентрирования и высушивания удобным способом. Настоящее изобретение не может быть ограничено стадией обезвоживания, хотя для получения сухого изолята предпочтительнее использовать стандартную технику высушивания (например, распыляющее высушивание). Белковый изолят, полученный описанным выше способом, обеспечивает изоляты, которые по сравнению со стандартными изолятами содержат повышенное количество изофлавонов, что проиллюстрировано следующими специальными примерами.

Пример 1.

Для того, чтобы пояснить увеличение уровня содержания изофлавонов в белковых изолятах, полученных согласно настоящему изобретению, сперва на примере стандартного белкового изолята и способа его получения был полностью показан выход требуемых изофлавонов в стандартном процессе.

100 фунтов (45,36 кг) обезжиренных соевых хлопьев были помещены в экстрактор и экстрагированы 1000 фунтами (453,6 кг) воды. Это обеспечивало весовое соотношение воды к хлопьям 10:1. Экстракцию проводили водой, нагретой до температуры 90^oF (32,2^oC), в которую было добавлено необходимое для установления pH 9,7 количество гидроксида кальция. Хлопья отделяли от экстракта и реэкстрагировали с помощью 600 фунтов (272,2 кг) водного экстрагирующего раствора, имеющего pH 9,7 и температуру 90^oF (32,2^oC). Вторая стадия экстракции проводилась при весовом соотношении воды к хлопьям 6:1. Хлопья удаляли центрифугированием, первый и второй экстракты объединяли и с помощью соляной кислоты подводили pH до 4,5. Кислотно-осажденный творожистый осадок отделяли от сыворотки центрифугированием и затем отмывали водой, весовое количество которой семикратно превышало вес исходного материала (для обеспечения белкового изолята). Был проведен полный анализ творожистого осадка, сыворотки, использованных хлопьев на содержание генистина (включая генистин, генистеин и 6OAC-генистин) и дайдзин (включая дайдзин, дайдзеин и 6OAC-дайдзин). Анализ этих изофлавонов проводился согласно методике, описанной ниже.

Методика измерения суммарного генистина и дайдзина.

1. Взвешивали 0,25 г соевого продукта и добавляли к 20 мл экстрагирующего раствора, содержащего 80 частей метилового спирта, 10 частей воды и 10 частей 3 н. соляной кислоты.

2. Дополнительно приливали 20 мл 4 н. соляной кислоты и смесь перемешивали в течение 10 минут.

3. Раствор кипятили в колбе с обратным холодильником в течение 1 часа.

4. Раствор охлаждали и фильтровали на фильтровальной бумаге Whatman # 4.

5. Отбирали аликвоту (10 мл), к которой добавляли 10 мл миллипоровой воды и 0,4 мл уксусной кислоты, и перемешивали.

6. Каждую пробу инжектировали в колонку жидкостной хроматографии высокого разрешения и измеряли уровень изофлавонов по поглощению в ультрафиолетовой области.

Результаты анализа творожистого осадка, соевой сыворотки и исходного материала на наличие указанных выше изофлавонов представлены в табл. 1. Результаты также представлены в виде процента выхода указанных изофлавонов от уровня, содержащегося в исходном материале.

Приведенный пример наглядно иллюстрирует, что требуемые изофлавоны в стандартном процессе больше всего накапливаются в сыворотке, в результате чего наблюдается низкий уровень изофлавонов в большинстве коммерческих белковых изолятов.

Пример 2
100 фунтов (45,36 кг) обезжиренных соевых хлопьев были помещены в экстрактор и экстрагированы методом непрерывной двухстадийной противоточной экстракции с помощью 800 фунтов (363 кг) воды, нагретой до температуры 90^o F (32,2^oC), к которой для установления pH 9,7 было добавлено необходимое количество гидроксида кальция. Весовое отношение воды к хлопьям составляло 8: 1. Хлопья были удалены центрифугированием и для того, чтобы осадить белок, pH водного экстракта было подведено до 4,5. Затем осажденный белок был отделен от сыворотки центрифугированием. Стадия отмывки полученного творожистого осадка была исключена. Анализ творожистого осадка, сыворотки, использованных соевых хлопьев и исходного материала был проведен также, как описано в примере 1. Полученные результаты представлены в табл. 2.

Полученные результаты, описанные выше, показывают, что уровень требуемых изофлавонов в творожистом осадке существенно увеличился по сравнению с примером 1, посредством чего обеспечивалось получение обогащенного изофлавоном соевого белкового изолята.

Пример 3.

Осажденный кислотой творожистый осадок был получен, как описано в примере 2, но для исключения последующего кислотного осаждения творожистого осадка его промывали водой комнатной температуры. Вес воды, используемой для промывки, вдвое превышал вес хлопьев. Анализ проводили как описано в примере 1. Выход изофлавонов представлен в табл. 3.

Полученные результаты показывают, что по сравнению с данными примера 1 в творожистом осадке наблюдается существенное увеличение содержания изофлавонов, за счет чего достигается получение обогащенного изофлавонами соевого белкового изолята.

Пример 4.

Осажденный кислотой творожистый осадок был получен как описано в примере 2. Для исключения дальнейшего кислотного осаждения осадок был промыт водой комнатной температуры, вес которой в 4 раза превышал вес хлопьев. Выход изофлавонов, полученный согласно данной методике, представлен в табл. 4.

Как показывают результаты, по сравнению с примером 1 наблюдается существенное увеличение содержания изофлавонов в творожистом осадке, однако содержание изофлавонов в нем ниже, чем в примере 3.

Пример 5.

100 фунтов (45,36 кг) обезжиренных соевых хлопьев были экстрагированы с помощью 800 г воды при 90^oF (32,2^oC) pH смеси составляло 6,7. Смесь перемешивали в течение 5 минут и для удаления использованных хлопьев центрифугировали. С помощью соляной кислоты pH экстракта подводили до 4,5 и центрифугированием в течение 10 минут отделяли творожистый осадок от соевой сыворотки. Отмывку осадка исключали. Содержание изофлавонов в различных фракциях определяли как описано в примере 1. Результаты представлены в табл. 5.

Можно отметить, что по сравнению с примером 1 уровень содержания изофлавонов в творожистом осадке особенно увеличен.

Пример 6.

100 г обезжиренных соевых бобов были экстрагированы с помощью 800 г воды при температуре 90^oF (32,2^oC). Добавлением гидроокиси кальция подводили pH до 9,7. Смесь перемешивали в течение 15 минут и затем центрифугировали в течение 5 минут для отделения экстракта. Использованный порошок затем повторно экстрагировали путем перемешивания его с 300 г воды в течение 5 минут. Второй экстракт отделяли от использованных хлопьев центрифугированием в течение 5 минут. Первый и второй водные экстракты объединяли и доводили pH до 4,5 (до изоэлектрической точки белка). Кислотно-осажденный творожистый осадок отделяли центрифугированием. Содержание изофлавонов в творожистом осадке, сыворотке и использованных хлопьях измеряли как описано в примере 1. Содержание изофлавонов представлено в табл. 6.

Для специалиста в данной области будут очевидны различные изменения и модификации изобретения, входящие в объем патентной формулы.

Изобретение относится к медицине и касается способа получения обогащенного изофлавонами растительного белкового изолята, пригодного для приема в пищу. Задача изобретения состоит в разработке способа получения растительного белкового соевого изолята, содержащего изофлавоны, которые могут ингибировать рост раковых клеток человека. Сущность изобретения заключается в экстракции соевого белкового материала при рН выше изоэлектрической точки соевого материала установлением рН водного экстракта на уровне изоэлектрической точки соевого белкового материала для осаждения белкового материала, отделении, осажденного белкового изолята, при этом изолят получают без его промывки, или с его промывкой водой, взятой в весовом количестве, не превышающем вес белкового материала в четыре раза. Изобретение обеспечивает получение белкового соевого изолята, обогащенного изофлавонами. 7 з. п. ф-лы, 6 табл.

1. Способ получения обогащенного изофлавонами изолята соевого белка, предусматривающий экстракцию содержащего изофлавоны соевого белкового материала водным экстрагентом, имеющим pH выше изоэлектрической точки материала, с получением водного экстракта белка и изофлавонов, установление pH водного экстракта на уровне около изоэлектрической точки белкового материала для осаждения белкового материала, отделение осажденного белкового материала с получением указанного изолята, отличающийся тем, что изолят получают или непосредственно их осажденного белкового материала без промывки последнего, или после промывки осажденного белкового материала водой, взятой в весовом количестве, не превышающем вес белкового материала в четыре раза. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракцию проводят при pH 6 - 10. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что экстракцию проводят при pH 6,7 - 9,7. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что pH экстракта устанавливают равным 4,4 - 4,6. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что экстракцию соевого белкового материала проводят указанным экстрагирующим раствором при весовом отношении экстракта к материалу от 5 : 1 до 12 : 1. 6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что экстракция соевого белкового материала предусматривает двойную экстракцию, так чтобы комбинированное весовое отношение экстрагирующего раствора после обеих экстракций к материалу не превышало суммарного весового соотношения от 11 : 1 до 14 : 1. 7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что осажденный белковый материал промывают водой, взятой в весовом количестве менее двухкратного веса белкового материала. 8. Способ по п.1, отличающийся тем, что включает стадию обезвоживания обогащенного изофлавонами изолята.